Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Forfatterne er meget taknemmelige for: dr Waclaw Tworzydlo (Institut for Udviklingsbiologi og Hvirvelløse Morfologi, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University) for tekniske faciliteter i TEM; beata Snakowska (Institut for Endokrinologi, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University) for teknisk bistand; institut for cellebiologi og billeddannelse, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dette arbejde blev støttet af tilskud 2018/29/N/NZ9/00983 fra National Science Centre Polen.

Følgende procedurer blev godkendt af Dyrevelfærdsudvalget ved Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning ved Jagiellonian University.
1. Isolering af porcine cumulus-oocyt komplekser
<ol><li>At indsamle materiale til isolering af ovariefoske, punktøre æggestokke fra præpubertale gylte (ca. 6-7 måneder, vejer 70 til 80 kg) på et lokalt slagteri. Vælg ca. 20 svine æggestokke fra 10 dyr til COCs isolation i hvert forsøg. BEMÆRK: Hvis man antager, at hver æggesting giver 3-5 f...

Evnen til at opretholde in vitro vækst ikke kun af oocyt, men også af cumulus celler omkring det og samtidig støtte dens modning er yderst afgørende for den vellykkede assisteret reproduktive teknologier og for at fremme forståelsen af somatiske celle / oocyt interaktioner især hos arter, der gennemgår langvarig follikulær vækst såsom mennesker eller svin. Løbende forbedrede IVM teknikker bliver nyttigt redskab til at bevare reproduktive muligheder i tilfælde af polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ov...

Udviklingen af forskellige kultursystemer, herunder tredimensionelle (3D) dem, har til formål at give optimale betingelser for vækst og modning af oocytter isoleret fra folliklerne selv i de tidligste stadier af udviklingen. Dette er af stor betydning for assisterede reproduktive teknikker (ART), især i betragtning af det stigende antal kvinder, der kæmper med barnløshed efter kræftbehandling1. Modning af oocytter under in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletableret teknik, der hovedsagelig anvendes til in vitro embryo produktion med henblik på husdyrreproduktion2. I de fleste pattedyrsarter kan der imidlertid opnås en høj modning af cumulus-oocytkomplekser (COC) (interval 60-90 %)3, men deres udviklingskompetence er stadig utilstrækkelig i forhold til behovene. Dette skyldes, at udviklingen af zygotes opnået på en sådan måde, selv op til blastocyst fase er lav, og efter overførslen til surrogat dyr deres levedygtighed til sigt er reduceret. Der er derfor behov for at øge udviklingskompetencen for embryoner fra oocytter, der blev underkastet IVM-proceduren4. Derfor er nye modning medier5 ved at blive udtænkt og forskellige perioder med in vitro kultur ertestet 6,7 sammen med tilskud af kultur medier med forskellige vækstfaktorer ogmolekyler 8,9.
Det første skridt i ethvert komplet IVM-system er at skabe optimale betingelser for bæredygtig vækst af oocytter under in vitro-kultur. Den oocyte vækst er en af de specifikke indikatorer for oocyt evne til at genoptage meiose10,11. Desuden skal et passende oocyt in vitro-kultursystem kunne understøtte dets nukleare modning og cytoplasmatisk differentiering12. Morfologien af cumulus-oocyt kompleks er en anden vigtig indikator, der anvendes i ART klinikker til at vælge den bedste oocyt for efterfølgende trin i in vitro befrugtning (IVF) procedure hos mennesker og husdyr12,13. Blandt de morfologiske egenskaber ved de behandlede p-pc'er er: oocytdiameteren, dens cytoplasmagranulation og den første polarkropintegritet14,15. Udover, oocyte udviklingspotentiale er korreleret med udseende og komprimering af cumulus celler og antallet af deres lag omkring oocyt. Meget vigtigt for passende oocyt in vitro kultur system er også vedligeholdelse af oocyt-cumulus celler korrekt interaktioner og cytoskeleton stabilitet16,17,18,19. Hidtil har in vitro oocyt vækst inden for menneskelige p-piller blevet påvist20. Brugen af ko-p-piller resulterede også i levendefødte. Disse blev isoleret fra umodne æggestokkene follikler og derefter dyrket i 14 dage, indtil oocyt var tilstrækkelig stor til at gennemgå IVF procedure21. Tilsvarende p-piller isoleret fra bavian antral follikler, udsat for IVM efter in vitro kultur gav oocytter stand til at reinitiere meiose til metafase II fase med en normal vises spindel struktur22. Men i denne undersøgelse forfatterne ikke forsøge at befrugte dem. Ikke desto mindre tyder sådanne resultater på, at en lignende procedure ikke kun kan anvendes på disse særlige pattedyrarter, men også på humane cumulus-oocytkomplekser, der er fremstillet af follikler, hvad der bør gøre det muligt at opnå oocytter af god kvalitet, der er egnet til en vellykket IVF-teknik.
De ovenfor beskrevne resultater blev opnået ved anvendelse af konventionelle IVM-protokoller, hvor oocytter blev dyrket i todimensionale (2D) systemer. Den rutinemæssige procedure i 2D-kultursystemer dækker oocytter, nedsænket i en dråbe af en passende kultur medier, med mineralsk olie23,24. Det antages, at en olieoverlejring under in vitro oocyt kultur tjener til at forhindre flydende fordampning, og dermed sikre opretholdelsen af korrekt pH og osmotisk tryk i kulturen. Selv om et sådant 2D-kultursystem gør det muligt at opnå, selv op til 87% af modne gris oocytter25, er det blevet bevist, at mineralolie overlay forårsager betydelig diffusion af lipidopløselige materialer, som er nødvendige for korrekt oocytter udvikling26. Derudover, på grund af steroider (progesteron og østrogener) diffusion i mineralolie under oocyt kultur, en forsinkelse af nuklear modning og reduktion i udviklingsmæssige kompetence opnåelse af svin oocytter blev observeret. Dette kan resultere i, at der opnås et lille antal zygotes, som desuden er kendetegnet ved lav udviklingskapacitet til blastocyst-fasen og af dårlig levedygtighed efter overførsel til recipientdyr27. Der gøres derfor forsøg på at øge udviklingskompetencen hos embryoner, der stammer fra oocytter, der modtages efter IVM-proceduren, ved at skabe optimale betingelser for at opnå både cytoplasmatisk og nuklear modenhed af oocytter, der dyrkes sammen med CC'er som komplekser, især ved hjælp af tredimensionale (3D) systemer. Der er i de sidste to årtier udviklet forskellige innovative 3D in vitro-kultursystemer28,29. Disse var designet til at opretholde den naturlige rumlige organisering af celler og for at undgå deres udfladning i kulturretter, hvad der ikke kan opnås i de traditionelle 2D-kulturer. De dyrkede p-pillers strukturelle og funktionelle aktivitet kan sikres ved at opretholde deres korrekte arkitektur og uforstyrret kommunikation gennem mellemrumskryds mellem forskelligerum 30. Egnetheden af bio-stilladser til 3D in vitro kultur cumulus-oocyt komplekser er blevet evalueret ved hjælp af naturlige biomaterialer såsom forskellige komponenter i den ekstra-cellulære matrix (ECM; kollagen og hyaluronsyre)31 eller inaktive polymerer (alginat)32. Disse forsøg, der blev testet i flere arter , gav lovende resultater med hensyn til genoptagelse af meiose oocyt meiose og opnåelse af deres fuldekompetence 33,34,35. Indtil videre er der imidlertid ikke udviklet noget 3D-system, der er egnet til modning af p-piller, der er isoleret fra store husdyr, herunder svin.
Dette arbejde beskriver to protokoller, der kan bruges til 3D-kulturen i svine-p-piller. Den første protokol beskriver indkapsling i fibrin-alginat perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding af en alginat- og fibrinopløsning, som gennemgår en synkron geleringsproces. Denne kombination giver et dynamisk mekanisk miljø, fordi begge komponenter bidrager til matrix stivhed. En lignende opløsning har tidligere været anvendt til mus ovariesækken kultur og modning36. For så vidt angår den præsenterede protokol anvendes passende højere koncentrationer af calciumchloridopløsning for at undgå for tidlig nedbrydning af alginat-fibrinnettet, hvilket sikrer en hurtig og stabil geleringsproces. Det dynamiske mekaniske miljø skaber betingelser svarende til disse i det naturlige intrasækkulære miljø, hvor p-piller bor og øger størrelsen. Derudover viser arbejdet repræsentative resultater af COCs 3D-kultursystemer, hvor disse er suspenderet i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylen propylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler, til at danne mikrobioreaktorer (Flydende kugler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor, der tidligere har vist sig at støtte, blandt andre, vækst af levende mikroorganismer37, tumor sfæroider38 og embryonale stamceller39. LMs er også med succes blevet brugt til får oocyt kultur40. I de fleste forsøg med FLYDENDE blev bioreaktorer fremstillet ved hjælp af polytetrafluorethylen (PTFE) pulverseng med partikelstørrelse på 1 μm41. Den præsenterede protokol bruger FEP, som er meget ens i sammensætning og egenskaber til fluorpolymerer PTFE. Men FEP er lettere formbar og blødere end PTFE, og hvad der er særligt vigtigt, det er meget gennemsigtig.
Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre deres udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds, bevare deres funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

Inden for reproduktiv biologi førte den bioteknologiske revolution, der begyndte med kunstig befrugtning og embryooverførselsteknologi, til udvikling af assisterede reproduktionsteknikker såsom oocyt in vitromodning (IVM), in vitro-befrugtning (IVF) og kloning af husdyr ved nuklear overførsel fra somatiske celler. IVM er den metode, der er særlig vigtig. Det er platformteknologien til levering af modne oocytter af god kvalitet til anvendelser såsom reduktion af produktionsintervallet i kommercielt vigtige eller truede arter, forskning i in vitro-menneskelig reproduktion og produktion af transgene dyr til cellebehandlinger. Udtrykket oocyt kvalitet omfatter sin kompetence til at fuldføre modning, befrugtes, og dermed resulterer i sunde afkom. Det betyder, at oocytter af god kvalitet er altafgørende for vellykket befrugtning, herunder IVF procedurer. Dette giver mange vanskeligheder med at udvikle en pålidelig kulturmetode, der vil understøtte væksten ikke kun af menneskelige oocytter, men også af andre store pattedyrarter. Det første skridt i IVM er in vitro kultur oocytter. Dette værk beskriver to protokoller for 3D-kulturen af svin oocytter. I den første er 3D-model cumulus-oocyt komplekser (COC'er) indkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating netværk, hvor en blanding af fibrin og alginat er geleret samtidigt. I den anden suspenderes p-piller i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylenprokylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler til mikrobioreaktorer defineret som flydende kugler (LM). Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre, at de udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds bevares, hvorved det funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler bevares.

I p-piller, der anvender begge IVM-systemer, holdt granulosacellerne sig tæt til hinanden, og de fleste af de genvundne p-piller havde intakte lag af cumulusceller (Figur 1A, B). Desuden blev en betydelig del af cumulusceller bevaret.
Resultaterne af cocs levedygtighedsanalysen bekræftede, at begge systemer, der anvendes til indkapsling af porcine oocytter i 3D in vitro-forhold, sikrede optimale vækstbetingelser (figur 2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Præsenteret her er to protokoller for indkapsling af svin oocytter i 3D-kultur betingelser. I den første er cumulus-oocyt komplekser (P-piller) indkapslet i fibrin-alginat perler. I den anden, de er omgivet af fluorerede ethylen propylen pulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemer sikrer optimale betingelser for at opretholde deres 3D-organisation.

Proteolytisk nedbrudt alginathydrgels og hydrofobe mikrobioreaktorer til Porcine Oocyt Indkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Denne protokol for indkapsling af porcine oocytter gør det muligt at opretholde sfærisk organisering af p-piller. Dette forhindrer deres udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler. De vigtigste fordele ved de to beskrevne protokoller er, at der er brugervenlige og giver mulighed for effektiv kontrol af både oocyt og kemo celle overlevelse.Begge kultursystemer er værdifulde redskaber til grundforskning i reproduktiv biologi og kan have klinisk relevans for forbedret fertilitetsbehandling. De kan også anvendes til udvikling af nye bioteknologiske metoder og til forbedring af husdyrbestanden. Efter skylning æggestokkene, overføre dem til et bæger fyldt med HM medium og gemme dem i en kuvøse på 38 grader Celsius under alle efterfølgende manipulationer.Aspirere follikulærvæsken fra store svinesække og centrifuge det ved 100 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter filtrere supernatant ved hjælp af en steril sprøjte fastgjort til en 0,2-mikrometer membran pore filter, og snap fryse det ved negative 80 grader Celsius. For at isolere p-piller fra mellemstore follikler, overføre to til tre æggestokke til en steril 10 centimeter petriskål fyldt med HM. Skær forsigtigt overfladen af de fremspringende ovariesækkene med et sterilt kirurgisk nummer 15 klinge, hvilket vil få follikulært væske og co'erne til at flyde ud i petriskålen.Aspirere follikulærindholdet med en 28 gauge nål fastgjort til en engangssprøjte, og overføre det til en anden petriskål. For at forberede IVF Petri retter, tilsæt en milliliter HM til de centrale brønde, og sted tre til fire dråber HM i de ydre ringe. Brug derefter en polycarbonat mikropipette til at flytte de ubeskadigede p-piller til dråber af HM i de ydre ringe, og kort skylle dem tre til fire gange.Når du er færdig, individuelt overføre dem til den centrale brønd. Opbevar IVF-pladerne i kuvøsen. Forbered trombin- og fibrinogenopløsninger som beskrevet i tekstmanuskriptet.På dagen for proceduren, langsomt tø fibrinogen opløsning på is, og bringe det til stuetemperatur lige før brug. Bland 0,5% alginatopløsning og fibrinogenopløsningen i et forhold på 1-1 for et endeligt volumen på to milliliter, og bland forsigtigt blandingen. Reparation inkubation kamre ved at anvende tynde strimler af paraffin film til glas mikroskop dias.Pipette 7,5 mikroliter dråber af FA blandingen på paraffin film-belagt glas dias med adskillelse afstandsløbere, placere otte til 10 dråber arrangeret i to rækker. Brug en mikropipette til at overføre tre til fem p-pc'er til midten af FA-drop'en sammen med et minimum af modningsmedie. Tilføj 7,5 mikroliter trombinopløsning oven på hver FA drop for at dække det.Der er ingen grund til at blande dem, fordi gelen danner næsten øjeblikkeligt. Dæk inkubationskammeret med en tidligere forberedt glasrutsjebane, vend derefter kammeret på hovedet og læg det i en 100-millimeter petriskål foret med fugtigt filterpapir. Sæt petriskålen i 5% kuldioxid ved 38 grader Celsius inkubator i fem til syv minutter.Efter inkubation overføres hver FA-kapsel til en brønd af en 96-brøndplade, der indeholder 100 mikroliter modningsmedium. Hver anden dag udskiftes halvdelen af mediet med frisk forkvædet modningsmedium. Image COC bruger en omvendt lys mikroskop ved 10x forstørrelse.Efter dyrkning af p-piller i fire dage fjernes modningsmediet fra brøndene og der tilsættes 100 mikroliter på 10 internationale enheder pr. milliliteralgenatpeat i DMEM. Lad kulturpladen være i inkubatoren i 25 til 30 minutter. Fjern p-pillerne fra de opløste kapsler.Vask dem i DMEM flere gange, derefter overføre dem til den indre ring af en IVF skål, der indeholder PBS. Lav en seng af fem gram FEP pulver i en 30 millimeter petriskål. Fordel et enkelt dråbe modningsmedium, der indeholder tre til fem p-pc'er, på FEP-pulveret.Drej pladen forsigtigt i en cirkulær bevægelse for at sikre, at partiklerne helt dækker overfladen af væsken dråbe og danne flydende kugler, eller LMs. Forbered flere 60 millimeter IVF Petri retter, og tilsæt tre til fire milliliter sterilt vand til de ydre ringe for at skabe en fugtighed kammer. Saml den dannede LM op med en 1000 mikroliterpipette, og placer den i den centrale brønd.Inkuber kuglerne i fire dage ved 38 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator. For at ændre mediet skal du anvende 30 mikroliter modningsmedie på hvert LM, hvilket vil få det til at sprede sig. Når marmorindholdet opløses, overføres de p-piller, der frigives fra bioreaktoren, til en dråbe frisk modningsmedium i petriskålen.Efter tre til fire vaske i modning medium, overføre p-piller, sammen med 30 mikroliter af frisk medium, på FEP pulver seng. Drej forsigtigt pladen i en cirkulær bevægelse for at sikre, at pulverpartiklerne helt dækker væskens overflade og danner en ny LM.Derefter overføres LM til IVF Petriskålen. Begge in vitro modningssystemer produceret COCs med granulose celler, der var tæt holdt til hinanden og intakte lag af cumulus celler.COC's rentabilitetsanalyse bekræftede, at der blev opnået optimale vækstbetingelser i begge indkapslingssystemer. I begge grupper blev der kun observeret høj levedygtighedsoocytter. Oocytterne blev afbildet med transmissionselektronmikroskopi.Mitokondrierne var jævnt fordelt og havde en shell-lignende form. Kun nogle få af dem blev aflange, og deres klyngedannelse blev sporadisk observeret. Endoplasmatisk reticulum var enten forbundet med mitokondrier eller fri i oocyt cytoplasmaet.Flydende dråber optrådte som små, mørke, runde strukturer, og Golgi apparater blev opstået med udvidet cisternae. Det er vigtigt at være præcis og forsigtig, når du overfører FA kapsler fra inkubation kammer i kultur plader og når picking up og overførsel format LM i IVF Petri parabol.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatiseret hydrofobisk interaktions-kromatografi Kolonne Valg til brug i Proteinoprensning

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Single oocyt hydrogensulfit Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Fremstilling af DNA-tværbundet polyacrylamid Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fremstilling af amyloid-β-udskilning af Alginat-Mikroperler til brug ved modellering af Alzheimers sygdom

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...