Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

الكتاب ممتنون جدا ل: الدكتور Waclaw Tworzydlo (قسم علم الأحياء التنموية والرففات مورفولوجيا، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة Jagiellonian) للمرافق التقنية في TEM; السيدة بياتا ساكوسكا (قسم الغدد الصماء، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة جاجيلونيان) للحصول على المساعدة التقنية؛ إلى قسم بيولوجيا الخلية والتصوير، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة جاجيلونيان، JEOL JEM 2100HT (JEOL، طوكيو، اليابان). وقد تم دعم هذا العمل بمنحة 2018/29/N/NZ9/00983 من المركز الوطني للعلوم في بولندا.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان في معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية في جامعة جاجيلونيان على الإجراءات التالية.
1. عزل مجمعات الزبيب البويضية
<ol><li>لجمع المواد لعزل بصيلات المبيض، والمبيضات المسامية المكوس من المذهبات قبل البوب (ما يقرب من 6-7 أشهر من العمر، وزنها 70 إلى 80 ?...

إن القدرة على الحفاظ على نمو في المختبر ليس فقط من البويضة ولكن أيضاً خلايا الكمولو المحيطة به وفي نفس الوقت دعم نضوجه ضرورية للغاية لتكنولوجيات الإنجاب المساعدة الناجحة وتعزيز فهم تفاعلات الخلايا الجسدية/البويض خاصة في الأنواع التي تمر بنمو جراسي طويل مثل البشر أو الخنازير. تقنيات IVM ال?...

تطوير أنظمة الثقافة المختلفة، بما في ذلك ثلاثية الأبعاد (3D) منها، يهدف إلى توفير الظروف المثلى لنمو ونضج البويضات المعزولة من بصيلات حتى في المراحل الأولى من التنمية. وهذا أمر ذو أهمية كبيرة بالنسبة لتقنيات المساعدة على الإنجاب (ART)، خاصة بالنظر إلى العدد المتزايد من النساء اللواتي يكافحن مع العقم بعد علاج السرطان1. نضوج البويضات في ظروف في المختبر (IVM) هو بالفعل تقنية راسخة تستخدم أساسا لتوليد الجنين في المختبر لغرض تكاثر الماشية2. ومع ذلك، في معظم أنواع الثدييات، حتى لو كان يمكن تحقيق معدلات عالية من نضوج مجمعات الزبيب الكمولي (COCs) (تتراوح بين 60 و 90 ٪3، فإن كفاءتها التنموية لا تزال غير كافية لتلبية الاحتياجات. هذا لأنّ التطوير من الزّجوت ينال في هذا طريق حتّى حتّى إلى الوّحدة طور منخفضة وبعد الإنتقال داخل بديلة خفّض قدرتهم أن يكون عمليّة إلى عبارة. وبالتالي، هناك حاجة إلى زيادة الكفاءة التنموية للأجنة التي تم الحصول عليها من البويضات التي خضعت لإجراء IVM4. لذلك، يتم ابتكار وسائل الإعلام نضوج جديدة5 وفترات مختلفة من الثقافة في المختبر6,7 جنبا إلى جنب مع مكملات وسائل الإعلام الثقافة مع عوامل النمو المختلفة والجزيئات8,9.
الخطوة الأولى من أي نظام IVM كاملة هي خلق الظروف المثلى للنمو المستدام للبويضات خلال الثقافة في المختبر. نمو البويضة هو واحد من المؤشرات المحددة لقدرة البويضة على استئناف البويضات10،11. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون البويضة المناسبة في نظام ثقافة في المختبر قادرة على دعم نضوجها النووي والتمايز السيتوبلازمي12. مورفولوجيا مركب الزبيب الكمولي هو مؤشر مهم آخر يستخدم في عيادات العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية لاختيار أفضل البويضات للخطوات اللاحقة من الإخصاب في المختبر (IVF) الإجراء في البشر والماشية12،13. ومن بين الخصائص المورفولوجية ل COCs التي تعتبر: قطر البويضة، حبيبات السيتوبلازم وأول نزاهة الجسم القطبي14،15. إلى جانب ذلك، يرتبط إمكانات النمو البويضية إلى مظهر وضغط الخلايا الركامية وعدد طبقاتها المحيطة البويضة. مهم جداً لبويضات مناسبة في نظام ثقافة فيترو هو أيضا الحفاظ على الخلايا البويضية-cumulus التفاعلات السليمة والاستقرار cytoskeleton16,17,18,19. حتى الآن، في في المختبر بويضة النمو داخل COCs الإنسان وقد ثبت20. كما نتج عن استخدام COCs البقر مع الولادات الحية. تم عزل هذه من بصيلات المبيض غير ناضجة ثم مثقف لمدة 14 يوما حتى البويضة كانت كبيرة بما فيه الكفاية للخضوع لعملية التلقيح الاصطناعي21. وبالمثل، COCs معزولة عن بصيلات البابون انترال، التي تعرضت لIVM بعد في ثقافة في المختبر أسفرت عن البويضات قادرة على إعادة الميوسيس إلى المرحلة الثانية metaphase مع هيكل المغزل العادي الظهور22. ومع ذلك ، في هذه الدراسة لم يحاول المؤلفون تخصيبها. ومع ذلك تشير هذه النتائج إلى أن إجراء مماثل يمكن تطبيقه ليس فقط على هذه الأنواع الثديية الخاصة ولكن أيضا على مجمعات الكومبولوس- البويضة البشرية التي يتم الحصول عليها من الجريبات ما ينبغي أن يسمح بالحصول على بويضات ذات نوعية جيدة مناسبة لتقنية التلقيح الصناعي الناجحة.
تم الحصول على النتائج المذكورة أعلاه مع تطبيق بروتوكولات IVM التقليدية التي تم خلالها استزراع البويضات في أنظمة ثنائية الأبعاد. الإجراء الروتيني في أنظمة الثقافة 2D يغطي البويضات، مغمورة في قطرة من وسائل الإعلام الثقافة المناسبة، مع النفط المعدني23،24. ومن المفترض أن تراكب النفط خلال في تربية البويض في المختبر يعمل على منع تبخر السائل، وبالتالي ضمان الحفاظ على درجة الهضاح السليمة والضغط التناضح في الثقافة. على الرغم من أن مثل هذا النظام ثقافة 2D يسمح للحصول على, حتى تصل إلى 87% من البويضات الخنازير ناضجة25, وقد ثبت أن تراكب النفط المعدني يسبب انتشار كبير من المواد القابلة للذوبان في الدهون التي هي ضرورية لتطوير البويضات السليم26. بالإضافة إلى ذلك، بسبب المنشطات (البروجسترون وهرمون الاستروجين) انتشار في الزيوت المعدنية خلال ثقافة البويض، لوحظ تأخير النضج النووي والحد من تحقيق الكفاءة التنموية من البويضات الخنازير. وهذا قد يؤدي إلى الحصول على عدد قليل من zygotes، والتي بالإضافة إلى ذلك تتميز القدرة التنموية المنخفضة لمرحلة الكيسة الأردية وبضعف الجدوى بعد نقلها إلى الحيوانات المتلقية27. لذلك، يتم بذل محاولات لزيادة الكفاءة التنموية للأجنة المشتقة من البويضات التي يتم تلقيها بعد إجراء IVM، من خلال خلق الظروف المثلى لتحقيق كل من النضج السيتوبلازمي والنووي للبويضات المستزرعة مع CCs كمجمعات، خاصة باستخدام أنظمة ثلاثية الأبعاد (3D). وقد تم تطوير مختلف النظم المبتكرة 3D في الثقافة في المختبر في العقدين الماضيين28,29. وقد صممت هذه للحفاظ على التنظيم المكاني الطبيعي للخلايا وتجنب تسطيحها في أطباق الثقافة ما لا يمكن تحقيقه في الثقافات التقليدية 2D. يمكن ضمان النشاط الهيكلي والوظيفي للCOCS مثقف من خلال الحفاظ على الهندسة المعمارية السليمة والاتصال دون عائق من خلال الفجوة - الوصلات بين مختلف المقصورات30. وقد تم تقييم ملاءمة سقالات حيوية لثقافة 3D في المختبر من مجمعات التراكمات البويضية باستخدام المواد الحيوية الطبيعية مثل مكونات مختلفة من المصفوفة خارج الخلوية (ECM؛ الكولاجين وحمض الهيالورونيكس)31 أو البوليمرات الخاملة (alginate)32. هذه المحاولات التي تم اختبارها في عدة أنواع جلبت نتائج واعدة من حيث استئناف البويضات meiosis وتحقيق كفاءتها الكاملة33,34,35. ولكن حتى الآن، لم يتم تطوير أي نظام ثلاثي الأبعاد مناسب لنضوج COCs المعزول عن الحيوانات الأليفة الكبيرة، بما في ذلك الخنازير.
يصف هذا العمل بروتوكولين يمكن استخدامهما لثقافة الـ 3D لـ PORcine COCs. يصف البروتوكول الأول التغليف في الخرز الفيبرين-ألجينات (FAB). يمكن تشكيل FAB عن طريق خلط محلول ألجينات والفيبرين في وقت واحد ، والتي تخضع لعملية هلام متزامن. يوفر هذا المزيج بيئة ميكانيكية ديناميكية لأن كلا المكونين يساهمان في صلابة المصفوفة. وقد استخدم حل مماثل سابقا لثقافة بصيلات المبيض الماوس ونضج36. في حالة البروتوكول المقدم، لتجنب التحلل المبكر لشبكة الفليبين، يتم استخدام تركيزات أعلى بشكل مناسب من محلول كلوريد الكالسيوم، مما يضمن عملية هلام سريعة ومستقرة. البيئة الميكانيكية الديناميكية تخلق ظروف مماثلة لهذه الظروف في البيئة الطبيعية داخل الجريب الذي تتواجد فيه COCs وتزيد في الحجم. بالإضافة إلى ذلك، يعرض العمل نتائج تمثيلية لنظم الثقافة ثلاثية الأبعاد COCs، حيث يتم تعليق هذه في قطرة متوسطة ومغلفة بروبلين الإيثيلين المفلور (FEP؛ copolymer من سداسي فلوريورو بروبلين وجسيمات رباعية الفلور إيثيلين) المسحوق، لتشكيل ميكروبيورياكتوريس (الرخام السائل، LM). LM هي شكل من أشكال 3D مفاعل حيوي التي ثبت سابقا لدعم, من بين أمور أخرى, نمو الكائنات الحية الدقيقة الحية37, الورم spheroids38 والخلايا الجذعية الجنينية39. وقد تم أيضا استخدام LMs بنجاح لتربية البويضات الأغنام40. في معظم التجارب باستخدام LMs، تم إعداد المفاعلات الحيوية باستخدام سرير مسحوق اثيلين متعددtetrafluoro (PTFE) بحجم جسيم 1 ميكرومتر41. البروتوكول المقدم يستخدم FEP، وهو مشابه جداً في التركيب وخصائص لـ PTFE الفلوروبوليمرات. ولكن FEP هو أكثر سهولة شكل ونعومة من PTFE وما هو مهم بشكل خاص، فمن شفافة للغاية.
كلا النظامين ثلاثي الأبعاد يحافظان على البيئة الغازية في بيئة الاستزراع في المختبر. كما أنها تحافظ على COCs 3D المنظمة من خلال منع تسطيح وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة، والحفاظ على علاقتهم الوظيفية بين البويضات والخلايا الجريب المحيطة بها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

وفي مجال البيولوجيا الإنجابية، أدت ثورة التكنولوجيا الأحيائية التي بدأت بالتلقيح الاصطناعي وتكنولوجيا نقل الأجنة إلى تطوير تقنيات المساعدة على الإنجاب مثل البويضة في نضوج المختبرات (IVM)، والتخصيب في المختبر (IVF) واستنساخ الحيوانات الأليفة عن طريق النقل النووي من الخلايا الجسدية. IVM هو الأسلوب خاصة من أهمية. بل هو منصة التكنولوجيا لتوريد ناضجة، جيدة الجودة البويضات لتطبيقات مثل الحد من الفاصل الزمني جيل في الأنواع الهامة تجاريا أو المهددة بالانقراض، والبحوث المتعلقة في المختبر التكاثر البشري، وإنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا لعلاج الخلايا. مصطلح بويضة الجودة يشمل اختصاصها لاستكمال النضج، أن تكون المخصبة، مما يؤدي إلى نسل صحي. وهذا يعني أن البويضات ذات النوعية الجيدة هي ذات أهمية قصوى للتخصيب الناجح بما في ذلك إجراءات التلقيح الاصطناعي. وهذا يطرح صعوبات كثيرة لتطوير طريقة زراعة موثوقة من شأنها أن تدعم نمو ليس فقط من البويضات البشرية ولكن أيضا لأنواع الثدييات الكبيرة الأخرى. الخطوة الأولى في IVM هي ثقافة في المختبر من البويضات. يصف هذا العمل بروتوكولين لثقافة البويضات البورسين 3D. في الأول، يتم تغليف 3D نموذج كومبلوس-بويضة المجمعات (COCs) في شبكة توسط حبة الفيبرين alginate، حيث يتم هلام مزيج من الفيبرين و alginate في وقت واحد. وفي الثانية، يتم تعليق مركبات الكربون في قطرة متوسطة ومغلفة بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP؛ copolymer من سداسي فلوري بروبلين وتترافلور إيثيلين) جزيئات مسحوق لتشكيل ميكروبيورياكات تعرف بأنها كرات من الرخام السائل (LM). كلا النظامين ثلاثي الأبعاد يحافظان على البيئة الغازية في بيئة الاستزراع في المختبر. كما أنها تحافظ على منظمة COCs 3D من خلال منع تسطيحها وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة، وبالتالي الحفاظ على العلاقة الوظيفية بين البويضات، والخلايا الجريب المحيطة بها.

في COCs باستخدام كلا أنظمة IVM ، التزمت خلايا الحبيبية بإحكام مع بعضها البعض ، وكان معظم COCs المستردة طبقات سليمة من خلايا الركام(الشكل 1A ، B). بالإضافة إلى ذلك، تم الاحتفاظ بنسبة كبيرة من خلايا الركام.
وأكدت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل قابلية ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

هنا هي بروتوكولين لتغليف البويضات porcine في ظروف ثقافة 3D. في الأول، يتم تغليف مجمعات الزُنَق (COCs) في الخرز الفيبرين-الجينات. وفي الثانية، يتم وضعها مع جزيئات مسحوق البروبيلين الإيثيلين المفلورة (ميكروبيراكات). يضمن كلا النظامين الظروف المثلى للحفاظ على تنظيمهما ثلاثي الأبعاد.

تحلل Proteolytically Alginate Hydrogels والميكروبات الهيدروفوبية ل Porcine Oocyte تغليف

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

هذا البروتوكول لتغليف البويضات البورسين يجعل من الممكن الحفاظ على تنظيم كروية من COCs. وهذا يمنع تسطيحها وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة بين البويضة والخلايا الجريبائية المحيطة بها. المزايا الرئيسية للبروتوكولين الموصوفين هي أن هي سهلة الاستخدام وتسمح للسيطرة الفعالة على كل من البويضة والبقاء على قيد الحياة خلية العلاج الكيميائي.كل من النظم الثقافة هي أدوات قيمة للبحوث الأساسية في البيولوجيا الإنجابية، وربما تكون ذات صلة سريرية لتحسين علاج العقم. ويمكن تطبيقها أيضاً لتطوير أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الأحيائية ولتحسين الثروة الحيوانية. بعد شطف المبيضين، ونقلها إلى منقار مملوءة HM المتوسطة وتخزينها في حاضنة في 38 درجة مئوية خلال جميع التلاعبات اللاحقة.اضمّر السائل الجريب من بصيلات البورcine الكبيرة والطرد المركزي في 100 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تصفية مُنَتَهَم باستخدام حقنة معقمّة موصولة بمصفّي مسام غشاء 0.2 ميكرومتر، ثم قم بتجميده بسرعة 80 درجة مئوية. لعزل COCs من بصيلات متوسطة الحجم، نقل اثنين إلى ثلاثة مبايض إلى طبق بيتري معقمة 10 سم مليئة HM. قطع بلطف سطح بصيلات المبيض جاحظ مع عدد جراحي معقمة شفرة 15، والتي سوف تسبب السائل الجريبي وCOCS لتدفق بها إلى طبق بيتري.استلهم محتويات الجريبي مع إبرة قياس 28 متصلة بحقنة يمكن التخلص منها ، ونقلها إلى طبق بيتري آخر. لإعداد أطباق IVF Petri، أضف ملليلتر واحد من HM إلى الآبار المركزية، ووضع ثلاث إلى أربع قطرات من HM في الحلقات الخارجية. ثم استخدام ميكروسيبيت البولي لنقل COCs التالفة إلى قطرات من HM في الحلقات الخارجية، وشطف لفترة وجيزة لهم ثلاث إلى أربع مرات.عند الانتهاء، بشكل فردي نقلها إلى البئر المركزية. تخزين لوحات التلقيح الاصطناعي في الحاضنة. إعداد حلول الخثار والفيبرينوجين كما هو موضح في المخطوطة النصية.في يوم الإجراء ، ذوبان محلول الفيبرينوجين على الجليد ببطء ، واحضره إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مباشرة. مزيج 0.5٪ الحل alginate والمحلول الفيبرينوجين بنسبة واحد إلى واحد لحجم النهائي من مليلتر ودوامة بلطف الخليط. إصلاح غرف الحضانة عن طريق تطبيق شرائط رقيقة من فيلم البارافين على الشرائح المجهر الزجاجي.Pipette 7.5 قطرات ميكرولتر من خليط FA على شريحة الزجاج المغلفة فيلم البارافين مع فواصل فصل، ووضع ثمانية إلى 10 قطرات مرتبة في صفين. استخدام micropipette لنقل ثلاثة إلى خمسة COCs إلى مركز انخفاض الاتحاد الإنجليزي ، جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من حجم متوسط النضج. إضافة 7.5 ميكرولترات من حل ثرومبين على رأس كل قطرة FA لتغطية ذلك.ليس هناك حاجة لخلطها لأن الجل يتشكل على الفور تقريبا. غطي غرفة الحضانة بشريحة زجاجية معدة مسبقًا، ثم اقلب الغرفة رأسًا على عقب ووضعها في طبق بيتري عيار 100 ملليمتر مبطن بورق فلتر رطب. وضع طبق بيتري في 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة 38 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق.بعد الاحتضان، نقل كل كبسولة FA إلى بئر من لوحة 96-well تحتوي على 100 ميكرولترات من متوسط النضج. كل يومين، استبدال نصف المتوسط مع الطازجة قبل- نضوج المتوسطة. يستخدم "صورة COC" مجهر ضوء مقلوب في التكبير 10x.بعد زراعة COCs لمدة أربعة أيام، وإزالة المتوسطة النضج من الآبار وإضافة 100 ميكرولترات من 10 وحدات دولية لكل ملليلتر algenate في DMEM. اترك لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 25 إلى 30 دقيقة. إزالة COCs من كبسولات الذائبة.غسلها في DMEM عدة مرات، ثم نقلها إلى حلقة الداخلية من طبق التلقيح الاصطناعي التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. جعل سرير من خمسة غرامات من مسحوق FEP في طبق بيتري 30 ملليمتر. توزيع قطرة واحدة من متوسط النضج تحتوي على ثلاثة إلى خمسة COCs على مسحوق FEP.تدوير لوحة بلطف في حركة دائرية لضمان أن الجسيمات تغطي تماما سطح قطرة السائل وتشكيل الرخام السائل، أو LMs. إعداد عدة 60 ملليمتر IVF بتري أطباق، وإضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الماء المعقم إلى الحلقات الخارجية لإنشاء غرفة الرطوبة. التقاط LM شكلت مع ماصة 1000 ميكرولتر ووضعها في البئر المركزي.احتضان الرخام لمدة أربعة أيام في 38 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة. لتغيير الوسط، قم بتطبيق 30 ميكروليترات من متوسط النضج على كل LM، مما يؤدي إلى انتشاره. عندما تذوب محتويات الرخام، نقل COCs صدر من المفاعل الحيوي إلى قطرة من متوسط نضوج جديد في طبق بيتري.بعد ثلاثة إلى أربعة يغسل في وسط النضج، ونقل COCs، جنبا إلى جنب مع 30 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة، على سرير مسحوق FEP. تدوير بلطف لوحة في حركة دائرية لضمان أن جزيئات مسحوق تغطي تماما سطح قطرة السائل وتشكيل LM.Then جديدة، ونقل LM إلى طبق بتري التلقيح الاصطناعي. أنتجت كل من نظم النضج في المختبر COCs مع خلايا الحبيبات التي تم الالتزام بها بإحكام لبعضها البعض وطبقات سليمة من خلايا الركام.وقد أكد تحليل قابلية البقاء في COC أن ظروف النمو المثلى قد تحققت في كلا نظامي التغليف. في كلتا المجموعتين، لوحظت مواقع البويضات العالية القدرة على البقاء فقط. تم تصوير البويضات مع المجهر الإلكترون انتقال.تم توزيع الميتوكوندريا بالتساوي وكان لها شكل يشبه القشرة. ولم يُمتد سوى عدد قليل منهم ولوحظ تجميعهم بشكل متقطع. ارتبط النتكولوم إندوبلاسميكي إما مع الميتوكوندريا أو مجانا في السيتوبلازم البويضية.ظهرت قطرات السائل كما صغيرة، الظلام، هياكل مستديرة، وظهرت أجهزة غولجي مع cisternae المتوسعة. من المهم أن تكون دقيقة وحذرة عند نقل كبسولات FA من غرفة الحضانة إلى لوحات الثقافة وعند التقاط ونقل شكل LM في طبق IVF Petri.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

PuraMatrix تغليف الخلايا السرطانية

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

آلية التفاعل اللوني مسعور اختيار عمود للاستخدام في تنقية البروتين

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

تصنيع Amyloid-β-إفراز الجينات Microbeads لاستخدامها في نمذجة مرض الزهايمر

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...