Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

המחברים אסירי תודה: ד"ר Waclaw Tworzydlo (המחלקה לביולוגיה התפתחותית ומורפולוגיה חרת חוליות, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו רפואי, אוניברסיטת Jagiellonian) עבור מתקנים טכניים ב TEM; לגב' ביאטה סנקווסקה (המחלקה לאנדוקרינולוגיה, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, האוניברסיטה הג'יג'יבלונית) לקבלת סיוע טכני; למחלקה לביולוגיה והדמיה של תאים, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, אוניברסיטת ג'יג'ילוניאן, JEOL JEM 2100HT (JEOL, טוקיו, יפן). עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2018/29/N/NZ9/00983 ממרכז המדע הלאומי פולין.

ההליכים הבאים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים במכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי באוניברסיטת ג'יג'יבלוניק.
1. בידוד של מתחמי קומולוס-אוציט
<ol><li>כדי לאסוף חומר לבידוד זקיקי השחלות, לחתוך שחלות porcine מגילים prepubertal (כ 6-7 חודשים של גיל, במשקל 70-80 ק"ג) בבית מטבחיים מקומי. בחר כ-20 שח...

היכולת לשמור על צמיחה במבחנה לא רק של oocyte אלא גם של תאי קומולוס המקיפים אותו ובו זמנית תמיכה התבגרותו היא חיונית ביותר עבור טכנולוגיות הרבייה בסיוע מוצלח תקדם את ההבנה של תא סומטי / oocyte אינטראקציות במיוחד מינים העוברים צמיחה זקיקים ממושכת כגון בני אדם או חזירים. טכניקות IVM משופרות ללא הרף ה...

הפיתוח של מערכות תרבות שונות, כולל אלה תלת מימדי (3D), שמטרתו לספק תנאים אופטימליים לצמיחה והתבגרות של oocytes מבודד מן הזקיקים גם בשלבים המוקדמים ביותר של פיתוח. זה הוא בעל חשיבות רבה עבור טכניקות רבייה בסיוע (ART), במיוחד לאור המספר ההולך וגדל של נשים הנאבקות עם פוריות לאחר טיפול בסרטן1. התבגרות של oocytes בתנאי חוץ גופית (IVM) היא כבר טכניקה מבוססת היטב המשמשת בעיקר עבור יצירת עובר חוץ גופית לצורך רבייה בעלי חיים2. עם זאת, ברוב המינים היונקים, גם אם שיעור גבוה של התבגרות של קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) ניתן להשיג (טווח 60 עד 90 %)3, היכולת ההתפתחותית שלהם עדיין אינה מספקת לצרכים. הסיבה לכך היא הפיתוח של zygotes שהושגו באופן כזה אפילו עד שלב blastocyst הוא נמוך ולאחר ההעברה לבעלי חיים חלופיים הכדאיות שלהם לטווח מצטמצם. כתוצאה מכך, יש צורך להגדיל את היכולת ההתפתחותית של עוברים שהתקבלו מoocytes שהיו נתונים להליך IVM4. לכן, מדיה התבגרותחדשה 5 נמצאים בתכנון ותקופות שונות של תרבות המבחנהנבדקים 6,7 יחד עם תוספי מדיה תרבות עם גורמי גדילהשוניםמולקולות 8,9.
הצעד הראשון של כל מערכת IVM מלאה הוא ליצור תנאים אופטימליים לצמיחה בת קיימא של oocytes במהלך תרבות המבחנה. הצמיחה oocyte הוא אחד האינדיקטורים הספציפיים של היכולת של oocyte לחדש meiosis10,11. בנוסף, oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה חייב להיות מסוגל לתמוך התבגרות גרעינית שלה בידול cytoplasmic12. מורפולוגיה של קומפלקס cumulus-oocyte הוא אינדיקטור חשוב נוסף המשמש במרפאות ART כדי לבחור את oocyte הטוב ביותר עבור השלבים הבאים של הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) הליך בבניאדם ובעלי חיים 12,,13. בין המאפיינים המורפולוגיים של COCs נחשבים: קוטר oocyte, גרגר ציטופלסמה שלה ושלמות גוףהקוטב הראשון 14,15. חוץ מזה, הפוטנציאל ההתפתחותי oocyte הוא בקורלציה המראה והדחיסה של תאי קומולוס ומספר השכבות שלהם סביב oocyte. חשוב מאוד עבור oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה היא גם התחזוקה של תאי oocyte-cumulus אינטראקציות נאותות ויציבות ציטוסקלטון16,17,18,,19. עד כה, במבחנה oocyte צמיחה בתוך COCs אנושי הוכח20. השימוש COCs הפרה הביא גם עם לידות חיות. אלה היו מבודדים זקיקי שחלות ילדותיים ולאחר מכן תרבותי במשך 14 ימים עד oocyte היה גדול מספיק כדי לעבור את הליך הפריהחוץ גופית 21. באופן דומה, COCs מבודד זקיקי בבון אנטרל, נתון IVM לאחר בתרבות המבחנה הניב oocytes מסוגל לתחל מחדש meiosis לשלב metaphase II עם מבנה ציר מופיענורמלי 22. עם זאת, במחקר זה המחברים לא מנסים להפרות אותם. עם זאת, תוצאות כאלה מצביעות על כך שהליך דומה יכול להיות מיושם לא רק על מינים יונקים מסוימים אלה, אלא גם על תסביכים אנושיים cumulus-oocyte שהושגו זקיקים מה צריך לאפשר להשיג oocytes באיכות טובה מתאים טכניקת הפריה חוץ גופית מוצלחת.
התוצאות המתוארות לעיל הושגו עם יישום של פרוטוקולי IVM קונבנציונליים שבמהלכם oocytes היו תרבותיים במערכות דו מימדיות (2D). ההליך השגרתי במערכות תרבות דו-מית-מידיות מכסה את ה-oocytes, השקוע בטיפה של אמצעי תקשורת תרבותיים מתאימים,עם שמן מינרלי 23,24. ההנחה היא כי כיסוי שמן במהלך תרבות oocyte במבחנה משמש כדי למנוע אידוי נוזלי, ובכך להבטיח את התחזוקה של pH תקין ולחץ אוסמוטי בתרבות. למרות מערכת תרבות 2D כזה מאפשר להשיג, אפילו עד 87% של oocytes חזיר בוגר25, הוכח כי כיסוי שמן מינרלי גורם דיפוזיה משמעותית של חומרים מסיסים שומנים אשר נחוצים לפיתוח oocytesנכון 26. בנוסף, בגלל סטרואידים (פרוגסטרון ואסטרוגנים) דיפוזיה לתוך שמן מינרלי במהלך תרבות oocyte, עיכוב של התבגרות גרעינית וצמצום בהישג כשירות התפתחותית של oocytes חזיר נצפתה. הדבר עלול לגרום להשגת מספר קטן של זיגוטים, אשר בנוסף מאופיינים בקיבולת התפתחותית נמוכה לשלב של blastocyst ועל ידי קיימא ירודה לאחר העברה לבעלי חיים נמען27. לכן, נעשות ניסיונות להגביר את היכולת ההתפתחותית של עוברים הנגזרים מoocytes שהתקבלו לאחר הליך IVM, על ידי יצירת תנאים אופטימליים להשגת בגרות הן צטופלסמית והן בגרות גרעינית של oocytes תרבותי יחד עם CCs כמו קומפלקסים, במיוחד באמצעות מערכות תלת מימדיות (3D). 3D חדשניים שונים במערכות תרבות המבחנה פותחו בשני העשורים האחרונים28,29. אלה נועדו לשמור על הארגון המרחבי הטבעי של תאים ולהימנע שיטוח שלהם במנות תרבות מה לא ניתן להשיג בתרבויות הדו-מיD המסורתיות. ניתן להבטיח את הפעילות המבנית והפונקציונלית של COCs תרבותיים על ידי תחזוקת הארכיטקטורה המתאימה שלהם ותקשורת ללא הפרעה באמצעות צמתים בין תאיםשונים 30. התאמת ביו-פיגומים עבור 3D בתרבות המבחנה של קומפלקסים cumulus-oocyte הוערך באמצעות חומרים ביולוגיים טבעיים כגון רכיבים שונים של מטריצה חוץ תאית (ECM; קולגן וחומצה היאלורונית)31 או פולימרים אינרטיים (אלגינט)32. ניסיונות אלה שנבדקו במספר מינים הביאו לתוצאות מבטיחות מבחינת חידוש אוציט מיוזיס והשגת יכולתם המלאה33,34,35. עם זאת, עד כה, לא פותחה מערכת תלת-מית-מית-מית-מית-מז"ד המתאימה לבגרות COCs המבודדת מבעלי חיים ביתיים גדולים, כולל חזירים.
עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם עבור תרבות תלת-מית-די של COCs של פורצ'ין. הפרוטוקול הראשון מתאר אנקפולציה בחרוזי פיברין-אלג'ינאט (FAB). FAB יכול להיווצר על ידי ערבוב בו זמנית של תמיסת אלגנאט ופיברין, אשר עוברים תהליך ג'לציה סינכרונית. שילוב זה מספק סביבה מכנית דינמית מכיוון ששני הרכיבים תורמים לקשיחות מטריצה. פתרון דומה שימש בעבר עבור תרבות זקיק השחלות בעכבר והתבגרות36. במקרה של הפרוטוקול המוצג, כדי למנוע השפלה מוקדמת של רשת אלגנאט-פיברין, נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר של תמיסת סידן כלוריד, המבטיח תהליך ג'לציה מהירה ויציבה. הסביבה המכנית הדינמית יוצרת תנאים דומים לאלה בסביבה התוך-זקיקית הטבעית שבה שוכנים COCs וגדלים. בנוסף, העבודה מציגה תוצאות מייצגות של מערכות תרבות 3D COCs, שבו אלה מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואוריציה (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטרופלואוראתילן) חלקיקי אבקה, כדי ליצור microbioreactors (גולות נוזליות, LM). LM הם צורה של bioreactor 3D שהופעמי בעבר לתמוך, בין היתר, צמיחה של מיקרואורגניזמיםחיים 37, סרטניםסרטניים 38 ותאי גזעעובריים 39. LMs שימשו בהצלחה גם לתרבות הכבשים40. ברוב הניסויים באמצעות LMs, ביו-כופתים הוכנו באמצעות פוליטקטרפלואורואתילן (PTFE) אבקת מיטה עם גודל חלקיקים של 1 μm41. הפרוטוקול המוצג משתמש FEP, אשר דומה מאוד קומפוזיציה ומאפיינים PTFE fluoropolymers. אבל FEP הוא יותר קל לצורה ורך יותר PTFE ומה חשוב במיוחד, זה שקוף מאוד.
שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם שומרים על ארגון תלת-מיתד COCs על ידי מניעת שיטוח שלהם ושיבוש כתוצאה של צמתים פער, שמירה על הקשר הפונקציונלי שלהם בין oocyte ותאי זקיק שמסביב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

בביולוגיה של הרבייה, מהפכת הביוטכנולוגיה שהחלה עם הפריה מלאכותית וטכנולוגיה להעברת עוברים הובילה לפיתוח טכניקות רבייה בסיוע כגון oocyte בהברה חוץ גופית (IVM), הפריה חוץ גופית (IVF) שיבוט של בעלי חיים ביתיים על ידי העברה גרעינית מתא סומטי. IVM היא השיטה בעלת משמעות מיוחדת. זוהי טכנולוגיית הפלטפורמה לאספקת oocytes בוגר, באיכות טובה עבור יישומים כגון צמצום מרווח הדור מינים חשובים מבחינה מסחרית או בסכנת הכחדה, מחקר לגבי רבייה אנושית חוץית, וייצור של בעלי חיים טרנסגניים עבור טיפולים בתא. המונח איכות oocyte כולל את יכולתה להשלים התבגרות, להיות מופרית, ובכך לגרום צאצאים בריאים. משמעות הדבר היא כי oocytes באיכות טובה הם בעלי חשיבות עליונה עבור הפריה מוצלחת כולל הליכי הפריה חוץ גופית. זה מציב קשיים רבים לפתח שיטת תרבות אמינה שתתמוך בצמיחה לא רק של oocytes אנושיים, אלא גם של מינים גדולים אחרים של יונקים. הצעד הראשון בIVM הוא תרבות המבחנה של oocytes. עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים לתרבות תלת-מית-מית של ציטים שונים. הראשון, מודל 3D cumulus-oocyte מתחמים (COCs) הם עטוף ברשת חרוז פיברין-אלגינט interחדירה, שבו תערובת של פיברין אלגינט הם ג'ל בו זמנית. בשנייה, COCs מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואורין (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטטרפלואורואתילן) חלקיקי אבקה כדי ליצור microbioreactors המוגדרים גולות נוזלי (LM). שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם מחזיקים בארגון תלת-מיתד COCs על-ידי מניעת שיטוחם ושיבוש כתוצאה מכך של צמתים של פערים, ובכך שומרים על הקשר הפונקציונלי בין האוציט, לבין תאי הזקיקים שמסביב.

בCOCs באמצעות שתי מערכות IVM, תאי granulosa דבקו בחוזקה זה בזה, ורוב COCs התאושש היו שכבות שלמות של תאי קומולוס(איור 1,B). בנוסף, חלק ניכר של תאי קומולוס נשמרו.
התוצאות שהתקבלו מניתוח הכדאיות של COCs אישרו כי שתי המערכות שהושמו לתחבולה של ציטים קוסין ב3D בתנאי המבחנ...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

פרוטוקול זה עבור אנקפסולציה של oocytes פורצ'ין מאפשר לשמור על ארגון כדורי של COCs. הדבר מונע את שיטוחם ואת שיבושם של צמתים פער בין oocyte ותאי זקיקים שמסביב. היתרונות העיקריים של שני הפרוטוקולים המתוארים הם ידידותיים למשתמש ומאפשרים שליטה יעילה הן בהישרדות של אוציטים והן של תאי כימותרפיה.שתי מערכות התרבות הן כלים בעלי ערך למחקר בסיסי בביולוגיה של הרבייה, ועשויות להיות רלוונטיות קלינית לשיפור הטיפול בפוריות. הם יכולים להיות מיושמים גם לפיתוח שיטות ביוטכנולוגיה חדשניות ושיפור בעלי חיים. לאחר שטיפה השחלות, להעביר אותם מקור מלא מדיום HM ולאחסן אותם באינקובטור ב 38 מעלות צלזיוס במהלך כל המניפולציות הבאות.שאפו את הנוזל הזקיקי מזקיקי פורצ'ין גדולים וצנטריפוגו אותו פי 100 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סנן את העל-טבעי באמצעות מזרק סטרילי המחובר למסנן נקבוביות קרום 0.2 מיקרומטר, והצמד אותו ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. כדי לבודד את ה- COCs מזקיקים בגודל בינוני, מעבירים שתיים עד שלוש שחלות לתבשיל פטרי סטרילי באורך 10 ס"מ מלא ב- HM. חותכים בעדינות את פני השטח של זקיקי השחלות הבולטים עם להב כירורגי סטרילי מספר 15, אשר יגרום לנוזל הזקיקים ול- COCs לזרום החוצה לתוך צלחת פטרי.שאפו את תכולת הזקיקים עם מחט 28 מד מחובר מזרק חד פעמי, ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי אחרת. כדי להכין את מנות הפריה חוץ גופית פטרי, להוסיף מיליליטר אחד של HM ל בארות המרכזיות, ולה מניחים שלוש עד ארבע טיפות של HM בטבעות החיצוניות. לאחר מכן השתמש micropipette פוליקרבונט להעביר את COCs ניזוק טיפות של HM בטבעות החיצוניות, ולשטוף אותם לזמן קצר שלוש עד ארבע פעמים.בסיום, מעבירים אותם בנפרד לתוך באר מרכזית. אחסן את צלחות ההפריה החוץ גופית באינקובטור. הכן פתרונות תרמובין ופיברינוגן כמתואר בכתב היד של הטקסט.ביום ההליך, לאט להפשיר את פתרון פיברינוגן על קרח, ולהביא אותו לטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש. מערבבים 0.5% פתרון אלגינט ואת פתרון פיברינוגן ביחס של אחד לאחד עבור נפח סופי של שני מיליליטר בעדינות מערבולת את התערובת. תקן תאי דגירה על ידי החלת רצועות דקות של סרט פרפין על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.פיבט 7.5 טיפות microliter של תערובת FA על החלקת זכוכית מצופה סרט פרפין עם מפרידים רווחים, הצבת שמונה עד 10 טיפות מסודרים בשתי שורות. השתמש micropipette להעביר שלושה עד חמישה COCs למרכז טיפת FA, יחד עם נפח מינימלי של אמצעי התבגרות. הוסף 7.5 מיקרוליטרים של פתרון טרומבין על גבי כל טיפת FA כדי לכסות אותו.אין צורך לערבב אותם כי הג'ל נוצר כמעט מיידית. מכסים את תא הדגירה במגלשת זכוכית שהוכנה בעבר, ואז הופכים את התא ומנחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ מרופדת בנייר מסנן לח. שים את צלחת פטרי ב 5% פחמן דו חמצני ב 38 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך חמש עד שבע דקות.לאחר הדגירה, מעבירים כל קפסולת FA לתוך באר של צלחת 96 באר המכילה 100 microliters של מדיום התבגרות. כל יומיים, החלף חצי מהמדיום במדיום התבגרות טרי שמצוייד מראש. COC תמונה משתמש במיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 10.לאחר culturing COCs במשך ארבעה ימים, להסיר את מדיום ההבשלה מן הבארים ולהוסיף 100 microliters של 10 יחידות בינלאומיות לכל מיליליטר אלג'נית lysate ב DMEM. השאירו את צלחת התרבות באינקובטור למשך 25 עד 30 דקות. הסר את ה- COCs מהכמוסות המומסות.לשטוף אותם DMEM מספר פעמים, ולאחר מכן להעביר אותם לטבעת הפנימית של צלחת IVF המכיל PBS. הפוך מיטה של חמישה גרם של אבקת FEP בצלחת פטרי 30 מילימטר. הפץ טיפה אחת של מדיום התבגרות המכילה שלושה עד חמישה COCs על אבקת FEP.לסובב את הצלחת בעדינות בתנועה מעגלית כדי להבטיח כי החלקיקים לכסות לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל וליצור גולות נוזליות, או LMs. להכין כמה 60 מילימטר IVF פטרי מנות, ולהוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של מים סטריליים לטבעות החיצוניות כדי ליצור תא לחות. להרים את LM נוצר עם פיפטה 1000 microliter ולמקם אותו לתוך באר המרכזית.דגירה הגולות במשך ארבעה ימים ב 38 מעלות צלזיוס באינקובטור 5 אחוז פחמן דו חמצני. כדי לשנות את המדיום, להחיל 30 microliters של מדיום התבגרות על כל LM, אשר יגרום לו להתפשט. כאשר תכולת השיש מתמוססת, מעבירים את ה- COCs המשתחררים מהכור הביולוגי לירידה של מדיום התבגרות טרי בצלחת פטרי.לאחר שלוש עד ארבע שטיפות במדיום התבגרות, מעבירים את ה- COCs, יחד עם 30 מיקרוליטרים של מדיום טרי, למיטת אבקת FEP. בעדינות לסובב את הצלחת בתנועה מעגלית כדי להבטיח כי חלקיקי האבקה לכסות לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל ו ליצור LM חדש.לאחר מכן, להעביר את LM לצלחת IVF פטרי. שתי מערכות ההבשלה במבחנה ייצרו COCs עם תאי גרנולוזיס שהיו דבקים זה בזה בחוזקה ושכבות שלמות של תאי קומולוס.ניתוח הכדאיות של COC אישר כי תנאי צמיחה אופטימליים הושגו בשתי מערכות אנקפסולציה. בשתי הקבוצות נצפו רק אתרי אוציטים בעלי כדאיות גבוהה. הוציטים דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.המיטוכונדריה חולקה באופן שווה והייתה לה צורה דמוית קליפה. רק מעטים מהם התארכה והאשכולות שלהם נצפו באופן ספורדי. ריקולום אנדופלסמי היה קשור למיכוכונדריה או בחינם בציטופלסמה של הוציטים.טיפות נוזליות הופיעו כמבנים קטנים, כהים ועגולים, ומנגנון גולגי הגיח עם ציסטה שונה. חשוב להיות מדויקים וזהירים בעת העברת קפסולות FA תא הדגירה לתוך צלחות תרבות וכאשר להרים ולהעביר LM בפורמט לתוך צלחת IVF פטרי.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

PuraMatrix Encapsulation של תאים סרטניים

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...