Name: double direct injection of blood into the cisterna magna as a model of subarachnoid hemorrhage
Uploaded: 2020-08-30T14:00:00
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我们感谢PRIMACEN平台（法国诺曼底鲁昂大学）的成像设备，感谢阿诺德·阿拉博先生、朱莉·莫科特尔夫人和马丁·杜布瓦夫人的动物住房和护理。我们感谢塞莱斯特·尼古拉夫人为协议的录像提供她的声音。这项工作得到了塞纳里·诺曼底成熟计划、FRM、诺曼底鲁昂大学和因塞姆赞助。诺曼底地区和欧盟（3R项目）。欧洲与欧洲区域发展基金（ERDF）一起参与诺曼底。

所有程序都是根据法国道德委员会和欧洲议会第2010/63/EU号指令和用于科学目的的动物保护理事会的准则，在H.Castel的监督下进行的。该项目得到了当地CENOMEXA和国家动物研究和测试伦理委员会的批准。雄性 C57Bl/6J Rj 小鼠（Janvier），年龄为 8 至 12 周，在受控标准环境条件下安置：22 °C ± 1 °C，12 小时/12 小时光/暗循环，水和食物可用广告。
1. SAH 手术的设置和注射准备</stro...

尽管过去二十年来，SAH领域的研究强度加大，以及血管内和药理治疗方案等治疗策略的发展不断增加，但住院第一周的死亡率仍然很高，在24、25,年的6个月中达到约50%。. 这种目前的临床前模型，每天双注射同源动脉血到西斯特纳磁石已被确认为其有效性和与低死亡率的关系。事实上，在SAH啮齿动物模型中， 已报告死亡率范围很广：0-16%死?...

苏巴拉奇内出血（SAH）占所有中风病例的5%，是一种相对常见的病理学，每年每10万人发生7.2至9例患者，死亡率为20%-60%，取决于研究1、2、3。,31,在急性期，死亡率归因于出血、再出血、脑血管痉血症（CVS）和/或医疗并发症的严重程度。在幸存者中，早期脑损伤（EBI）与出血的颅骨延长和颅内压力的突然增加有关，这可能导致原发性脑缺血5和直接死亡约10%-15%的病例6。SAH的初始"急性"阶段后，预后取决于"继发性"或延迟性脑缺血（DCI）的发生，近40%的患者通过脑计算机断层扫描检测，在磁共振成像（MRI）7、8,后的患者中检测到高达80%。除了大多数SAH患者动脉瘤破裂后4至21天发生的CVS外，DCI9可能由多因素扩散性脑损伤继发性到微膜形成、脑灌注减少、神经炎和皮质扩散抑郁症（CSD）10、11、12、13,11,12,等引起。这影响30%的SAH幸存者，并影响认知功能，包括视觉记忆，语言记忆，反应时间，执行，视觉空间和语言功能14损害日常生活15。目前的标准疗法，以防止CVS和/或SAH患者的认知结果差是基于Ca 2+信号和血管收缩的阻塞，使用Ca 2+通道抑制剂作为尼莫地平。然而，最近针对血管收缩的临床试验显示，患者的神经学结果与CVS16的预防分离，表明在SAH长期后果中涉及更复杂的病理生理机制。因此，医学上需要更好地了解伴随 SAH 的病理事件的数量，并开发有效和标准化的动物模型来测试原始治疗干预措施。
在临床前动物模型中，对人中SAH负有主要责任的颅内动脉瘤的破裂可能难以模仿。目前，动脉瘤破裂和SAH情况可以初步测试中脑动脉穿孔负责CVS和敏感运动功能障碍的小鼠17，18。17,由于该模型中对出血的发作和血液扩散缺乏任何可能的控制，啮齿动物已经开发出其他方法，以生成SAH模型，而不会血管内破裂。更确切地说，它们包括通过单注射或双注射到磁石cisterna 19或一次注射到前基亚体蓄水池20中，将动脉血直接注入到亚巴纳空间。这些小鼠模型没有血管内破裂的主要优点是有可能重复掌握外科手术和注射血液样本的质量和数量。与模型的血管内穿孔，该模型的另一个优势是保护动物的一般福祉。事实上，这种手术的侵入性较小，技术上也不像产生卡罗蒂墙破裂所需的那样具有挑战性。在最后的模型中，动物必须插管和机械通风，而单丝插入外部胡萝卜动脉，并先进的内部胡萝卜动脉。这可能导致暂时性缺血，由于血管阻塞的电线路径。因此，与血管穿孔模型相比，与手术相关的共病（死亡状态、重要疼痛和死亡）在双注射模型中不太重要。除了是一个更一致的SAH，双直注射法在研究和测试中符合动物福利（麻醉下的时间减少，手术中组织中断和痛苦造成的疼痛），并导致用于协议研究和人员培训的动物总数最少。
此外，这允许对转基因小鼠实施相同的协议，从而对SAH的病理理解得到优化，并有可能对潜在的治疗化合物进行对比测试。在这里，我们提出了一个标准化的小鼠模型的亚巴奇诺德出血（SAH）通过每天双连续注射自体动脉血到西斯特纳磁石在6-8周大的雄性C57Bl/6J小鼠。与血管穿孔模型相比，该模型的主要优点是控制出血量，在不急剧增加颅内压力的情况下加强出血事件。最近，在小鼠的实验和生理问题上，对双直接注射血液进行了很好描述。事实上，我们最近展示了大脑动脉（巴西拉（BA），中间（MCA）和前（ACA）脑动脉，脑血管纤维蛋白沉积和细胞凋亡从第3天（D3）到10（D10），前血管脑脊液的循环缺陷伴随着改变的敏感运动和认知功能在小鼠，10天后SAH在这个模型22。因此，它使该模型掌握，验证和特征的短期和长期事件后SAH。它应该非常适合前瞻性识别新靶点和研究针对SAH相关并发症的有效和高效的治疗策略。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">absorbable hemostat</td>
			<td style="width:201px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">Surgicel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">absorbable suturing thread</td>
			<td style="width:201px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">Vicryl 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">auto-regulated electric blanket</td>
			<td style="width:201px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:161px;">50-7087-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">bluetack for capillary fixation</td>
			<td style="width:201px;">UHU</td>
			<td style="width:161px;">Patafix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">electronic balance</td>
			<td style="width:201px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:161px;">MXX-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">glass capillaries</td>
			<td style="width:201px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:161px;">GC150F-15</td>
			<td style="width:167px;">inner diameter 0.86 mm 
			outer diameter 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">isoflurane vaporizer</td>
			<td style="width:201px;">Phymep</td>
			<td style="width:161px;">V100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:201px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:161px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">needle 26 G</td>
			<td style="width:201px;">BD microbalance</td>
			<td style="width:161px;">300300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">non absorbable suturing thread</td>
			<td style="width:201px;">Peters surgical</td>
			<td style="width:161px;">Filapeau 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">stereotaxic frame</td>
			<td style="width:201px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:161px;">Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">surgical equipment</td>
			<td style="width:201px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:161px;">clamp, microscissors, thin scissors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">syringe 20 mL TERUMO</td>
			<td style="width:201px;">Thermofisher</td>
			<td>11866071</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double direct injection of blood into the cisterna magna as a model of subarachnoid hemorrhage

在中风中，继脑动脉动脉瘤破裂的亚拉氏出血（SAH）占5-9%，但占总中风相关死亡率的30%左右，在神经结果方面具有重要的发病率。延迟脑血管痉血 （CVS） 可能最常见的发生与延迟脑缺血有关。SAH的不同动物模型正在被使用，包括血管内穿孔和直接注射血液到西斯特纳磁石，甚至前三体蓄水池，每个都表现出明显的优缺点。本文通过双直接注射确定量的自体全血进入西斯特纳磁石，提出了SAH的标准化小鼠模型。简单地说，小鼠被称重，然后通过吸入异氟兰麻醉。然后，动物被放置在加热毯子的倾斜位置，保持37°C的直肠温度，并放置在一个立体教学框架与宫颈弯曲约30°。一旦到位，一个拉长的玻璃微管的尖端充满了同源动脉血从另一个相同年龄和性别的小鼠动脉（C57Bl/6J）的同位素动脉通过微气器与亚特兰托-腹膜接触的直角。然后将60μL的血液注射到西斯特纳磁石中，然后动物向下倾斜2分钟。第二次输液30μL的血液到西斯特纳磁石后24小时进行第一次。每天对每只动物进行个体随从（仔细评估体重和健康）。这个程序允许血液的可预测和高度可重复的分布，可能伴随着颅内压力升高，可以通过人工脑脊髓液（CSF）的等效注射来模拟，并代表SAH诱导低死亡率的急性至轻度模型。

实验时间表、程序、随从和死亡率 图 1A 和图 1B 通过双针注射血液来总结 SAH 模型协议。简言之，在SAH诱导（D-1）的第一天，从同源小鼠中抽出的60μL血液或60μL的人工脑脊液（aCSF）分别注射到SAH或假条件下的西斯特纳磁石中。第二天（D0），从同源小鼠中抽出的30μL或30μL的ACSF分别注射到SAH或Sham条件下的西斯特纳磁石中。手术后24小时，...

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Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

我们在该协议中描述了一个标准化的亚巴纳内出血 （SAH） 小鼠模型，通过双注射自体全血到 cisterna 磁石。双注射程序高度标准化，代表了在死亡率方面相对安全性的SAH中急性模型。

双直接注射血液到西斯特纳麦格作为苏巴拉奇内德出血的模型

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

本视频的总体目标是解释将血液双直接注射到西斯特纳磁石中作为亚布拉奇内德出血模型的协议。亚布拉奇出血的生理学通常是由于动脉瘤破裂。我们首先将血液外在大脑和覆盖大脑的组织之间的隔间中。这个隔间是亚气室空间。苏巴奇诺德出血占所有罢工病例的7%。在基于人群的研究中，死亡率在30%到50%之间，而亚布拉奇出血幸存者通常经历认知后遗症，如记忆缺陷、焦虑症或情绪障碍。不良结果高流行率的主要原因是脑缺血。研究使大脑动脉血管收缩中缺血的发生之间有关，这种血症被命名为显微血管痉血症，在第一次腹胀事件后的第四天至第十五天之间，大多数患者都可以检测到这种血症。由于目前治疗方案效率低下，显然医学上需要更好地了解病理事件。伴随的亚布拉奇出血和新的治疗靶点应进行测试，但这需要多样化和标准化的动物模型。颅间动脉瘤的破裂，主要是造成人类亚布拉奇内出血的原因，很可能很难做临床前和人类模型。在动物中，主要困难在于控制出血和血液分配的发生率，但最近的研究侧重于开发更红细胞出血模型的模型。这里代表一个标准化的小鼠模型，连续两次注射自体动脉血的两天到西斯特纳磁石。该模型的主要优点是可重复掌握非侵入性外科手术，调整注射血液的质量和数量，在不急剧增加颅压的情况下加强出血事件。在手术开始前，你必须使用微管拉拔器再放大量的玻璃毛细管。注射移液器内径为0.86毫米，外径为0.5毫米。如书面协议所示，为假情况准备人工脑脊髓液。你必须意识到这种用0.22微米过滤装置的含氧人工脑脊髓液。我们亚巴脑出血模型的第一步是沿气管隔离胡萝卜动脉，以及从胡萝卜动脉穿刺中收集最大血液。通过异氟兰麻醉后，通过夹紧一两个后肢来检查反射不足，以便设置实验程序。使用 26 表针使用 Eprin 对一毫米注射器进行编码。这将防止血液凝固在下一步。使用电子天平精确称重每只鼠标。在目前的研究中，小鼠的体重在手术前的20至25克范围内。如前所述，手术小鼠的诱导麻醉，然后通过合适的电剪器剃掉颈部和每只耳朵之间的空间。检查鼠标正在睡觉，鼠标头被堵住了。在下背部用26针注射100微升丁丙诺啡，每公斤0.1毫克，以避免觉醒后疼痛。使用保护性液体凝胶防止干眼，并使用自动调节电热毯保持 37 度的电管内温度。在用防腐剂溶液处理剃光区域之前，所有接触组织的仪器都经过消毒并无菌处理。第一天，在后颈上切一个一厘米长的切口，然后沿着中线分离肌肉，进入西斯特纳磁石。用薄剪刀切开空玻璃移液器的尖端。然后适应连接到柔性硅连接器的注射器。然后，使用精密微移液吸入玻璃移液器，将60微升血液或人工脑脊髓液转移到0.5毫升管中，将60微升的血液用于亚布拉奇出血状况，或将60微升的人工脑脊髓液转移到假象中。对于注射，使用（例如，我们的环或一个环）将移液器插入立体定向框架上，然后缓慢地接近移液器尖端，然后使用 cisterna 磁格器在接口端向膜。使用立体定向框架的微向器，通过亚特兰托-腹膜缓慢地将移液器尖端插入 cisterna 磁石中。将移液器连接到以前填充的注射器，准备进行压力感应。以每分钟10微升左右的低利率按压力注射，以避免急性颅内高血压。注射期间，密切监测呼吸速率和直肠温度。在注射结束时，使用微操纵器小心地脱下移液器，并在取款过程中注意没有泄漏。实现平衡，并执行两个缝合与编织不可吸收的缝合线。手术后，立即分离并定位小鼠在下降的十二分，并在恢复期间用活毯覆盖在打开的盒子里。24小时后，再次诱导麻醉，将鼠标作为前一天安装在立体定向框架上，并小心地用微剪刀取出缝合线。在亚特兰托-腹膜无菌之前，通过用棉棒涂抹在剃光区域和无菌溶液上进行准备。如前一天一样，以较低的速率注射30微升的血液或人工脑脊髓液。如前所述，监测呼吸速率和直肠温度。注射结束时，小心地脱下移液器，控制抽血过程中无血漏。实现平衡，用编织的可吸收缝合线进行两个缝合。从手术后的第一天到牺牲日，体重应每天评估为一般健康灵敏的指标。与假动物相比，表明亚布拉奇内出血的体重显著减少，表明在亚布拉奇内出血后，有一个持久的活动恢复过程和长期的病理事件。为什么死亡率不是虚假的？在第七天，在亚布拉奇出血条件下，死亡率接近30%，大多数动物在手术后一天或第四天死亡。在人道的终点中，显著减肥优于初始重量的15%。驼背"的姿势，缓慢的运动，伤口，异常的发声或严重的侵略也是动物正在遭受的迹象。如果出现这些迹象或迹象的组合，在动物出现后数小时内加强对动物的跟踪。如果动物的病情在48小时内恶化或没有改善，将被视为达到无法忍受的痛苦水平，并进行杀戮。在手术第一天的这个例子中，可以从样本大脑观察到，血块沿着威利斯多边形的大动脉在亚布拉奇出血主体。在手术后的第五天和牺牲前，血管间印度墨水注射允许检测大脑血管痉素对应大小脑动脉的血管收缩，用赤氧林和 eosin 的脑片着色允许测量脑血管痉血。在这里，如此照片显微图所示，您可以观察到罗勒动脉的血管膜。在这种将血液直接注入到脑血管的模型中，我们最近展示了大脑动脉的脑血管痉附体、脑血管纤维沉积和细胞凋亡，并伴有小鼠感觉、运动和认知功能的改变。因此，它使该模型验证和特征的短期和长期事件，后亚布拉奇内出血。它应该非常适合前瞻性识别新靶点和研究针对亚布拉奇诺类出血相关并发症的高效治疗策略。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging MRI

蛛网膜下腔出血结合磁共振成像（MRI）的血管内穿孔模型

The endovascular filament perforation model to mimic subarachnoid hemorrhage (SAH) is a commonly used model - however, the technique can cause a high ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

立体定位手术方法 ，通过 大水池在小鼠中显微注射尾部脑干和上颈椎脊髓

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...