Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

De auteurs zijn erg dankbaar voor: dr. Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) voor technische faciliteiten in TEM; aan mevrouw Beata Snakowska (Departement Endocrinologie, Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek, Jagiellonian University) voor technische bijstand; aan de afdeling Celbiologie en Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dit werk werd ondersteund door subsidie 2018/29/N/NZ9/00983 van National Science Centre Polen.

De volgende procedures werden goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn van het Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek van de Jagiellonian University.
1. Isolatie van varkenstcumulus-eicellen
<ol><li>Voor het verzamelen van materiaal voor de isolatie van eierstokken, accijnzen varkensstokken uit prepubertale gelten (ongeveer 6-7 maanden oud, met een gewicht van 70 tot 80 kg) in een lokaal slachthuis. Kies ongeveer 20 varkensstokken uit 10 dieren voor COC isolatie in elk exper...

Het vermogen om in vitro groei te behouden, niet alleen van de eicel, maar ook van cumuluscellen eromheen en tegelijkertijd de rijping ervan te ondersteunen, is uiterst essentieel voor de succesvolle ondersteunde voortplantingstechnologieën en voor het bevorderen van het begrip van somatische cel/eicelinteracties, vooral bij soorten die langdurige folliculaire groei ondergaan, zoals mensen of varkens. Continu verbeterde IVM-technieken worden nuttig instrument om reproductieve opties te behouden in gevallen van polycyste...

De ontwikkeling van verschillende cultuursystemen, waaronder driedimensionale (3D) systemen, heeft tot doel optimale omstandigheden te bieden voor de groei en rijping van eicellen geïsoleerd van de follikels, zelfs in de vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is van groot belang voor geassisteerde voortplantingstechnieken (ART), vooral met het oog op het toenemende aantal vrouwen die worstelen met onvruchtbaarheid na de behandeling van kanker1. Rijping van eicellen in in vitro omstandigheden (IVM) is al een gevestigde techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor de productie van in vitro embryo's voor de voortplanting van vee2. Bij de meeste zoogdiersoorten kan echter, zelfs als er hoge rijpingspercentages van cumulus-eicellencomplexen (COC's) kunnen worden bereikt (bereik 60 tot 90 %)3, hun ontwikkelingsbevoegdheid nog steeds niet aan de behoeften voldoen. Dit komt omdat de ontwikkeling van de zygotes verkregen op een zodanige wijze zelfs tot de blastocyst stadium is laag en na de overdracht in surrogaat dieren hun levensvatbaarheid tot termijn wordt verminderd. Daarom is het nodig de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo's die zijn verkregen uit eicellen die onder de IVM-procedure4zijn onderworpen , te vergroten . Daarom worden nieuwe rijpingsmedia5 ontwikkeld en verschillende perioden van in vitrocultuur worden getest6,7 samen met suppletie van cultuurmedia met verschillende groeifactoren en moleculen8,9.
De eerste stap van elk compleet IVM-systeem is het creëren van optimale voorwaarden voor duurzame groei van eicellen tijdens de in vitro cultuur. De eicelgroei is een van de specifieke indicatoren van het vermogen van de eicel om meiose10,11te hervatten . Bovendien moet een passend eicel in vitrocultuursysteem in staat zijn zijn nucleaire rijping en cytoplasmatische differentiatie te ondersteunen12. De morfologie van het cumulus-eicelcomplex is een andere belangrijke indicator die in ART-klinieken wordt gebruikt om de beste eicel te selecteren voor latere stappen van in vitro fertilisatie (IVF) procedure bij mensen en vee12,13. Onder morfologische kenmerken van COCs beschouwd zijn: de eiceldiameter, de cytoplasma granulatie en de eerste poollichaam integriteit14,15. Bovendien is het oocyte ontwikkelingspotentieel gecorreleerd aan het uiterlijk en de verdichting van cumuluscellen en het aantal van hun lagen rond de eicel. Zeer belangrijk voor de juiste eicel in vitro cultuur systeem is ook het behoud van eicel-cumulus cellen juiste interacties en cytoskeleton stabiliteit16,17,18,19. Tot nu toe is in vitro oocyte groei binnen menselijke COC's aangetoond20. Het gebruik van koe COCs resulteerde ook in levende geboorten. Deze werden geïsoleerd van onrijpe eierstokzakjes en vervolgens gekweekt voor 14 dagen tot de eicel was voldoende groot om de IVF-procedure21ondergaan . Op dezelfde manier leverden COC's geïsoleerd van bavianenanonielen, onderworpen aan IVM na in vitrocultuur, eicellen op die meiose konden herinitieren in het stadium van de metafase II met een normaal verschijnende spindelstructuur22. Echter, in deze studie de auteurs niet proberen om ze te bevruchten. Niettemin wijzen dergelijke resultaten erop dat een soortgelijke procedure niet alleen kan worden toegepast op deze specifieke zoogdiersoorten, maar ook op menselijke cumulus-eicellencomplexen verkregen uit follikels die het mogelijk zouden moeten maken om eicellen van goede kwaliteit te verkrijgen die geschikt zijn voor een succesvolle IVF-techniek.
De hierboven beschreven resultaten werden verkregen met de toepassing van conventionele IVM-protocollen waarbij eicellen werden gekweekt in tweedimensionale (2D) systemen. De routineprocedure in 2D-kweeksystemen omvat eicellen, ondergedompeld in een druppel van een geschikte cultuurmedia, met minerale olie23,24. Aangenomen wordt dat een olieoverlay tijdens de in vitro oocytecultuur dient om vloeibare verdamping te voorkomen, waardoor het behoud van een goede pH en osmotische druk in de cultuur wordt gewaarborgd. Hoewel een dergelijk 2D-kweeksysteem het mogelijk maakt om, zelfs tot 87% van de rijpe varkensoocyten25,te verkrijgen, is bewezen dat de overlay van minerale olie een aanzienlijke verspreiding van lipoïde oplosbare materialen veroorzaakt die nodig zijn voor een goede ontwikkeling van eicellen26. Bovendien, als gevolg van steroïden (progesteron en oestrogenen) diffusie in de minerale olie tijdens eicelcultuur, een vertraging van nucleaire rijping en vermindering van de ontwikkelingscompetentie prestatie van varkens eicellen werd waargenomen. Dit kan leiden tot het verkrijgen van een klein aantal zygotes, die bovendien worden gekenmerkt door een lage ontwikkelingscapaciteit tot het stadium van de blastocyst en door een slechte levensvatbaarheid na overdracht in ontvangende dieren27. Daarom wordt getracht de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo's die zijn afgeleid van eicellen die na de IVM-procedure zijn ontvangen, te vergroten door optimale voorwaarden te scheppen voor het bereiken van zowel cytoplasmatische als nucleaire rijpheid van eicellen die samen met CCs als complexen worden gekweekt, met name met behulp van driedimensionale (3D)-systemen. In de afgelopen tweedecennia,zijn verschillende innovatieve 3D-in-vitrocultuursystemenontwikkeld. Deze werden ontworpen om de natuurlijke ruimtelijke organisatie van cellen te behouden en om te voorkomen dat hun afvlakking in cultuurgerechten wat niet kan worden bereikt in de traditionele 2D-culturen. De structurele en functionele activiteit van gekweekte COC's kan worden gewaarborgd door het behoud van hun goede architectuur en ongestoorde communicatie via gap-junctions tussen verschillende compartimenten30. De geschiktheid van bio-steigers voor 3D in vitro cultuur van cumulus-eicellen complexen is geëvalueerd met behulp van natuurlijke biomaterialen, zoals verschillende componenten van de extracellulaire matrix (ECM; collageen en hyaluronzuur)31 of inerte polymeren (alginaat)32. Deze pogingen getest in verschillende soorten bracht veelbelovende resultaten in termen van eicel meiose hervatting en het bereiken van hun volledige competentie33,34,35. Tot nu toe is er echter geen 3D-systeem ontwikkeld dat geschikt is voor coc's, geïsoleerd van grote huisdieren, waaronder varkens, is ontwikkeld.
Dit werk beschrijft twee protocollen die kunnen worden gebruikt voor de 3D-cultuur van varkens COC's. Het eerste protocol beschrijft inkapseling bij fibrin-alginaatkralen (FAB). FAB kan worden gevormd door gelijktijdig een alginaat en fibrinoplossing te mengen, die een synchrone gelatieproces ondergaan. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving omdat beide componenten bijdragen aan matrixstijfheid. Een soortgelijke oplossing is eerder gebruikt voor de muizenzakzak follikel cultuur en rijping36. In het geval van het gepresenteerde protocol worden, om voortijdige afbraak van het alginaatfibrinnetwerk te voorkomen, op passende wijze hogere concentraties calciumchlorideoplossing gebruikt, waardoor een snel en stabiel gelatieproces wordt gewaarborgd. De dynamische mechanische omgeving creëert soortgelijke omstandigheden in de natuurlijke intra-folliculaire omgeving waarin COC's zich bevinden en in omvang toenemen. Bovendien toont het werk representatieve resultaten van COC 3D-kweeksystemen, waarin deze worden opgeschort in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes, om microbioreactoren te vormen (Knikkers, LM). LM zijn een vorm van 3D bioreactor waarvan eerder is aangetoond dat het onder andere de groei van levende micro-organismen37, tumorsferoïden38 en embryonale stamcellen39ondersteunt. LMs zijn ook met succes gebruikt voor schapen eicelcultuur40. In de meeste experimenten met LMs werden bioreactoren bereid met polytetrafluorethyleen (PTFE) poederbed met een deeltjesgrootte van 1 μm41. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van FEP, dat qua samenstelling en eigenschappen sterk lijkt op de fluoropolymeren PTFE. Maar FEP is gemakkelijker vormbaar en zachter dan PTFE en wat vooral belangrijk is, het is zeer transparant.
Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, het behoud van hun functionele relatie tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

In de reproductieve biologie leidde de biotechnologierevolutie die begon met kunstmatige inseminatie en embryotransfertechnologie tot de ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals eicel in vitro rijping (IVM), in vitro fertilisatie (IVF) en klonen van huisdieren door nucleaire overdracht van somatische cel. IVM is de methode in het bijzonder van betekenis. Het is het platform technologie voor de levering van volwassen, goede kwaliteit eicellen voor toepassingen zoals vermindering van de generatie interval in commercieel belangrijke of bedreigde soorten, onderzoek met betrekking tot in vitro menselijke voortplanting, en de productie van transgene dieren voor celtherapieën. De term eicelkwaliteit omvat haar competentie om rijping te voltooien, te bevruchten, wat resulteert in gezonde nakomelingen. Dit betekent dat eicellen van goede kwaliteit van het grootste belang zijn voor een succesvolle bevruchting, waaronder IVF-procedures. Dit levert veel problemen op om een betrouwbare cultuurmethode te ontwikkelen die niet alleen de groei van menselijke eicellen, maar ook van andere grote zoogdiersoorten zou ondersteunen. De eerste stap in IVM is de in vitro cultuur van eicellen. Dit werk beschrijft twee protocollen voor de 3D-cultuur van varkensocyten. In het eerste, 3D-model cumulus-eicellen complexen (COCs) zijn ingekapseld in een fibrin-alginaat kraal tussendoordtreting netwerk, waarin een mengsel van fibrine en alginaat gelijktijdig worden gelled. In de tweede worden COC's opgehangen in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes om microbiobioreactoren te vormen gedefinieerd als Vloeibare Knikkers (LM). Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, waardoor het behoud van de functionele relatie tussen de eicellen, en de omliggende folliculaire cellen.

In COC's die beide IVM-systemen gebruiken, hechtten de granulosacellen zich stevig aan elkaar en hadden de meeste herstelde COC's intacte lagen cumuluscellen(figuur 1A,B). Bovendien werd een aanzienlijk deel van de cumuluscellen behouden.
De resultaten van de levensvatbaarheidsanalyse van de COC's bevestigden dat beide systemen die werden toegepast voor de inkapseling van varkensocellen in 3D-in-vitro-omstandigheden optimale groeiomstandigheden zo...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC's) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.

Proteolytisch afgebroken alginaat hydrogels en hydrofobe microbioreactoren voor porcine Oocyte Inkapseling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Dit protocol voor de inkapseling van varkensocyten maakt het mogelijk om de bolvormige organisatie van COC's te handhaven. Dit voorkomt dat de afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen. De belangrijkste voordelen van de twee beschreven protocollen zijn die gebruiksvriendelijk zijn en zorgen voor effectieve controle van zowel de eicel en chemocel overleving.Beide cultuursystemen zijn waardevolle hulpmiddelen voor basisonderzoek in reproductieve biologie, en kunnen klinische relevantie voor betere onvruchtbaarheidsbehandeling hebben. Ze kunnen ook worden toegepast voor de ontwikkeling van nieuwe biotechnologiemethoden en voor de verbetering van de veestapel. Na het spoelen van de eierstokken, breng ze naar een beker gevuld met HM medium en bewaar ze in een incubator op 38 graden Celsius tijdens alle latere manipulaties.Aspirate de folliculaire vloeistof uit grote varkenszakjes en centrifugeren op 100 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens filtert u de supernatant met behulp van een steriele spuit die is bevestigd aan een 0,2-micrometer membraanfilter en vries het in bij negatieve 80 graden Celsius. Om de COC's te isoleren van middelgrote follikels, breng twee tot drie eierstokken over naar een steriele petrischaal van 10 centimeter gevuld met HM. Snijd voorzichtig het oppervlak van de uitstekende eierstokzakjes met een steriel chirurgisch nummer 15-blad, waardoor de folliculaire vloeistof en de COC's in de petrischaal stromen.Aspirate de folliculaire inhoud met een 28-meter naald bevestigd aan een wegwerpspuit, en breng het in een andere petrischaal. Om de IVF Petri gerechten te bereiden, voeg een milliliter HM aan de centrale putten, en plaats drie tot vier druppels HM in de buitenste ringen. Gebruik vervolgens een polycarbonaatmicropipet om de onbeschadigde COC's naar druppels HM in de buitenste ringen te verplaatsen en ze kort drie tot vier keer te spoelen.Wanneer u klaar bent, individueel overbrengen ze in de centrale put. Bewaar de IVF-platen in de couveuse. Bereid trombin en fibrinogen oplossingen zoals beschreven in de tekst manuscript.Ontdooi op de dag van de procedure de fibrinogen-oplossing langzaam op ijs en breng deze vlak voor gebruik op kamertemperatuur. Meng 0,5% alginaatoplossing en de fibrinogen-oplossing met een één-op-één verhouding voor een eindvolume van twee milliliters en voorzichtig draaikolf het mengsel. Repareer incubatiekamers door dunne stroken paraffinefilm aan te brengen op glazen microscoopdia's.Pipette 7,5 microliter druppels van het FA-mengsel op de met paraffine gecoate glazen schuif met scheidingsruimters, waarbij acht tot tien druppels in twee rijen worden geplaatst. Gebruik een micropipet om drie tot vijf COC's over te brengen naar het midden van de FA-drop, samen met een minimum volume rijpingsmedium. Voeg 7,5 microliter tromber van trombine oplossing op de top van elke FA druppel om het te dekken.Het is niet nodig om ze te mengen, omdat de gel zich bijna onmiddellijk vormt. Bedek de incubatiekamer met een eerder voorbereide glazen schuif, draai de kamer ondersteboven en plaats deze in een petrischaal van 100 millimeter bekleed met vochtig filterpapier. Zet de petrischaal in de 5%kooldioxide op 38 graden Celsius incubator voor vijf tot zeven minuten.Breng na incubatie elke FA-capsule over in een put van een 96-putplaat met 100 microliter rijpingsmedium. Om de twee dagen vervangt u de helft van het medium door vers voorvervoeende rijpingsmedium. Beeld COC maakt gebruik van een omgekeerde lichtmicroscoop bij 10x vergroting.Na het kweken van de COC's gedurende vier dagen, verwijder het rijpingsmedium uit de putten en voeg 100 microliter van 10 internationale eenheden per milliliter algenaat lysaat in DMEM. Laat de kweekplaat 25 tot 30 minuten in de couveuse staan. Verwijder de COC's uit de opgeloste capsules.Was ze in DMEM meerdere malen, dan breng ze naar de binnenste ring van een IVF-schotel met PBS. Maak een bed van vijf gram FEP poeder in een 30 millimeter petrischaal. Verdeel een enkele druppel rijping medium met drie tot vijf COC's op de FEP poeder.Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat de deeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel volledig bedekken en vloeibare knikkers vormen, of LMs. Bereid meerdere 60 millimeter IVF Petri gerechten en voeg drie tot vier milliliter steriel water toe aan de buitenste ringen om een vochtigheidskamer te creëren. Pak de gevormde LM op met een 1000 microliter pipet en plaats deze in de centrale put.Incubeer de knikkers voor vier dagen op 38 graden Celsius in een vijf procent kooldioxide incubator. Om het medium te veranderen, breng 30 microliter rijping medium op elke LM, waardoor het zal leiden tot verspreiding. Wanneer de marmeren inhoud oplost, breng de COC's vrij uit de bioreactor naar een druppel vers rijping medium in de petrischaal.Na drie tot vier wasbeurten in rijping medium, breng de COC's, samen met 30 microliters van vers medium, op het FEP-poederbed. Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat de poederdeeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel volledig bedekken en een nieuwe LM vormen.Breng vervolgens de LM over op de IVF Petrischaal. Beide in vitro rijpingssystemen produceerden COC's met granulosiscellen die strak aan elkaar werden gehecht en intacte lagen cumuluscellen.De levensvatbaarheidsanalyse van het COC bevestigde dat in beide inkapselingssystemen optimale groeiomstandigheden werden bereikt. In beide groepen werden alleen sites met een hoge levensvatbaarheid van eicellen waargenomen. De eicellen werden afgebeeld met transmissie elektronenmicroscopie.De mitochondriën waren gelijkmatig verdeeld en hadden een shell-achtige vorm. Slechts een paar van hen waren langwerpig en hun clustering werd sporadisch waargenomen. Endoplasmatisch reticulum werd ofwel geassocieerd met mitochondriën of vrij in het eicelcytoplasma.Vloeibare druppels verschenen als kleine, donkere, ronde structuren, en Golgi apparaten werden ontstaan met verwijde stortbak. Het is belangrijk om nauwkeurig en voorzichtig te zijn bij het overbrengen van FA-capsules van incubatiekamer naar kweekplaten en bij het oppakken en overbrengen van formaat LM in de IVF Petri schotel.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Encapsulation door Droplets

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Primer Uitbreiding Capture: Gerichte Sequence Retrieval uit zwaar vervuild DNA Bronnen

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

PuraMatrix Encapsulation van kankercellen

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Single Eicel bisulfiet Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Vervaardiging van amyloid-β-afscheidende alginaat Microbeads voor gebruik bij de modellering van de ziekte van Alzheimer

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...