Name: double direct injection of blood into the cisterna magna as a model of subarachnoid hemorrhage
Uploaded: 2020-08-30T14:00:00
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私たちは、イメージング機器のためのPRIMACENプラットフォーム(ノルマンディールーアン大学、フランス)とアルノー・アラボ氏、ジュリー・モーコテル夫人、マーティン・デュボア夫人に動物の住宅とケアに感謝します。私たちは、プロトコルのビデオ撮影に彼女の声を貸してくれたセレステ・ニコラ夫人に感謝します。この作品は、Seinariノルマンディー成熟プログラム、FRMのイージスの下でフォンダシオンAVC、ノルマンディールーアン大学とインセルムによってサポートされました。ノルマンディー地域と欧州連合(3Rプロジェクト)ヨーロッパは欧州地域開発基金(ERDF)でノルマンディーに関わる。

すべての手続きは、フランスの倫理委員会と欧州議会指令2010/63/EUおよび科学的目的で使用される動物保護評議会のガイドラインに従って、H.カステルの監督の下で行われました。このプロジェクトは、地元のCENOMEXAと動物の研究とテストに関する国家倫理委員会によって承認されました。8~12週齢の雄C57Bl/6J RJマウス(Janvier)は、22°C±1°C、12時間/12時間の明暗サイクル、および水および食物のア?...

SAHの分野での研究の強度と、過去20年間で血管内および薬理学的治療オプションなどの治療戦略の開発が増加しているにもかかわらず、入院の最初の週以内に死亡率は高く、次の6ヶ月間に約50%に達する24,25。 24,25この現在の前臨床モデルは、シスタンナマグナへの相同動脈血の毎日の二重注入によって、その有効性と低死亡率との関連?...

くも膜下出血(SAH)は、脳卒中症例の最大5%を占め、100,000人当たり年間7.2〜9人の患者の罹患率を有する比較的一般的な病理を構成し、研究11、2、32,3に応じて死亡率は20%〜60%である。急性期では、死亡率は出血、再出血、脳血管れん縮(CVS)および/または医学的合併症の重症度に起因する。生存者において、早期脳損傷(EBI)は、出血の虚脈拡張および頭蓋内圧の急激な増加に関連しており、これは第1次脳虚血5および症例の約10%〜15%で即時死をもたらす可能性がある6。SAHの初期の「急性」段階の後、予後は、脳コンピュータ断層撮影によって患者のほぼ40%で検出された「二次的」または遅延脳虚血(DCI)の発生に依存し、磁気共鳴画像(MRI)7、8後の患者の最大80%において7,。大多数のSAH患者において動脈瘤破裂後4~21日の間に起こるCVSに加えて、DCI9は、多因子性びまん性脳病変から微小血栓形成、脳灌流の減少、神経炎症、および皮質広がりん小病(CSD)10、11、12、13に起因する可能性がある。10,11,12,13これは、SAH生存者の30%に影響を及ぼし、視覚記憶、言語記憶、反応時間、およびエグゼクティブ、視空間および言語機能14を含む認知機能に影響を与える15。SAH患者のCVSおよび/または悪い認知転帰を防ぐための現在の標準的な治療法は、Ca2+チャネル阻害剤をニモジピンとして使用することにより、Ca2+シグナル伝達および血管収縮の閉塞に基づいている。しかし、血管収縮を標的とした最近の臨床試験では、患者の神経学的転帰とCVS16の予防との間の解離が明らかになっており、SAH長期の結果に関与するより複雑な病態生理学的メカニズムが示唆された。したがって、SAHに付随する病理学的事象の数と、元の治療介入をテストするための有効かつ標準化された動物モデルの開発をより深く理解する医学的ニーズがある。
ヒトにおけるSAHの大部分を担う頭蓋内動脈瘤の破裂は、前臨床動物モデルで模倣することは困難である可能性が高い。現在、動脈瘤破裂及びSAH状況は、マウス17,18,18におけるCVS及び感作運動障害を担う中大脳動脈(血管内穿刺モデル)の穿穿率によって暫定的に試験することができる。このモデルでは、出血の発症と血液の拡散に対する制御が可能ないため、血管内破裂のないSAHモデルを生成する他の方法がげっ歯類で開発されている。より正確には、それらは、マグナシスターナ19で単一または二重注射を介して、またはプレキアシムシテルン20への単一の注射を介して、くも膜下腔への動脈血の直接投与からなる。血管内破裂のないこれらのマウスモデルの主な利点は、外科的処置および注入された血液サンプルの質および量を再現的に習得する可能性である。特に血管内穿穿によるモデルに対するこのモデルの別の利点は、動物の一般的な幸福の保存である。実際のところ、この手術は頸動脈壁破裂を発生させるために必要なものよりも侵襲性が低く、技術的に難解ではありません。この最後のモデルでは、動物は挿管され、機械的に換気され、モノフィラメントは外的頸動脈に挿入され、内部頸動脈に進む必要があります。これは、ワイヤー経路による血管閉塞による一過性虚血を引き起こす可能性が高い。その結果、手術に伴う共罹患率(モリバンド状態、重要な痛みおよび死)は、血管内穿穿率モデルと比較して二重注入モデルにおいてあまり重要ではない。より一貫したSAHであることに加えて、二重直接注射法は、研究および試験における動物福祉(麻酔下の時間の短縮、手術および苦痛における組織の混乱による痛み)に準拠し、プロトコル研究および人事訓練に使用される動物の最小総数につながります。
さらに、トランスジェニックマウスに同じプロトコルを実装することができ、SAHの最適な病理学的理解と潜在的な治療化合物の比較試験の可能性につながります。ここでは、6-8週齢の雄C57Bl/6Jマウスにおいて自家動脈血をシスターナマグナに1日2回連続で連続して注射することにより、くも膜下出血(SAH)の標準化されたマウスモデルを提示する。このモデルの主な利点は、血管内穿穿率モデルと比較した出血量の制御と、頭蓋内圧21の急激な増加を伴わない出血事象の補強である。最近、水槽マグナへの血液の二重直接注入は、マウスの実験的および生理的病理学的問題についてよく説明されている。実際、我々は最近、大脳動脈(バジラー(BA)、中期(MCA)および前脳動脈(ACA)脳動脈、脳血管フィブリン沈着および細胞アポトーシス3日目(D3)から10(D10)、神経血管脳脊髄液の循環欠陥を伴う神経脊柱運動および機能の変化を伴うSAHモデル22日で実証した。したがって、このモデルは、SAH後の短期的および長期的なイベントのために、マスター、検証、および特徴付けになります。これは、新しい標的の将来の同定のために、およびSAH関連合併症に対する強力かつ効率的な治療戦略に関する研究に理想的に適しているべきである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">absorbable hemostat</td>
			<td style="width:201px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">Surgicel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">absorbable suturing thread</td>
			<td style="width:201px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">Vicryl 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">auto-regulated electric blanket</td>
			<td style="width:201px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:161px;">50-7087-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">bluetack for capillary fixation</td>
			<td style="width:201px;">UHU</td>
			<td style="width:161px;">Patafix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">electronic balance</td>
			<td style="width:201px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:161px;">MXX-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">glass capillaries</td>
			<td style="width:201px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:161px;">GC150F-15</td>
			<td style="width:167px;">inner diameter 0.86 mm 
			outer diameter 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">isoflurane vaporizer</td>
			<td style="width:201px;">Phymep</td>
			<td style="width:161px;">V100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:201px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:161px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">needle 26 G</td>
			<td style="width:201px;">BD microbalance</td>
			<td style="width:161px;">300300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">non absorbable suturing thread</td>
			<td style="width:201px;">Peters surgical</td>
			<td style="width:161px;">Filapeau 4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">stereotaxic frame</td>
			<td style="width:201px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:161px;">Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">surgical equipment</td>
			<td style="width:201px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:161px;">clamp, microscissors, thin scissors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">syringe 20 mL TERUMO</td>
			<td style="width:201px;">Thermofisher</td>
			<td>11866071</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double direct injection of blood into the cisterna magna as a model of subarachnoid hemorrhage

脳卒中の中で、脳動脈瘤の破裂に連続するくも膜下出血(SAH)は5〜9%を表すが、神経学的結果の点で重要な罹患率を有する全脳卒中関連死亡率の約30%を占めている。遅延脳血管れん縮 (CVS) 遅延脳虚血と関連して最も頻繁に発生する可能性があります。SAHの異なる動物モデルは現在、血管内穿穿および水槽マグナまたは気前の水槽への血液の直接注入を含む使用されており、それぞれが明確な長所と短所を示している。本稿では、システルナマグナに全血の自家の決定された量の二重直接注入によるSAHの標準化されたマウスモデルが提示される。簡単に言えば、マウスを計量し、イオブルラン吸入によって麻酔した。次いで、動物を、37°Cの直腸温度を維持する加熱毛布の上にリクライニング位置に置き、約30°の頚部曲げを有する定位フレームに配置した。一度所定の位置に、同じ年齢と性別の別のマウスの頸動脈から採取した相同動脈血で満たされた細長いガラスマイクロピペットの先端(C57Bl/6J)は、マイクロマニピュレーターによってアラント後頭膜と接触して直角に配置された。その後、60μLの血液を水槽マグナに注入し、続いて動物を30°下方傾きして2分間注入した。30μLの血液を水槽マグナに2回目の輸液を、最初の1から24時間行った。各動物の個々のフォローアップは毎日行われます(体重と幸福の慎重な評価)。この手順は、人工脳脊髄液(CSF)の同等の注射によって模倣することができる頭蓋内圧上昇を伴う可能性が高い血液の予測可能で高度に再現性の高い分布を可能にし、低死亡率を誘発するSAHの急性から軽度のモデルを表す。

実験タイムライン、手順、フォローアップ、死亡率 図1A および 図1B は、血液の二重インタシビサーナル注入によるSAHモデルプロトコルを要約する。簡単に言えば、SAH誘導(D-1)の初日に、相同マウスから取り出された60μLの血液または60μLの人工脳脊髄液(aCSF)をそれぞれSAHまたはシャム状態でシスタンナマグナに注入した。翌日(D0)、?...

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Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

我々は、このプロトコルにおいて、システルナマグナへの自家全血の二重注入による標準化されたくも膜下出血(SAH)マウスモデルを説明した。二重注入手順の高度な標準化は、死亡率に関する相対的な安全性を有するSAHの中急性モデルを表す。

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

このビデオの全体的な目標は、くも膜下出血のモデルとして、水槽に血液を二重直接注入するプロトコルを説明することです。くも膜下出血の生理は、しばしば動脈瘤の破裂によるものです。そして、まず、脳と脳を覆う組織との間のコンパートメントへの血液の飛び込み。このコンパートメントはくも膜下空間です。くも膜下出血は、すべてのストライキ症例の最大7%を占める。死亡率は、人口ベースの研究で30〜50%の間で変化し、くも膜下出血生存者は、一般的に記憶障害、無力症、または気分障害として認知後遺症を経験する。悪い結果の高い有病率の主な原因は、脳虚血とは何かである。研究は、大脳動脈の血管収縮における虚血の発生との間にリンクを作った, 最初の膨満感イベントの後の4番目と15日目の間に大多数の患者で検出することができる顕微鏡血管れん縮と命名.現在の治療オプションの非効率性のために、病理学的事象のより良い理解のための明らかな医学的必要性がある。それに伴うくも膜下出血と新しい治療目標をテストする必要がありますが、これには様々で標準化された動物モデルが必要です。頭蓋内動脈瘤の破裂は、主にヒトのくも膜下出血の原因であり、前臨床およびヒトモデルを作ることは困難である可能性が高い。動物では、主な困難は出血および血の分布の制御発生率に存在するが、最近の研究はくも膜下出血のモデルのより多くの退容モデルの開発に焦点を当てている。ここでは、シツナマグナに私たちの2日間の自家動脈血の2つの連続した注射の標準化されたマウスモデルを表しています。このモデルの主な利点は、再現的に非侵襲的な外科的処置を習得し、注入された血液の質と量を適応させ、頭蓋内圧を大幅に増加させることなく出血事象を補強することです。手術の開始前に、マイクロピペットプーラーを使用して、ガラス毛細血管の別の偉大な数を置く必要があります。注入ピペットは、0.86ミリメートルの内径と0.5ミリメートルの外径を示す必要があります。書かれた議定書に示されるように、偽の状態のために人工脳脊髄液を準備します。この酸素化された人工脳脊髄液は、0.22ミクロンのフィルター装置で実現する必要があります。くも膜下出血モデルの最初のステップは、気管に沿った頸動脈の分離と頸動脈穿刺からの血液の最大の収集で構成されています。イソフルランによる麻酔後、1つまたは2つの後肢をクランプして、実験手順の設定を可能にすることによって反射神経の欠如を確認する。26ゲージ針を使用して、エプリンで1ミリメートルの注射器をコード化します。これは、次のステップ中に血液凝固を防ぐことができます.電子バランスを使用して各マウスの重量を正確に測定します。現在の研究では、マウスは手術直前に20〜25グラムの範囲内の体重を有するであろう。先に説明したように、操作されたマウスの麻酔を誘発し、その後、適切な電気クリッパーによって各耳の間の首と空間を剃る。マウスが眠っていて、マウスの頭がよくブロックされていることを確認してください。目覚め後の痛みを避けるために、下背部に26ゲージ針を持つ1キロ当たり0.1ミリグラムでブプレノルフィンの皮下100マイクロリットルを注入する。保護液体ゲルを使用してドライアイを防止し、自動調整電動ブランケットを使用して37度の内帰温度を維持します。かき領域を防腐液で処理する前に、組織に触れるすべての器具が滅菌され、無菌で取り扱われました。初日は、後輪の長さ1センチの切開を切り、続いて中線に沿って筋肉を分離して、システルナマグナにアクセスします。薄いはさみで空のガラスピペットの先端を切ります。次に、柔軟なシリコンコネクタに接続されたシリンジに適応します。その後、精密マイクロピペットを使用して0.5ミリリットルチューブ内の血液または人工脳脊髄液の60マイクロリットルをガラスピペットに吸い込み、くも膜下出血状態のための血液60マイクロリットルまたは偽の状態のための人工脳脊髄液の60マイクロリットルを移す。注入の場合は、例えば、私たちのリングまたはaを使用して立体性フレームにピペットを挿入し、ゆっくりと水槽マグナとの界面で膜にピペット先端に近づく。定位フレームのマイクロマニピュレーターを使用して、アトラント後頭部膜を通してピペットチップをシスタンナマグナにゆっくりと挿入します。ピペットを以前充填されたシリンジに接続し、圧力誘導の準備をします。急性頭蓋内圧を避けるために、1分間に約10マイクロリットルの低速度で圧力で注入する。注射中は、呼吸数と直腸温度を注意深く監視します。注射の終了時に、マイクロマニピュレーターを使用してピペットを慎重に取り外し、引き出し時に漏れが生じなくて視覚的に注意してください。恒常性を達成し、編組非吸収性縫合糸で2つの縫合糸を行います。手術直後、マウスを減少デキュビタスに分離して位置づけ、回復の間、開いた箱に生存毛布で覆う。24時間後、再び麻酔を誘発し、前日のように立体フレームにマウスを取り付け、マイクロハサミで縫合糸を注意して取り外します。綿棒で剃った領域と無菌溶液に塗布することにより、アトラント後頭膜の無菌の前のように準備します。前日のように、30マイクロリットルの血液または人工脳脊髄液を低い速度で注入する。既に述べたように、呼吸数と直腸温度を監視します。注射の終了時に、慎重にピペットを取り外し、離脱時の血液漏出の欠如を制御する。ホメオスタシスを達成し、編組吸収性縫合糸で2つの縫合糸を行います。1日目のポスト手術から犠牲の日まで、体重は一般的な幸福のための敏感な指標として毎日評価されるべきです。それは、恥ずかしがった動物と比較して、くも膜下出血における有意な減少した体重増加を示し、長期にわたる活動回復プロセスおよび長期の病理学的事象、くも膜下出血後を示唆した。なぜ死亡率は恥ずかしい状態ではないのですか?死亡率はくも膜下出血状態で7日目に30%近く、ほとんどの動物は手術後1日または4日目に死亡する。人道的エンドポイントの中で、最初の体重の15%より優れた有意な体重減少が注目される。「腰を下ろした」姿勢、遅い動き、創傷、異常な発声または重大な攻撃性も、動物が苦しんでいる兆候です。これらの徴候または徴候の組み合わせのいずれかが現れた場合、動物の追跡はその出現に続く数時間以内に補強される。動物の状態が48時間以内に続くまたは改善しない時間に悪化した場合、耐え難い苦しみのレベルに達し、殺害が行われると考えられます。手術の1日目のこの例では、血液凝血を被験者のくも膜下出血のウィリスポリゴンの大動脈に沿って、サンプル脳から観察することができる。術後および犠牲の前の5日目に、血管間インキ注入は大小脳動脈の血管収縮に対応する巨視的な血管れん縮の検出を可能にし、ヘマトキシリンおよびエオシンによる脳スライスの着色は脳血管痙攣の測定を可能にする。ここでは、この写真顕微鏡写真に示すように、バジル動脈の血管れん縮として観察することができる。システルナマグナへの血液の直接注入のこのモデルでは、最近、マウスの感覚、運動、および認知機能の変化を伴う大脳動脈、脳血管線維沈着、および細胞アポトーシスの脳血管れん縮を実証しました。したがって、このモデルは、短期的かつ長期的なイベント、クモ膜下出血後のために検証され、特徴付けられる。新しい標的の将来の同定や、くも膜下出血に関連する合併症に対する効率的な治療戦略に関する研究に理想的に適しているべきである。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

マウスにおける自発脳内出血をモデル化する自家血注入

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

齧歯動物の槽注入カニューレ

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

自家血液の二重注射による巨大なポンチン出血

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

高周波経頭蓋二重超音波を用いたくも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管れん縮の解析

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

Pre-Chiasmatic, Single Injection of Autologous Blood to Induce Experimental Subarachnoid Hemorrhage in a Rat Model

ラットモデルにおける実験的くも膜下出血を誘発するための自己血の交叉前単回注射

Despite advances in treatment over the last decades, subarachnoid hemorrhage (SAH) continues to carry a high burden of morbidity and mortality, largely ...

Direct Cannula Implantation in the Cisterna Magna of Pigs

豚のシスターナマグナにおける直接カニューレ移植

The glymphatic system is a waste clearance system in the brain that relies on the flow of cerebrospinal fluid (CSF) in astrocyte-bound perivascular spaces ...

Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging (MRI)

Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging MRI

くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ

The endovascular filament perforation model to mimic subarachnoid hemorrhage (SAH) is a commonly used model - however, the technique can cause a high ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...