Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Forfatterne er veldig takknemlige for: dr Waclaw Tworzydlo (Institutt for utviklingsbiologi og virvelløse morfologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for tekniske fasiliteter i TEM; til Ms. Beata Snakowska (Institutt for endokrinologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for teknisk assistanse; til Institutt for cellebiologi og avbildning, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dette arbeidet ble støttet av stipend 2018/29/N/NZ9/00983 fra National Science Centre Poland.

Følgende prosedyrer ble godkjent av dyrevelferdskomiteen ved Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning ved Jagiellonian University.
1. Isolering av svin cumulus-oocyte komplekser
<ol><li>For å samle materiale for isolering av eggstokkfollikler, forbruker svineovaries fra prepubertal gilts (ca 6-7 måneders alder, veier 70 til 80 kg) på et lokalt slakteri. Velg ca 20 gris eggstokkene fra 10 dyr for COCs isolasjon i hvert eksperiment. MERK: Forutsatt at hver eggstokk gir 3–5 foll...

Evnen til å opprettholde in vitro vekst ikke bare av oocyte, men også av cumulus celler rundt den og samtidig støtte modning er svært viktig for vellykket assistert reproduktive teknologier og for å fremme forståelsen av somatiske celle / oocyte interaksjoner spesielt i arter som gjennomgår langvarig follikulær vekst som mennesker eller griser. Kontinuerlig forbedrede IVM teknikker blir nyttig verktøy for å bevare reproduktive alternativer i tilfeller av polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ovariesvikt,...

Utviklingen av ulike kultursystemer, inkludert tredimensjonale (3D), har som mål å gi optimale forhold for vekst og modning av oocytter isolert fra folliklene selv i de tidligste utviklingsstadiene. Dette er av stor betydning for assisterte reproduktive teknikker (ART), spesielt i lys av det økende antall kvinner som sliter med ufruktbarhet etter kreftbehandling1. Modning av oocytter i in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletablert teknikk som hovedsakelig brukes til in vitro embryogenerering med det formål å reproduksjonav husdyr 2. Men i de fleste pattedyrarter, selv om høye forekomster av modning av cumulus-oocyte komplekser (COCer) kan oppnås (område 60 til 90 %)3, er deres utviklingskompetanse fortsatt utilstrekkelig til behovene. Dette skyldes at utviklingen av zygotene oppnådd på en slik måte, selv opp til blastocyststadiet er lav, og etter overføring til surrogatdyr reduseres deres levedyktighet til sikt. Derfor er det behov for å øke utviklingskompetansen til embryoer hentet fra oocytter som ble utsatt for IVM-prosedyren4. Derfor blir nyemodningsmedier 5 utviklet og ulike perioder med in vitrokultur testes6,7 sammen med tilskudd av kulturmedier med ulike vekstfaktorerog molekyler 8,9.
Det første trinnet i et komplett IVM-system er å skape optimale forhold for bærekraftig vekst av oocytter under in vitro-kulturen. Oocyte veksten er en av de spesifikke indikatorene på oocyte evne til å gjenoppta meiosis10,11. I tillegg må et passende oocyte in vitro kultursystem være i stand til å støtte sin kjernefysiske modning og cytoplasmatisk differensiering12. Morfologien til cumulus-oocyte-komplekset er en annen viktig indikator som brukes i ART-klinikker for å velge den beste oocytten for påfølgende trinn av in vitro befruktning (IVF) prosedyre hos mennesker og husdyr12,13. Blant morfologiske egenskaper av COCs vurdert er: oocyte diameter, dens cytoplasma granulering og den første polare kroppen integritet14,15. Dessuten er oocyte utviklingspotensialet korrelert med utseendet og komprimeringen av cumulus celler og antall lag rundt oocyte. Svært viktig for riktig oocyte in vitro kultursystem er også vedlikehold av oocyte-cumulus celler riktig interaksjoner og cytoskeleton stabilitet16,,17,,18,19. Så langt har in vitro oocyte vekst innen menneskelige COCer blitt demonstrert20. Bruken av ku-COCer resulterte også med levendefødte. Disse ble isolert fra umodne eggstokksekkene og deretter dyrket i 14 dager til oocytten var tilstrekkelig stor til å gjennomgå IVF-prosedyren21. På samme måte ga COCer isolert fra bavian antral follikler, utsatt for IVM etter in vitro kultur oocytes i stand til å reinitiere meiose til metaphase II-scenen med en normal vises spindelstruktur22. Men i denne studien prøvde forfatterne ikke å befrukte dem. Likevel indikerer slike resultater at en lignende prosedyre kan brukes ikke bare på disse spesielle pattedyrarter, men også til menneskelige cumulus-oocyte komplekser hentet fra follikler hva som bør tillate å få oocytes av god kvalitet egnet for en vellykket IVF teknikk.
De ovenfor beskrevne resultatene ble oppnådd ved bruk av konvensjonelle IVM-protokoller der oocytter ble dyrket i todimensjonale (2D) systemer. Rutineprosedyren i 2D kultursystemer dekker oocytes, nedsenket i en dråpe av en passende kultur media, med mineralolje23,24. Det antas at et oljeoverlegg under in vitro oocyte kultur tjener til å forhindre flytende fordampning, og dermed sikre vedlikehold av riktig pH og osmotisk trykk i kulturen. Selv om et slikt 2D-kultursystem gjør det mulig å oppnå, selv opptil 87% av modne grisoocytes25,har det blitt bevist at mineraloljeoverlegget forårsaker betydelig diffusjon av lipidløselige materialer som er nødvendige for riktig oocytes utvikling26. I tillegg, på grunn av steroider (progesteron og østrogener) diffusjon i mineralolje under oocyte kultur, en forsinkelse av kjernefysisk modning og reduksjon i utviklingskompetanse oppnåelse av gris oocytes ble observert. Dette kan føre til å oppnå et lite antall zygotes, som i tillegg er preget av lav utviklingskapasitet til stadium av blastocyst og ved dårlig levedyktighet etter overføring til mottaker dyr27. Derfor gjøres det forsøk på å øke utviklingskompetansen til embryoer avledet fra oocytter mottatt etter IVM-prosedyren, ved å skape optimale forhold for å oppnå både cytoplasmatisk og kjernefysisk modenhet av oocytes dyrket sammen med CCer som komplekser, spesielt ved hjelp av tredimensjonale (3D) systemer. Ulike innovative 3D in vitro kultursystemer har blitt utviklet i de siste totiårene 28,29. Disse ble designet for å opprettholde den naturlige romlige organiseringen av celler og for å unngå deres utflating i kulturretter hva som ikke kan oppnås i de tradisjonelle 2D-kulturene. Den strukturelle og funksjonelle aktiviteten til kultiverte COCer kan sikres ved vedlikehold av riktig arkitektur og uforstyrret kommunikasjon gjennom gap-veikryss mellom ulike rom30. Egnetheten av bio-stillas for 3D in vitro kultur av cumulus-oocyte komplekser har blitt evaluert ved hjelp av naturlige biomaterialer som ulike komponenter i den ekstra cellulære matrisen (ECM; kollagen og hyaluronsyre)31 eller inert polymerer (alginat)32. Disse forsøkene testet i flere arter ga lovende resultater i form av oocyte meiosis gjenopptakelse og oppnåelse av sin fulle kompetanse33,34,35. Men så langt er det utviklet ikke noe 3D-system egnet for COCer-modning isolert fra store husdyr, inkludert griser.
Dette arbeidet beskriver to protokoller som kan brukes til 3D-kulturen av svine-COCer. Den første protokollen beskriver innkapsling i fibrin-alginate perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding av en alginat og fibrin løsning, som gjennomgår en synkron gelasjonsprosess. Denne kombinasjonen gir et dynamisk mekanisk miljø fordi begge komponentene bidrar til matrisestivhet. En lignende løsning har tidligere blitt brukt for mus ovarian follicle kultur og modning36. I tilfelle av den presenterte protokollen, for å unngå for tidlig nedbrytning av alginat-fibrin-nettverket, brukes passende høyere konsentrasjoner av kalsiumkloridoppløsning, noe som sikrer en rask og stabil gelasjonsprosess. Det dynamiske mekaniske miljøet skaper forhold som ligner på disse i det naturlige intra-follikulære miljøet der COCer bor og øker i størrelse. I tillegg viser arbeidet representative resultater av COCs 3D-kultursystemer, der disse er suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroetylen) pulverpartikler, for å danne mikrobioreaktorer (Flytende klinkekuler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor som tidligere har vist seg å støtte blant annet vekst av levende mikroorganismer37, tumorsfæroider38 og embryonale stamceller39. LMs har også blitt brukt for sau oocyte kultur40. I de fleste eksperimenter ved hjelp av LMs ble bioreaktorer tilberedt ved hjelp av polytetrafluoretylen (PTFE) pulverseng med partikkelstørrelse på 1 μm41. Den presenterte protokollen bruker FEP, som er svært lik i sammensetning og egenskaper til fluoropolymer ptfe. Men FEP er lettere formbar og mykere enn PTFE og det som er spesielt viktig, det er svært gjennomsiktig.
Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og bevarer deres funksjonelle forhold mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

I reproduktiv biologi førte bioteknologirevolusjonen som begynte med kunstig inseminasjon og embryooverføringsteknologi til utvikling av assisterte reproduksjonsteknikker som oocyte in vitro modning (IVM), in vitro befruktning (IVF) og kloning av husdyr ved kjernefysisk overføring fra somatisk celle. IVM er metoden spesielt av betydning. Det er plattformteknologien for levering av modne, god kvalitet oocytes for applikasjoner som reduksjon av generasjonsintervallet i kommersielt viktige eller truede arter, forskning om in vitro menneskelig reproduksjon, og produksjon av transgene dyr for celleterapi. Begrepet oocyte kvalitet inkluderer sin kompetanse til å fullføre modning, befruktes, og dermed resulterer i sunne avkom. Dette betyr at oocytes av god kvalitet er avgjørende for vellykket befruktning inkludert IVF prosedyrer. Dette utgjør mange vanskeligheter med å utvikle en pålitelig kulturmetode som ville støtte vekst ikke bare av menneskelige oocytter, men også av andre store pattedyrarter. Det første trinnet i IVM er in vitro kulturen av oocytes. Dette arbeidet beskriver to protokoller for 3D-kulturen av svinoocytter. I den første, 3D-modellen cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating nettverk, der en blanding av fibrin og alginat er gelled samtidig. I den andre er COCer suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en komolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroethylene) pulverpartikler for å danne mikrobioreaktorer definert som flytende klinkekuler (LM). Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og dermed bevare det funksjonelle forholdet mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.

I COCer ved hjelp av begge IVM-systemene holdt granulosacellene seg tett til hverandre, og de fleste av de gjenopprettede COCene hadde intakte lag med cumulusceller (figur 1A, B). I tillegg ble en betydelig andel av cumulus-cellene beholdt.
Resultatene fra COCs levedyktighetsanalyse bekreftet at begge systemene søkte om innkapsling av svinoocytter i 3D in vitro-forhold sikret optimale vekstforhold (figur 2). I begge ...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Presentert her er to protokoller for innkapsling av svinoocytter i 3D kulturforhold. I den første, cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i fibrin-alginat perler. I den andre er de omsluttet av fluorerte etylenpropylenpulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemene sikrer optimale forhold for å opprettholde sin 3D-organisasjon.

Proteolytisk degradert alginat hydrogeler og hydrofobe mikrobioreaktorer for svin oocyte innkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Denne protokollen for innkapsling av svinoocytter gjør det mulig å opprettholde sfærisk organisering av COCer. Dette forhindrer deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler. De viktigste fordelene med de to beskrevne protokollene er som er brukervennlige og gir effektiv kontroll over både oocyte og kjemo celle overlevelse.Begge kultursystemene er verdifulle verktøy for grunnleggende forskning i reproduktiv biologi, og kan ha klinisk relevans for forbedret ufruktbarhet behandling. De kan også brukes til å utvikle nye bioteknologimetoder og for husdyrforbedring. Etter skylling eggstokkene, overføre dem til et beger fylt med HM medium og lagre dem i en inkubator ved 38 grader Celsius under alle påfølgende manipulasjoner.Aspirer follikulær væske fra store svinefollikler og sentrifuger den ved 100 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter filtrerer du supernatanten ved hjelp av en steril sprøyte festet til et 0,2-mikrometer membranpofilter, og klikker fryse det ved negative 80 grader Celsius. For å isolere COCene fra mellomstore follikler, overfør to til tre eggstokkene til en steril 10 centimeter petriskål fylt med HM. Skjær forsiktig overflaten av de utstående ovariefollikler med et sterilt kirurgisk nummer 15 blad, noe som vil føre til at follikulær væske og COC-ene strømmer ut i petriskålen.Aspirer follikulært innhold med en 28 gauge nål festet til en engangssprøyte, og overfør det til en annen petriskål. For å forberede IVF Petri retter, legg til en milliliter HM til de sentrale brønnene, og plasser tre til fire dråper HM i de ytre ringene. Bruk deretter en polykarbonatmikropipette til å flytte de uskadede COCene til dråper HM i de ytre ringene, og skyll dem kort tre til fire ganger.Når du er ferdig, individuelt overføre dem til den sentrale brønnen. Oppbevar IVF-platene i inkubatoren. Forbered trombin- og fibrinogenløsninger som beskrevet i tekstmanuskriptet.På prosedyrens dag tiner du sakte fibrinogenløsningen på is, og bringer den til romtemperatur rett før bruk. Bland 0,5% alginatløsning og fibrinogenløsningen med ett til ett forhold for et endelig volum på to milliliter og virvle blandingen forsiktig. Reparer inkubasjonskamre ved å bruke tynne strimler av parafinfilm til glassmikroskopsklier.Pipette 7,5 mikroliter dråper av FA-blandingen på parafinfilmbelagt glasssklie med skille avstandsslyst, plassere åtte til 10 dråper arrangert i to rader. Bruk en mikropipette til å overføre tre til fem COCer til midten av FA-fallet, sammen med et minimum volum av modningsmedium. Tilsett 7,5 mikroliter trombinoppløsning på toppen av hver FA-dråpe for å dekke den.Det er ikke nødvendig å blande dem fordi gelen dannes nesten øyeblikkelig. Dekk inkubasjonskammeret med en tidligere forberedt glasssklie, snu deretter kammeret opp ned og legg det i en 100-millimeter petriskål foret med fuktig filterpapir. Sett petriskålen i 5% karbondioksid ved 38 grader Celsius inkubator i fem til syv minutter.Etter inkubasjon, overfør hver FA-kapsel til en brønn på en 96-brønnsplate som inneholder 100 mikroliter modningsmedium. Annenhver dag erstatter du halvparten av mediet med et friskt forhåndsutjevn modningsmedium. Bilde COC bruker et invertert lysmikroskop ved 10x forstørrelse.Etter å ha kultivert COCene i fire dager, fjern modningsmediet fra brønnene og tilsett 100 mikroliter på 10 internasjonale enheter per milliliter algenatlylat i DMEM. La kulturplaten stå i inkubatoren i 25 til 30 minutter. Fjern COCene fra de oppløste kapslene.Vask dem i DMEM flere ganger, og overfør dem deretter til den indre ringen på en IVF-tallerken som inneholder PBS. Lag en seng på fem gram FEP pulver i en 30 millimeter petriskål. Fordel en enkelt dråpe modningsmedium som inneholder tre til fem COCer på FEP-pulveret.Roter platen forsiktig i en sirkulær bevegelse for å sikre at partiklene helt dekker overflaten av væskedråpen og danner flytende klinkekuler, eller LMs. Forbered flere 60 millimeter IVF Petri retter, og tilsett tre til fire milliliter sterilt vann til de ytre ringene for å skape et fuktighetskammer. Plukk opp den dannede LM med en 1000 mikroliter pipette og legg den i den sentrale brønnen.Inkuber klinkekulene i fire dager ved 38 grader Celsius i en fem prosent karbondioksidinkubator. For å endre mediet, bruk 30 mikroliter modningsmedium på hver LM, noe som vil føre til at det sprer seg. Når marmorinnholdet oppløses, overfører du COCene som frigjøres fra bioreaktoren til en dråpe friskt modningsmedium i petriskålen.Etter tre til fire vasker i modningsmediet, overfører du COCene, sammen med 30 mikroliter friskt medium, på FEP pulverseng. Roter platen forsiktig i en sirkulær bevegelse for å sikre at pulverpartiklene helt dekker overflaten av væskedråpen og danner en ny LM.Deretter overfører LM til IVF Petri-parabolen. Begge in vitro modningssystemer produsert COCer med granulosis celler som var tett festet til hverandre og intakte lag av cumulus celler.COC levedyktighetsanalyse bekreftet at optimale vekstforhold ble oppnådd i begge innkapslingssystemene. I begge gruppene ble det bare observert områder med høy levedyktighet. Oocytes ble avbildet med overføring elektron mikroskopi.Mitokondriene var jevnt fordelt og hadde en skalllignende form. Bare noen få av dem var langstrakte og deres klynger ble sporadisk observert. Endoplasmaisk reticulum var enten forbundet med mitokondrier eller fri i oocyte cytoplasma.Flytende dråper dukket opp som små, mørke, runde strukturer, og Golgi apparater ble dukket opp med dilatert sisterne. Det er viktig å være presis og forsiktig når du overfører FA-kapsler fra inkubasjonskammer til kulturplater og når du plukker opp og overfører format LM til IVF Petri-parabolen.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatisert Hydrofobisk Samspill Kromatografi Kolonne markering for bruk i proteinrensing

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Enkel oocytter bisulfite Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Fremstilling av DNA-kryssbundet polyakrylamid Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrikasjon av amyloid-β-sekresjon alginat Mikroperler for bruk i modellering Alzheimers sykdom

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...