Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

저자는 매우 감사: 박사 Waclaw Tworzydlo (발달 생물학 및 무척추 동물 형태학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, Jagiellonian 대학) TEM의 기술 시설에 대 한; 기술 지원을 위해 비타 스나코프스카 (내분비학 학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 야기엘로니아 대학)에게; 세포 생물학 및 이미징학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 자지엘로니아 대학, JEOL JEM 2100HT (JEOL, 도쿄, 일본). 이 작품은 폴란드 국립 과학 센터로부터 2018/29/N/NZ9/00983교부금에 의해 지원되었습니다.

다음 절차는 야기엘로니안 대학의 동물학 및 생물 의학 연구 연구소의 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 돼지 적혈구 -oocyte 복합체의 격리
<ol><li>난소 여포의 격리를 위한 물질을 수집하기 위해, 지역 도살장에서 프레우버탈 금(약 6-7개월, 무게 70~80kg)에서 돼지 난소를 소비한다. 각 실험에서 COC 격리를 위해 10마리의 동물중 약 20마리의 돼지 난소를 선택하십시오. ...

체외 성장뿐만 아니라 난소 세포를 둘러싸고 동시에 성숙을 지원하는 능력은 성공적인 보조 생식 기술과 특히 인간이나 돼지와 같은 장기간 여포 성장을 겪고있는 종에서 체세포 / oocyte 상호 작용에 대한 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 지속적으로 향상된 IVM 기술은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 조기 난소 실패, 또는 결정적인 불임 (종양 요법)의 경우에 생식 옵션을 보존하는 유용한 도구가되...

3차원(3D) 시스템을 포함한 다양한 문화 시스템의 개발은 개발 초기 단계인 여포로부터 분리된 난모세포의 성장과 성숙을 위한 최적의 조건을 제공하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이는 특히 암치료후 불임으로 어려움을 겪고 있는 여성의 수가 증가하고 있다는 점에서 보조 생식 기술(ART)에 매우 중요합니다. 체외 조건에서 난모세포의 성숙 (IVM)은 이미 가축 재생을 목적으로 체외 배아 생성에 주로 사용되는 잘 확립 된기술이다 2. 그러나, 대부분의 포유류 종에서는 적혈구-난낭체 복합체(COC)의 성숙률이 높더라도 달성할 수 있다(범위 60~ 90%)3,그들의 발달 능력은 여전히 필요에 부적당하다. 이는 발아세포 단계까지도 그런 방식으로 얻어진 자고테의 발달이 낮고 대리동물로 옮겨진 후 용어에 대한 생존능력이 감소하기 때문이다. 따라서, IVM 시술4를받은 난모세포로부터 얻어진 배아의 발달 능력을 증가시킬 필요가 있다. 따라서, 새로운 성숙배지(5)가 고안되고 있으며, 다양한 성장인자와 분자를 가진 배양매체의5 보충과 함께8,6,,7, 7의 시험관내 배양문화가 시험되고있다.
완전한 IVM 시스템의 첫 번째 단계는 체외 문화 동안 난모세포의 지속 가능한 성장을위한 최적의 조건을 만드는 것입니다. 난소 세포 성장은 meiosis10,,11을재개하는 oocyte의 능력의 특정 지표 중 하나입니다. 또한, 체외 배양 시스템의 적절한 난모세포는 핵 성숙과 세포질분화(12)를지원할 수 있어야 한다. 적혈구-오낭복합체의 형태는 인간과가축(12,,13)에서체외 수정(IVF) 절차의 후속 단계에 가장 적합한 난피티를 선택하기 위해 ART 클리닉에서 사용되는 또 다른 중요한 지표이다. 고려 된 COC의 형태학적 특성 중 에는 난십성 직경, 세포질 과립 및 최초의 극지 체 무결성14,15. 게다가, 난소 세포 발달 잠재력은 나낭세포를 둘러싼 적수 세포의 외관 그리고 다짐 및 수와 상관관계가 있습니다. 체외 배양 시스템에서 적절한 난낭체에 매우 중요한 것은 또한 난퀴트-적혈구 세포의 유지보수가 적절한 상호작용및 세포골격안정성(16,,17,,18,,19)이다. 지금까지, 인간 COC 내의 체외 난십성장은20을입증되었다. 소 COC의 사용은 또한 살아있는 출생으로 귀착되었습니다. 이들은 미숙한 난소 여포에서 격리된 다음 14일 동안 배양되어 난소가 IVF절차(21)를겪을 수 있는 충분히 커졌다. 유사하게, 개코원숭이 개성적인 여포로부터 분리된 COC는, 체외 배양 후 IVM을 실시하여 정상적인 스핀들구조(22)를가진 대사 II 단계에 메이오시스를 재연할 수 있는 난모세포를 산출하였다. 그러나, 이 연구에서 저자는 그들을 비옥하 하려고 하지 않았다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과는 유사한 절차가 이러한 특정 포유류 종뿐만 아니라 성공적인 IVF 기술에 적합한 양질의 난동을 얻을 수 있어야 할 여포에서 얻은 인간의 적혈구 -oocyte 복합체에 적용 될 수 있음을 나타냅니다.
상기 설명된 결과는 2차원(2D) 시스템에서 난모세포가 배양되는 동안 기존의 IVM 프로토콜의 적용으로 얻어졌다. 2D 배양 시스템의 일상적인 절차는 미네랄 오일23,24와함께 적절한 배양 매체의 한 방울에 침지 된 난모세포를 다루고 있습니다., 체외 내 분피 배양 중 오일 오버레이는 액체 증발을 방지하여 배양시 적절한 pH 및 삼투압의 유지를 보장하는 역할을 한다고 가정합니다. 이러한 2D 배양 시스템은 성숙한 돼지난우세포(25)의87%까지도 얻을 수 있지만, 미네랄 오일 오버레이가 적절한 난소세포 개발에 필요한 지질 용해성 물질의 상당한 확산을 야기한다는 것이입증되었다(26) 또한, 스테로이드(황체호르몬 및 에스트로겐) 난모세포 배양 시 미네랄 오일로 확산되기 때문에, 돼지 난모세포의 개발 능력 달성의 핵 성숙 및 감소가 관찰되었다. 이로 인해 소수의 zygotes를 획득할 수 있으며, 이는 또한 배반물의 단계에 낮은 발달 능력을 특징으로 하며, 수령인동물(27)으로이송된 후 생존력이 떨어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, IVM 시술 후에 수신된 난모세포에서 유래된 배아의 발달 능력을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하여 복잡한 C와 함께 배양된 난모세포의 세포질 및 핵 성숙도를 달성하기 위한 최적의 조건을 조성함으로써, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하고 있다. 다양한 혁신적인 체외 배양 시스템은 지난28년,29년에개발되었다.28 이들은 세포의 자연적인 공간 조직을 유지하고 전통적인 2D 문화권에서 달성할 수 없는 문화 접시에서 그들의 평탄화를 피하기 위하여 디자인되었습니다. 배양된 COC의 구조적 및 기능적 활동은 다양한구획(30)의간격 접합을 통해 적절한 아키텍처와 방해받지 않는 통신의 유지보수에 의해 보장될 수 있다. 적수-오사이클 복합체의 체외 배양3D에 대한 바이오 스캐폴드의 적합성은 세포외 매트릭스(ECM; 콜라겐 및 히알루론산)31 또는 불활성 중합체(alginate)32의다양한 성분과 같은 천연 생체 물질을 사용하여 평가되었다. 여러 종에서 테스트 이러한 시도는 oocyte meiosis 재개 및 그들의 전체 능력의 성취의 측면에서 유망한 결과를 가져왔다33,,34,,35. 그러나 지금까지 돼지를 포함한 대형 국산 동물으로부터 분리된 COC 성숙에 적합한 3D 시스템은 개발되지 않았습니다.
이 작품은 돼지 COC의 3D 문화에 사용할 수있는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 프로토콜은 피브린 알기네이트 구슬(FAB)의 캡슐화를 설명합니다. FAB는 동기적 젤화 과정을 거치는 알기네이트 및 피브린 용액을 동시에 혼합하여 형성될 수 있다. 이 조합은 두 구성 요소 모두 매트릭스 강성에 기여하기 때문에 동적 기계적 환경을 제공합니다. 마우스 난소 여포 문화와 성숙(36)에대해 유사한 해결책이 이전에 사용되었습니다. 제시된 프로토콜의 경우, 알기네이트-피브린 네트워크의 조기 분해를 피하기 위해, 염화칼슘 용액의 농도가 적절히 높아 빠르고 안정적인 겔화 과정을 보장한다. 역동적인 기계적 환경은 COCs가 상주하고 크기가 증가하는 자연적인 여포 내 환경에서 이와 유사한 조건을 만듭니다. 또한, 이 작품은 이들 중간 의 한 방울에 일시 중단되고 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌) 분말 입자로 캡슐화되는 COC 3D 배양 시스템의 대표적인 결과를 보여 주며 미생물 반응기 (액체 대리석, LM)를 형성합니다. LM은 이전에 살아있는미생물(37),종양 스페로이드(38) 및 배아 줄기세포(39)의 성장을 지원하는 것으로39나타난 3D 생물반응기의 한 형태이다.38 LM은 양 오사이클배양(40)에도성공적으로 사용되었습니다. LM을 이용한 대부분의 실험에서, 생물반응기는 1 μm41의입자 크기로 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 분말 침대를 사용하여 제조하였다. 제시된 프로토콜은 FEP를 사용하며, 이는 플루오로폴리머 PTFE에 대한 조성 및 특성에서 매우 유사하다. 그러나 FEP는 PTFE보다 더 쉽고 부드럽고 특히 중요한 것은 매우 투명합니다.
두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 그(것)들은 또한 그들의 편평하고 간격 접합의 결과로 중단을 방지하고, oocyte와 주변 여포 세포 사이 그들의 기능적인 관계를 보존하여 COCs 3D 조직을 유지합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

생식 생물학에서 인공 수정 및 배아 전달 기술로 시작된 생명 공학 혁명은 체외 성숙 (IVM), 체외 수정 (IVF) 및 체세포에서 핵 전송에 의한 국산 동물의 복제와 같은 보조 생식 기술의 개발로 이어졌습니다. IVM은 특히 중요한 방법입니다. 상업적으로 중요하거나 멸종 위기에 처한 종의 생성 간격 의 감소, 체외 인간 생식에 관한 연구, 세포 치료를 위한 형질 전환 동물의 생산 과 같은 응용 분야에 대한 성숙하고 양질의 난모세포의 공급을 위한 플랫폼 기술입니다. 난모세포 품질이라는 용어에는 성숙을 완료하고 수정되어 건강한 자손이 될 수 있는 능력이 포함됩니다. 이것은 좋은 품질의 난모세포가 IVF 절차를 포함하여 성공적인 수정을 위해 가장 중요하다는 것을 의미합니다. 이것은 인간 난모세포의 뿐 아니라 또한 그밖 큰 포유류 종의 성장을 지원하는 믿을 수 있는 문화 방법을 개발하는 많은 어려움을 제기합니다. IVM의 첫 번째 단계는 난모세포의 체외 배양입니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 3D 문화에 대한 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째, 3D 모델 적혈구-oocyte 복합체(COC)는 피브린-알기네이트 비드 상호 침투 네트워크에 캡슐화되어 피브린과 알기네이트의 혼합물이 동시에 겔화된다. 두 번째 하나에서, COC는 액체 대리석 (LM)으로 정의 된 미생물 반응기를 형성하기 위해 응소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사 플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌의 합합체) 분말 입자로 캡슐화 된 중간 방울로 중단됩니다. 두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 또한 COC 3D 조직을 유지하여 수축및 갭 접합의 결과적으로 중단을 방지하여 난소 세포와 주변 여포 세포 사이의 기능적 관계를 보존합니다.

두 IVM 시스템을 모두 사용하는 COC에서, 과립 세포는 서로 단단히 부착하고, 복구 된 COC의 대부분은 적혈구 세포의 그대로 층을 가졌다(그림 1A, B). 추가적으로, 적수 세포의 상당한 비율이 유지되었다.
COC 생존가능성 분석에서 얻은 결과는 두 시스템이 시험관내 조건에서 3D에서 돼지 난우세포의 캡슐화를 위해 적용된 것이 최적의 성장 조건?...

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Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

돼지 난모세포의 캡슐화를 위한 이 프로토콜은 COC의 구형 조직을 유지할 수 있게 합니다. 이것은 난모세포와 주변 여포 세포 사이 간격 접합의 그들의 평평하고 그 결과로 중단을 방지합니다. 두 설명 된 프로토콜의 주요 장점은 사용자 친화적이며 oocyte 및 화학 세포 생존모두의 효과적인 제어를 허용하는 것입니다.두 배양 시스템은 생식 생물학의 기본 연구를 위한 귀중한 도구이며, 향상된 불임 처리를 위한 임상 관련성이 있을 수 있습니다. 또한 새로운 생명 공학 방법 개발 및 가축 개선을 위해 신청할 수 있습니다. 난소를 헹구고 HM 매체로 채워진 비커로 옮기고 후속 조작 중에 섭씨 38도의 인큐베이터에 보관하십시오.큰 돼지 여포에서 여포 액을 흡습하고 원심분리기는 실온에서 10 분 동안 100 배 G로 흡입합니다. 이어서, 0.2마이크로미터 멤브레인 모공 필터에 부착된 멸균 주사기를 사용하여 상체를 걸러내고, 음의 80°C로 동결한다. 중형 여포에서 COC를 분리하려면 2~3개의 난소를 HM으로 채워진 멸균 10센티미터 페트리 접시로 옮기습니다. 돌출난소 여포의 표면을 멸균 수술 번호 15 블레이드로 부드럽게 잘라 여포 액과 COC가 페트리 접시로 흘러 나갑니다.일회용 주사기에 부착된 28 게이지 바늘로 여포 내용을 흡인하고 다른 페트리 접시로 옮킨다. IVF 페트리 요리를 준비하려면 중앙 우물에 HM 1 밀리리터를 추가하고 외부 고리에 3~4방울의 HM을 배치합니다. 그런 다음 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리에 HM을 떨어 뜨리고 3~4회 간단히 헹구는 다.완료되면 개별적으로 중앙 우물로 옮기. 인큐베이터에 IVF 플레이트를 저장합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 혈소판 및 피브리노겐 솔루션을 준비합니다.시술 당일, 얼음에 피브리노겐 용액을 천천히 해동하고 사용하기 직전에 실온으로 가져옵니다. 0.5% 알자네이트 용액과 피브리노겐 용액을 1 대 1 비율로 혼합하여 최종 부피 2 밀리리터를 원량화하고 혼합물을 부드럽게 소용돌이시다. 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 필름의 얇은 스트립을 적용하여 배양 챔버를 복구합니다.파이펫 7.5 마이크로리터 는 분리 스페이서와 파라핀 필름 코팅 유리 슬라이드에 FA 혼합물의 7.5 마이크로 리터 방울, 두 행에 배치 8 ~ 10 방울을 배치. 마이크로파이프를 사용하여 3~5개의 COC를 FA 드롭의 중심으로 전송하고 최소 용량의 성숙 배지를 사용합니다. 각 FA 드롭 위에 7.5 마이크로리터의 혈소판을 추가하여 커버합니다.젤이 거의 즉각적으로 형성되기 때문에 혼합 할 필요가 없습니다. 이전에 준비된 유리 슬라이드로 인큐베이션 챔버를 덮은 다음 챔버를 거꾸로 뒤집어 촉촉한 필터 종이가 늘어선 100mm 페트리 접시에 놓습니다. 페트리 접시를 5~7분 동안 섭씨 38도의 이산화탄소5%에 넣습니다.인큐베이션 후 각 FA 캡슐을 성숙 배지 100마이크로리터를 함유한 96웰 플레이트의 우물로 옮기다. 매 2일마다 매체의 절반을 신선한 미리 평형된 성숙 매체로 교체하십시오. 이미지 COC는 10배배율로 반전된 광 현미경을 사용하고 있다.4일 동안 COC를 배양한 후, 우물에서 성숙 배지를 제거하고 DMEM에서 밀리리터 대지 용해물당 10개의 국제 유닛 100마이크로리터를 추가합니다. 배양판을 인큐베이터에 25~30분 간 둡니다. 용존 된 캡슐에서 COC를 제거합니다.DMEM에서 여러 번 세척한 다음 PBS가 함유된 IVF 접시의 내부 링으로 옮겨 넣습니다. 30mm 페트리 접시에 FEP 파우더 5그램을 신는다. FEP 분말에 3~5개의 COC를 함유한 성숙 배지의 단일 액자를 분배한다.입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 액체 대리석을 형성하도록 원형 동작으로 부드럽게 회전하거나 LM. 60mm IVF 페트리 접시를 몇 개 준비하고, 외부 고리에 멸균 물의 3 ~4 밀리리터를 추가하여 습도 챔버를 만듭니다. 1000 마이크로리터 파이펫으로 형성된 LM을 집어 중앙 우물에 놓습니다.5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 38도에서 4일간 구슬을 배양합니다. 매체를 변경하려면 각 LM에 성숙 배지 30 마이크로리터를 적용하여 확산됩니다. 대리석 내용이 녹으면 바이오 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 성숙 매체 한 방울로 옮기습니다.성숙 배지에서 3~4개의 세차후, COC를 신선한 배지 30마이크로리터와 함께 FEP 파우더 침대에 옮겨 보세요. 분말 입자가 액체 낙하의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전시키고 LM을 IVF 페트리 접시로 옮킵니다. 두 시험관 성숙 시스템은 서로 단단히 부착된 과립세포와 적혈구의 손상되지 않은 층을 가진 COC를 생산하였다.COC 생존 가능성 분석은 두 캡슐화 시스템에서 최적의 성장 조건을 달성했다는 것을 확인했습니다. 두 그룹 모두에서 높은 생존성 난모세포 사이트만 관찰되었습니다. 난모세포는 전염 전자 현미경으로 이미지되었다.미토콘드리아는 고르게 분포되어 껍질 모양이 있었다. 그들 중 극소수만이 길었고, 그들의 군집은 산발적으로 관찰되었다. 내피 성 망상은 미토콘드리아와 연관되었거나 난소 세포질에서 무료였습니다.액체 방울은 작고 어둡고 둥근 구조물로 나타났으며 골기 장치는 팽창 된 시스테네로 나타났습니다. 배양실에서 배양판으로 FA 캡슐을 옮길 때와 형식 LM을 집어 들고 IVF 페트리 접시로 옮길 때 정확하고 주의해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

연구

생물학

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

암세포의 PuraMatrix의 캡슐화

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...