Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
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Gli autori sono molto grati a: Dr Waclaw Tworzydlo (Dipartimento di Biologia dello Sviluppo e Morfologia Invertebrata, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagiellonian) per strutture tecniche in TEM; beata Snakowska (Dipartimento di Endocrinologia, Istituto di zoologia e ricerca biomedica dell'Università jagielloniana) per assistenza tecnica; al Dipartimento di Biologia Cellulare e Imaging, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagielloniana, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Giappone). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzione 2018/29/N/N/N/00983 dal National Science Centre Polonia.

Le seguenti procedure sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali presso l'Istituto di zoologia e ricerca biomedica dell'Università Jagiellonian.
1. Isolamento dei complessi di cumuli-oociti di porcina
<ol><li>Per raccogliere materiale per l'isolamento dei follicoli ovaitici, accise ovaie di porcine da dorati prepubertali (circa 6-7 mesi di età, del peso di 70-80 kg) in un macello locale. Scegli circa 20 ovaie di suini da 10 animali per l'isolamento dei COC in ogni esp...

La capacità di mantenere la crescita in vitro non solo dell'oocito, ma anche delle cellule cumuli che la circondano e contemporaneamente sostenere la sua maturazione è estremamente essenziale per le tecnologie di riproduzione assistita di successo e per promuovere la comprensione delle interazioni cellulare/oocite somatiche soprattutto nelle specie che subiscono una crescita follicolare prolungata come gli esseri umani o i maiali. Tecniche IVM continuamente migliorate stanno diventando uno strumento utile per preservar...

Lo sviluppo di vari sistemi di coltura, compresi quelli tridimensionali (3D), mira a fornire condizioni ottimali per la crescita e la maturazione degli oociti isolati dai follicoli anche nelle prime fasi di sviluppo. Questo è di grande importanza per le tecniche di riproduzione assistita (ART), soprattutto in considerazione del crescente numero di donne che stanno lottando con l'infertilità dopo il trattamento delcancro 1. La maturazione degli ovociti in condizioni in vitro (IVM) è già una tecnica consolidata utilizzata principalmente per la generazione di embrioni in vitro ai fini della riproduzione del bestiame2. Tuttavia, nella maggior parte delle specie di mammiferi, anche se è possibile raggiungere alti tassi di maturazione dei complessi cumuli-oocici (COC) (intervallo da 60 a 90 %)3, la loro competenza di sviluppo è ancora inadeguata alle esigenze. Questo perché lo sviluppo degli zigoti ottenuti in modo tale anche fino allo stadio di blastocisti è basso e dopo il trasferimento in animali surrogati la loro vitalità a termine è ridotta. Di conseguenza, è necessario aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni ottenuti da ovociti sottoposti alla procedura IVM4. Pertanto, nuovi mezzi dimaturazione 5 sono in fase di escogitazione e vengono testati vari periodi di coltura in vitro6,7 insieme al completamento dei mezzi di coltura con vari fattori di crescita e molecole8,9.
Il primo passo di qualsiasi sistema IVM completo è quello di creare condizioni ottimali per la crescita sostenibile degli ovociti durante la coltura in vitro. La crescita degli oocid è uno degli indicatori specifici della capacità dell'oocid di riprendere la meiosi10,11. Inoltre, un adeguato sistema di coltura in vitro deve essere in grado di sostenere la sua maturazione nucleare e la differenziazione citoplasmica12. La morfologia del complesso cumulus-oocid è un altro indicatore importante utilizzato nelle cliniche ART per selezionare il miglior ovocito per le successive fasi della fecondazione in vitro (IVF) procedura negli esseri umani e bestiame12,13. Tra le caratteristiche morfologiche dei COC considerati sono: il diametro degli oocici, la sua granulazione del citoplasma e la prima integrità del corpo polare14,15. Inoltre, il potenziale di sviluppo degli oocati è correlato all'aspetto e alla compattazione delle cellule cumuli e al numero dei loro strati che circondano l'ociocita. Molto importante per l'appropriato sistema di coltura in vitro di oociti è anche il mantenimento delle cellule oocite-cumulus interazioni corrette e la stabilità del citoscheletro16,17,18,19. Finora, la crescita degli oocici in vitro all'interno dei COC umani è stata dimostrata20. L'uso di COC di mucca ha portato anche a nascite vive. Questi sono stati isolati dai follicoli ovaiosi immaturi e poi colture per 14 giorni fino a quando l'ovocita era sufficientemente grande per sottoporsi alla procedura di fecondazionein vitro 21. Allo stesso modo, i COC isolati dai follicoli antrali del babbuino, sottoposti a IVM dopo che la coltura in vitro ha prodotto ovociti in grado di reinizializzare la meiosi allo stadio metafsie II con una normale struttura del mandrinoche appare 22. Tuttavia, in questo studio gli autori non hanno cercato di fertilizzarli. Tuttavia tali risultati indicano che una procedura simile potrebbe essere applicata non solo a queste specie di mammiferi particolari, ma anche a complessi umani cumuli-oociti ottenuti dai follicoli ciò che dovrebbe consentire di ottenere oociti di buona qualità adatti per una tecnica di fecondazione in vitro di successo.
I risultati descritti sopra sono stati ottenuti con l'applicazione di protocolli IVM convenzionali durante i quali gli ovociti sono stati colturati in sistemi bidimensionali (2D). La procedura di routine nei sistemi di coltura 2D copre gli oociti, immersi in una goccia di un supporto di coltura appropriato, con oliominerale 23,24. Si presume che una sovrapposizione di olio durante la coltura degli ovociti in vitro serva a prevenire l'evaporazione del liquido, garantendo così il mantenimento di un corretto pH e pressione osmotica nella coltura. Anche se un tale sistema di coltura 2D permette di ottenere, anche fino all'87% degli oociti di suini maturi25, è stato dimostrato che la sovrapposizione dell'olio minerale provoca una sostanziale diffusione di materiali lipidi solubili che sono necessari per un corretto sviluppo degli oociti26. Inoltre, a causa di steroidi (progesterone ed estrogeni) diffusione nell'olio minerale durante la coltura di ovociti, un ritardo della maturazione nucleare e la riduzione nella realizzazione di competenza dello sviluppo di ovociti di maiale è stato osservato. Ciò può comportare l'ottenimento di un piccolo numero di zigoti, che inoltre sono caratterizzati da bassa capacità di sviluppo allo stadio della blastocisti e da scarsa vitalità dopo il trasferimento negli animali destinatari27. Pertanto, si sta cercando di aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni derivati dagli ovociti ricevuti dopo la procedura IVM, creando condizioni ottimali per raggiungere sia la maturità citoplasmica che nucleare degli ovociti ristrutti insieme ai CC come complessi, in particolare utilizzando sistemi tridimensionali (3D). Negli ultimi due decenni sono stati sviluppati vari sistemi innovativi di coltura in vitro 3D28,29. Questi sono stati progettati per mantenere l'organizzazione spaziale naturale delle cellule e per evitare il loro appiattimento nei piatti di coltura ciò che non può essere raggiunto nelle culture 2D tradizionali. L'attività strutturale e funzionale dei COC coltura può essere assicurata dal mantenimento della loro corretta architettura e dalla comunicazione indisturbata attraverso svincoli tra i varicompartimenti 30. L'idoneità delle bio-scaffold per la coltura in vitro 3D di complessi cumuli-oocici è stata valutata utilizzando biomateriali naturali come vari componenti della matrice extracellulale (ECM; collagene e acido ialuronico)31 o polimeri inerti (alginato)32. Questi tentativi testati in diverse specie hanno portato risultati promettenti in termini di ripresa della meiosi ooccia e realizzazione della loro piena competenza33,34,35. Tuttavia finora non è stato sviluppato alcun sistema 3D adatto alla maturazione di COC isolato da grandi animali domestici, compresi i suini.
Questo lavoro descrive due protocolli che possono essere utilizzati per la coltura 3D dei COC dei porci. Il primo protocollo descrive l'incapsulamento in perline fibrin-alginate (FAB). IL FAB può essere formato mescolando simultaneamente una soluzione di alginato e fibrina, che subisce un processo di gelazione sincrona. Questa combinazione fornisce un ambiente meccanico dinamico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità della matrice. Una soluzione simile è stata utilizzata in precedenza per la coltura e la maturazione dei follicoliovaioli del topo 36. Nel caso del protocollo presentato, per evitare la degradazione prematura della rete alginata-fibrina, vengono utilizzate concentrazioni opportunamente più elevate di soluzione di cloruro di calcio, garantendo un processo di gelazione veloce e stabile. L'ambiente meccanico dinamico crea condizioni simili a queste nell'ambiente intra-follicolare naturale in cui risiedono i COC e aumentano di dimensioni. Inoltre, il lavoro mostra i risultati rappresentativi dei sistemi di coltura 3D COC, in cui questi sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propilene di etilene fluorrerato (FEP; un copolimero di particelle di polvere di esafluoropropilene e tetrafluoroetilene), per formare microbioreattori (Marmi liquidi, LM). LM sono una forma di bioreactor 3D che sono stati precedentemente indicati per sostenere, tra gli altri, la crescita di microrganismiviventi 37, sferoidi tumorali38 e cellule staminali embrionali39. LM sono stati utilizzati con successo anche per la cultura degli ovocitiovini 40. Nella maggior parte degli esperimenti con LM, i bioreattori sono stati preparati utilizzando il letto in polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) con dimensioni di particelle di 1 m41. Il protocollo presentato utilizza FEP, che è molto simile nella composizione e nelle proprietà ai fluoropolimeri PTFE. Ma FEP è più facilmente formabile e più morbido di PTFE e ciò che è particolarmente importante, è altamente trasparente.
Entrambi i sistemi 3D mantengono l'ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l'organizzazione 3D dei COC impedendo la loro appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando la loro relazione funzionale tra l'ociocite e le cellule follicolari circostanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

Nella biologia riproduttiva, la rivoluzione biotecnologica iniziata con l'inseminazione artificiale e la tecnologia di trasferimento degli embrioni ha portato allo sviluppo di tecniche di riproduzione assistita come la maturazione in vitro di ovociti (IVM), la fecondazione in vitro (IVF) e la clonazione di animali domestici mediante trasferimento nucleare da cellule somatiche. IVM è il metodo particolarmente significativo. È la tecnologia di piattaforma per la fornitura di oociti maturi e di buona qualità per applicazioni quali la riduzione dell'intervallo di generazione in specie commercialmente importanti o in via di estinzione, la ricerca sulla riproduzione umana in vitro e la produzione di animali transgenici per terapie cellulari. Il termine qualità degli oociti include la sua competenza per completare la maturazione, essere fecondato, con conseguente prole sana. Ciò significa che gli oociti di buona qualità sono di primaria importanza per la fecondazione di successo, comprese le procedure di fecondazione in vitro. Ciò pone molte difficoltà a sviluppare un metodo di coltura affidabile che sosterrebbe la crescita non solo degli ovociti umani, ma anche di altre grandi specie di mammiferi. Il primo passo in IVM è la coltura in vitro degli ovociti. Questo lavoro descrive due protocolli per la coltura 3D degli oociti di porcina. Nel primo, i complessi cumuli-oocici modello 3D (COC) sono incapsulati in una rete interpenetrata di perline fibrin-alginate, in cui una miscela di fibrina e alginato viene gelata contemporaneamente. Nel secondo, i COC sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propileti di etilene fluorro (FEP; un copolimero di exafluoropropylene e tetrafluoroetilene) particelle di polvere per formare microbioreattori definiti come marmi liquidi (LM). Entrambi i sistemi 3D mantengono l'ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l'organizzazione 3D dei COC impedendone l'appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando così la relazione funzionale tra l'ociocite e le cellule follicolari circostanti.

Nei COC che utilizzano entrambi i sistemi IVM, le cellule granulosa si aderiscevano strettamente l'una all'altra e la maggior parte dei COC recuperati aveva strati intatti di cellule cumuli(Figura 1A,B). Inoltre, sono state mantenute una parte sostanziale delle cellule cumuli.
I risultati ottenuti dall'analisi della fattibilità dei CFC hanno confermato che entrambi i sistemi applicati per l'incapsulamento degli oociti di suina in condizioni in vi...

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Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Qui presentati sono presentati due protocolli per l'incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.

Idrogel alginato degradati proteolylylylyd e microbioreattori idrofobici per l'incapsulamento dell'Oocito Porcine

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Questo protocollo per l'incapsulamento degli ovociti suini consente di mantenere l'organizzazione sferica dei COC. Ciò impedisce il loro appiattimento e conseguente interruzione delle giunzioni dello spazio tra l'ovociti e le cellule follicolari circostanti. I principali vantaggi dei due protocolli descritti sono che sono facili da usare e consentono un controllo efficace sia della sopravvivenza degli ovocite che delle cellule chemio.Entrambi i sistemi di coltura sono strumenti preziosi per la ricerca di base in biologia riproduttiva e possono avere rilevanza clinica per un migliore trattamento dell'infertilità. Possono anche essere applicati per lo sviluppo di nuovi metodi biotecnologici e per il miglioramento del bestiame. Dopo aver risciacquato le ovaie, trasferirle in un becher riempito con mezzo HM e conservarle in un'incubatrice a 38 gradi Celsius durante tutte le successive manipolazioni.Aspirare il liquido follicolare da grandi follicoli suini e centrifugarlo a 100 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, filtrare il supernatante utilizzando una siringa sterile attaccata a un filtro poro a membrana da 0,2 micrometri e bloccarlo a -80 gradi Celsius. Per isolare i COC dai follicoli di medie dimensioni, trasferire da due a tre ovaie in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri piena di HM. Tagliare delicatamente la superficie dei follicoli ovarico sporgenti con una lama sterile numero 15 chirurgica, che farà scorrere il liquido follicolare e i COC nella piastra di Petri.Aspirare il contenuto follicolare con un ago calibro 28 attaccato a una siringa monouso e trasferirlo in un'altra piastra di Petri. Per preparare le piastre di Petri di fecondazione in vitro, aggiungere un millilitro di HM ai pozzi centrali e posizionare da tre a quattro gocce di HM negli anelli esterni. Quindi utilizzare una micropipetta in policarbonato per spostare i COC non danneggiati in gocce di HM negli anelli esterni e risciacquarli brevemente da tre a quattro volte.Al termine, trasferirli singolarmente nel pozzo centrale. Conservare le piastre di fecondazione in vitro nell'incubatore. Preparare soluzioni trombine e fibrinogene come descritto nel manoscritto testuale.Il giorno della procedura, scongelare lentamente la soluzione di fibrinogeno sul ghiaccio e portarla a temperatura ambiente proprio prima dell'uso. Mescolare la soluzione di alginato allo 0,5% e la soluzione di fibrinogeno con un rapporto uno a uno per un volume finale di due millilitri e vortice delicatamente la miscela. Riparare le camere di incubazione applicando sottili strisce di pellicola di paraffina ai vetri vetrini del microscopio.Pipetta 7.5 gocce di microliter della miscela FA sulla diapositiva di vetro rivestita con pellicola di paraffina con distanziali di separazione, posizionando da otto a 10 gocce disposte in due file. Utilizzare una micropipetta per trasferire da tre a cinque COC al centro della caduta fa, insieme a un volume minimo di mezzo di maturazione. Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di trombina sopra ogni goccia fa per coprirlo.Non c'è bisogno di mescolarli perché il gel si forma quasi istantaneamente. Coprire la camera di incubazione con uno scivolo di vetro precedentemente preparato, quindi capovolgere la camera e posizionarla in una piastra di Petri di 100 millimetri foderata con carta filtrante umida. Metti la piastra di Petri nell'anidride carbonica del 5% a 38 gradi Celsius per cinque o sette minuti.Dopo l'incubazione, trasferire ogni capsula FA in un pozzo di una piastra da 96 porri contenente 100 microlitri di mezzo di maturazione. Ogni due giorni sostituire metà del mezzo con un mezzo di maturazione fresco pre-equilibrato. Il COC dell'immagine utilizza un microscopio a luce invertita con ingrandimento 10x.Dopo aver coltivato i COC per quattro giorni, rimuovere il mezzo di maturazione dai pozzi e aggiungere 100 microlitri di 10 unità internazionali per millilitro di glisato di algenato in DMEM. Lasciare la piastra di coltura nell'incubatore per 25-30 minuti. Rimuovere i COC dalle capsule disciolte.Lavarli più volte in DMEM, quindi trasferirli sull'anello interno di un piatto di fecondazione in vitro contenente PBS. Fai un letto di cinque grammi di polvere FEP in una piastra di Petri da 30 millimetri. Distribuire una singola goccia di mezzo di maturazione contenente da tre a cinque COC sulla polvere FEP.Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che le particelle coprano completamente la superficie della goccia liquida e formino marmi liquidi, o LMS. Preparare diverse piastre di Petri di fecondazione in vitro da 60 millimetri e aggiungere da tre a quattro millilitri di acqua sterile agli anelli esterni per creare una camera di umidità. Raccogliere l'LM formato con una pipetta da 1000 microliter e posizionarlo nel pozzo centrale.Incubare i marmi per quattro giorni a 38 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Per cambiare il mezzo, applicare 30 microlitri di mezzo di maturazione su ogni LM, il che lo farà diffondere. Quando il contenuto di marmo si dissolve, trasferire i COC rilasciati dal bio-reattore a una goccia di mezzo di maturazione fresco nella piastra di Petri.Dopo tre o quattro lavaggi in mezzo di maturazione, trasferire i COC, insieme a 30 microlitri di mezzo fresco, sul letto di polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che le particelle di polvere coprano completamente la superficie della goccia liquida e formino un nuovo LM.Quindi, trasferire l'LM alla piastra di Petri di fecondazione in vitro. Entrambi i sistemi di maturazione in vitro producevano COC con cellule di granulosi strettamente aderenti l'una all'altra e strati intatti di cellule cumuliche.L'analisi di fattibilità coc ha confermato che sono state raggiunte condizioni di crescita ottimali in entrambi i sistemi di incapsulamento. In entrambi i gruppi sono stati osservati solo siti di ovociti ad alta vitalità. Gli ovociti sono stati immagini con microscopia elettronica a trasmissione.I mitocondri erano distribuiti uniformemente e avevano una forma simile a un guscio. Solo alcuni di essi erano allungati e il loro raggruppamento era sporadicamente osservato. Il reticolo endoplasmatico era associato ai mitocondri o libero nel citoplasma degli ovocite.Goccioline liquide apparvero come piccole strutture scure e rotonde, e gli apparati golgi furono emersi con cisterne dilatate. È importante essere precisi e attenti quando si trasferiscono le capsule FA dalla camera di incubazione in piastre di coltura e quando si raccoglie e si trasferisce il formato LM nella piastra di Petri di fecondazione in vitro.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Ricerca

Biologia

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