Name: proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Författarna är mycket tacksamma för att: dr Waclaw Tworzydlo (Institutionen för utvecklingsbiologi och ryggradslös morfologi, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University) för tekniska anläggningar i TEM; till Ms. Beata Snakowska (Institutionen för endokrinologi, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University) för tekniskt bistånd; till institutionen för cellbiologi och bildbehandling, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Detta arbete stöddes av bidrag 2018/29/N/NZ9/00983 från National Science Centre Poland.

Följande förfaranden godkändes av djurskyddskommittén vid Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning vid Jagiellonian University.
1. Isolering av komplex av svin cumulus-oocyte
<ol><li>För att samla in material för isolering av äggstocksfolliklar, punktskatteosedoarries från prepubertala gylter (cirka 6-7 månaders ålder, väger 70 till 80 kg) på ett lokalt slakteri. Välj cirka 20 grisovaries från 10 djur för COCs isolering i varje experiment. NOTERA: Om man antar att...

Förmågan att upprätthålla in vitro-tillväxt inte bara av äggcellen utan även av cumulusceller som omger den och samtidigt stödja dess mognad är ytterst väsentlig för den framgångsrika assisterade reproduktionstekniken och för att främja förståelsen av somatiska cell/oocyte interaktioner speciellt hos arter som genomgår långvarig follikulär tillväxt såsom människor eller svin. Kontinuerligt förbättrad IVM tekniker blir användbart verktyg för att bevara reproduktiva alternativ i fall av polycystis...

Utvecklingen av olika kultursystem, inklusive tredimensionella (3D) sådana, syftar till att ge optimala förutsättningar för tillväxt och mognad av äggceller isolerade från folliklar även i tidigaste utvecklingsstadier. Detta är av stor betydelse för assisterad reproduktionsteknik (ART), särskilt med tanke på det ökande antalet kvinnor som kämpar med infertilitet efter cancerbehandling1. Mognad av oocyter i in vitro-förhållanden (IVM) är redan en väletablerad teknik som huvudsakligen används för embryogenerering in vitro för ändamålet med boskapsreproduktion2. Hos de flesta däggdjursarter, även om höga mognadstal av komplex av cumulus-oocyte (COCs) kan uppnås (intervall 60 till 90 %)3, är deras utvecklingskompetens dock fortfarande otillräcklig för behoven. Detta beror på att utvecklingen av zygoterna som erhålls på ett sådant sätt även upp till blastocyststadiet är låg och efter överföringen in i surrogatdjur deras livskraft att sikta minskas. Följaktligen finns det ett behov av att öka utvecklingskompetensen hos embryon som erhållits från oocyter som utsattes för IVM-förfarandet4. Därför är nya mognad media5 håller på att utformas och olika perioder av in vitro-kultur testas6,7 tillsammans med tillskott av kultur medier med olika tillväxtfaktorer och molekyler8,9.
Det första steget i alla kompletta IVM-system är att skapa optimala förutsättningar för hållbar tillväxt av äggceller under in vitro-kulturen. Ocyttillväxten är en av de specifika indikatorerna på äggcellens förmåga att återuppta meiosis10,11. Dessutom måste ett lämpligt oocyte in vitro-odlingssystem kunna stödja dess kärnmognad och cytoplasmatiska differentiering12. Morfologin i cumulus-oocyte komplexet är en annan viktig indikator som används i ART kliniker för att välja ut den bästa äggcell för efterföljande steg av in vitro-fertilisering (IVF) förfarande hos människor och boskap12,13. Bland morfologiska egenskaper COCs beaktas är: den oocyte diameter, dess cytoplasma granulation och den första polarkroppen integritet14,15. Förutom, den oocyte utvecklingspotential är korrelerad till utseende och kompaktering av cumulus celler och antalet av deras lager som omger äggcellen. Mycket viktigt för lämplig oocyte in vitro-odling systemet är också upprätthållandet av oocyt–cumulus celler korrekt interaktioner och cytoskelett stabilitet16,17,18,19. Hittills har in vitro-oocytetillväxt inom humana COCs visats20. Användningen av ko COCs resulterade också med levande födda. Dessa isolerades från omogna äggstocksfolliklar och sedan odlade i 14 dagar tills äggcellen var tillräckligt stor för att genomgåIVF-förfarandet 21. På samma sätt gav COCs isolerade från babian antrala folliklar, utsätts ivm efter in vitro-kultur äggceller som kan återitiera meios till metafas II-stadiet med en normal visas spindel struktur22. Men i denna studie författarna inte försöka befrukta dem. Icke desto mindre tyder sådana resultat på att ett liknande förfarande skulle kunna tillämpas inte bara på dessa särskilda däggdjursarter utan även på humana cumulus-oocytekomplex som erhållits från folliklar vad som borde göra det möjligt att erhålla oocyter av god kvalitet som lämpar sig för en framgångsrik IVF-teknik.
De ovan beskrivna resultaten erhölls med tillämpning av konventionella IVM protokoll under vilka äggceller var odlade i tvådimensionella (2D) system. Rutinförfarandet i 2D-odlingssystem täcker oocyter, nedsänkt i en droppe av en lämplig kultur media, med mineralolja23,24. Det antas att en olja overlay under in vitro-oocyte kultur tjänar till att förhindra vätskeavdunstning, vilket säkerställer upprätthållandet av korrekt pH och osmotiska trycket i kulturen. Även om en sådan 2D-odling system gör det möjligt att erhålla, även upp till 87% av mogna gris oocyter25, har det bevisats att mineraloljan overlay orsakar betydande diffusion av lipidlösliga material som är nödvändiga för korrekt oocyter utveckling26. Dessutom, på grund av steroider (progesteron och östrogener) diffusion i mineraloljan under äggcell kultur, en försening av nukleära mognad och minskning av utvecklingsmässiga kompetens uppnåendet av gris oocytes observerades. Detta kan resultera i att få ett litet antal zygoter, som dessutom kännetecknas av låg utvecklingskapacitet till scenen i blastocyst och av dålig livskraft efter överföring till mottagande djur27. Därför görs försök att öka utvecklingsmässiga kompetensen hos embryon som härrör från äggceller som mottagits efter IVM förfarande, genom att skapa optimala förutsättningar för att uppnå både cytoplasmatiska och nukleära mognad av äggceller odlade tillsammans med CCs som komplex, särskilt med hjälp av tredimensionella (3D) system. Olika innovativa 3D in vitro-kultur system har utvecklats under de senaste två decennierna28,29. Dessa var utformade för att upprätthålla den naturliga rumsliga organisationen av celler och för att undvika att de plattas i kulturrätter vad som inte kan uppnås i de traditionella 2D-kulturerna. Den strukturella och funktionella aktiviteten hos odlade COCs kan säkerställas genom upprätthållandet av deras rätta arkitektur och ostörda kommunikation genom gap-korsningar mellan olikafack 30. Bio-byggnadsställningars lämplighet för 3D in vitro-odling av cumulus–oocytekomplex har utvärderats med hjälp av naturliga biomaterial som olika komponenter i den extracellulära matrisen (ECM; kollagen och hyaluronsyra)31 eller inerta polymerer (alginat)32. Dessa försök som testades i flera arter förde lovande resultat i form av oocyte meios återupptagande och uppnåendet av deras fulla kompetens33,34,35. Hittills har dock inget 3D-system som är lämpligt för KOL-mognad som isolerats från stora husdjur, inklusive svin, utvecklats.
Detta arbete beskriver två protokoll som kan användas för 3D-kulturen av porcine COCs. Det första protokollet beskriver inkapsling i fibrin-alginatpärlor (FAB). FAB kan bildas genom samtidig blandning av en alginat- och fibrinlösning, som genomgår en synkron gelationsprocess. Denna kombination ger en dynamisk mekanisk miljö eftersom båda komponenterna bidrar till matrisstyvhet. En liknande lösning har använts tidigare för mus äggstocksfollikel kultur och mognad36. När det gäller det presenterade protokollet, för att undvika för tidig nedbrytning av alginat-fibrinnätverket, används lämpligt högre koncentrationer av kalciumkloridlösning, vilket garanterar en snabb och stabil gelationsprocess. Den dynamiska mekaniska miljön skapar förhållanden som liknar dessa i den naturliga intra-follicular miljö där COCs bor och öka i storlek. Dessutom visar arbetet representativa resultat av COCs 3D-odlingssystem, där dessa är suspenderade i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropen (FEP; en samofer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar, för att bilda mikrobioreaktorer (Liquid Marbles, LM). LM är en form av 3D bioreaktor som tidigare har visat sig stödja, bland andra, tillväxt av levande mikroorganismer37, tumör sfäroider38 och embryonala stamceller39. LMs har också framgångsrikt använts för får oocyte kultur40. I de flesta experiment med hjälp av 1:ler framställdes bioreaktorer med hjälp av polytetrafluoreten (PTFE) pulverbädd med partikelstorlek på 1 μm41. Det presenterade protokollet använder FEP, som är mycket lik i sammansättning och egenskaper till fluorpolymererna PTFE. Men FEP är lättare formbar och mjukare än PTFE och vad som är särskilt viktigt, det är mycket transparent.
Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras tillplattande och därav följande störningar av gap korsningar, bevara deras funktionella relation mellan äggcellen och omgivande follikulära celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="761">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">General</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DMEM/F12 (500ml)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td style="width:204px;">Handling and Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">FCS (100 ml)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>16140063</td>
			<td style="width:204px;">10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PBS (1x, pH 7.4) 500ml</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>600232</td>
			<td style="width:204px;">1x final concentration. Other brand can be use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Maturation Medium</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">hCG (1 VIAL of 10 000 U)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">PMSG</td>
			<td style="width:139px;">BioVendor</td>
			<td>RP1782721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrin-alginate beads</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">A1603</td>
			<td>(Step 2.11.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9326-150UN</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C5670</td>
			<td>(Step 2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Fibrinogen (250mg)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">F3879</td>
			<td>(Step 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sodium Alginate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td style="width:204px;">(Step 2.3) use for alginate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Liquid Marble</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">FEP</td>
			<td style="width:139px;">Dyneon GmbH 3M AdMD</td>
			<td style="width:162px;">A-66670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Morphological examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:104px;width:256px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td style="width:204px;">(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:139px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultrastructure examination</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">G5882</td>
			<td style="width:204px;">2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LR White resin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">L9774</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">M9140</td>
			<td>(Step 4.2.5.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">O5500</td>
			<td>(Step 4.2.3.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:162px;">C0250</td>
			<td style="width:204px;">Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:139px;">POCH</td>
			<td>868540111</td>
			<td>(Step 4.2.4.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specific instruments, tools</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">30 mm Pteri dish</td>
			<td style="width:139px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">60 mm IVF Petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td>353653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ez-Tip</td>
			<td style="width:139px;">RI Life Sciences</td>
			<td style="width:162px;">8-72-4155/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Heating Table</td>
			<td style="width:139px;">SEMIC</td>
			<td style="width:162px;"></td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Incubator</td>
			<td style="width:139px;">Panasonic</td>
			<td style="width:162px;">MCO-170AIC-PE</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile petri dish (10 cm)</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>704002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile syringe filters with 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:139px;">GOOGLAB SCIENTIFIC</td>
			<td>GB-30-022PES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thermos</td>
			<td style="width:139px;">Quechua</td>
			<td>5602589</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteolytically degraded alginate hydrogels and hydrophobic microbioreactors for porcine oocyte encapsulation

Inom reproduktionsbiologin ledde den biotekniska revolution som började med artificiell insemination och embryoöverföringsteknik till att det blev så att man kunde utveckla assisterad reproduktionsteknik som oocyte in vitro-mognad (IVM), provrörsbefruktning (IVF) och kloning av tamdjur genom kärnvapenöverföring från somatisk cell. IVM är metoden särskilt av betydelse. Det är plattformstekniken för leverans av mogna, högkvalitativa oocyter för tillämpningar som minskning av generationsintervallet i kommersiellt viktiga eller hotade arter, forskning om human reproduktion in vitro, och produktion av transgena djur för cellterapier. Termen oocyte kvalitet omfattar dess kompetens att slutföra mognad, befruktas, vilket resulterar i friska avkomma. Detta innebär att äggceller av god kvalitet är av största vikt för framgångsrik befruktning inklusive IVF förfaranden. Detta medför många svårigheter att utveckla en tillförlitlig odlingsmetod som skulle stödja tillväxten inte bara av mänskliga oocyter utan också av andra stora däggdjursarter. Det första steget i IVM är in vitro-kulturen av oocyter. Detta arbete beskriver två protokoll för 3D-kulturen av porcina oocytes. I den första, 3D-modell cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i en fibrin-alginate bead interpenetrating nätverk, där en blandning av fibrin och alginat är gelled samtidigt. I den andra är COCs upphängda i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar för att bilda mikrobioreaktorer som definieras som Liquid Marbles (LM). Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras utplaning och därav följande störningar av gap korsningar, och därmed bevara funktionella förhållandet mellan äggcell, och omgivande follikulära celler.

I COCs som använder båda IVM-systemen, granulosacellerna vidhäftade tätt till varandra, och de flesta av de återvunna COCs hade intakta lager av cumulus celler (Figur 1A,B). Dessutom behölls en betydande andel av cumuluscellerna.
De resultat som erhölls från KOL-analys genom lönsamhet bekräftade att båda systemen som tillämpades för inkapsling av porcina oocyter i 3D-in vitro-förhållanden säkerställde optimala tillväxtförhållan...

Watch this Scientific Journal Video about Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation at JoVE.com

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Presenteras här är två protokoll för inkapsling av porcin oocytes i 3D-kultur villkor. I den första, cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i fibrin-algininate pärlor. I den andra är de inneslutna med fluorerade etylenpropylenpulverpartiklar (mikrobioreaktorer). Båda systemen säkerställer optimala förutsättningar för att behålla sin 3D-organisation.

Proteolytiskt nedbrutna Alginate Hydrogels och Hydrophobic Mikrobioreaktorer för Porcine Oocyte Inkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Detta protokoll för inkapsling av porcin oocytes gör det möjligt att upprätthålla sfärisk organisation av COCs. Detta förhindrar deras tillplattande och därav följande störningar av gap korsningar mellan äggcellen och omgivande follikulära celler. De viktigaste fördelarna med de två beskrivna protokollen är som är användarvänliga och möjliggör effektiv kontroll av både oocyte och cellgiftscellens överlevnad.Båda kultursystemen är värdefulla verktyg för grundforskning inom reproduktionsbiologi, och kan ha klinisk relevans för förbättrad infertilitetsbehandling. De kan också tillämpas för att utveckla nya bioteknikmetoder och för att förbättra boskapen. Efter att ha sköljt äggstockarna, överför dem till en bägare fylld med HM-medium och förvara dem i en inkubator vid 38 grader Celsius under alla efterföljande manipulationer.Aspirera follikulärvätskan från stora svin folliklar och centrifug den på 100 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur. Filtrera sedan supernatanten med hjälp av en steril spruta som är fäst vid ett 0,2-mikrometermembranporfilter och snäppfrys den vid minus 80 grader Celsius. För att isolera COCs från medelstora folliklar, överföra två till tre äggstockar till en steril 10 centimeter Petriskål fylld med HM. Skär försiktigt ytan av de utskjutande äggstocksfollarna med ett sterilt kirurgiskt nummer 15 blad, vilket kommer att orsaka follikulär vätska och COCs att flöda ut i Petri-skålen.Aspirera follikulära innehållet med en 28 gauge nål fäst vid en engångsspruta, och överföra den till en annan Petriskål. För att förbereda IVF Petri-rätterna, tillsätt en milliliter HM till de centrala brunnarna och placera tre till fyra droppar HM i de yttre ringarna. Använd sedan en polykarbonat mikropipette för att flytta oskadade COCs till droppar AV HM i de yttre ringarna, och kort skölj dem tre till fyra gånger.När du är klar, individuellt överföra dem till den centrala brunnen. Förvara IVF-plattorna i inkubatorn. Bered trombin- och fibrinogenlösningar enligt beskrivningen i textmanuskriptet.På dagen för förfarandet, långsamt tina fibrinogen lösningen på is, och föra den till rumstemperatur precis före användning. Blanda 0,5%alginatlösning och fibrinogenlösningen vid ett ett till ett-förhållande för en slutvolym på två milliliter och vortexa försiktigt blandningen. Reparation inkubationskammare genom att tillämpa tunna remsor av paraffin film till glas mikroskop diabilder.Pipett 7,5 mikroliter droppar av FA blandningen på paraffin filmbelagda glas slide med separerande distanser, placera åtta till 10 droppar arrangerade i två rader. Använd en mikropipette för att överföra tre till fem COCs till mitten av FA-droppen, tillsammans med en minsta volym mognadsmedium. Lägg till 7,5 mikroliter av trombinlösning ovanpå varje FA-droppe för att täcka den.Det finns ingen anledning att blanda dem eftersom gelen bildas nästan omedelbart. Täck inkubationskammaren med en tidigare förberedd glasrutschbana, vänd sedan kammaren upp och ner och placera den i en 100-millimeters Petriskål fodrad med fuktigt filterpapper. Lägg petriskålen i 5%-koldioxiden vid 38 grader Celsius inkubator i fem till sju minuter.Efter inkubationen överför du varje FA-kapsel till en brunn av en 96-brunnsplatta som innehåller 100 mikroliter av mognadsmedium. Varannan dag, byt ut hälften av mediet med färskt förjämfört mognadsmedium. Bild COC använder ett inverterat ljusmikroskop vid 10x förstoring.Efter att ha kultbesudlat COCs i fyra dagar, ta bort mognadsmediet från brunnarna och tillsätt 100 mikroliter av 10 internationella enheter per milliliter algenat lysate i DMEM. Låt odlingsplattan vara kvar i inkubatorn i 25 till 30 minuter. Ta bort COCs från de upplösta kapslarna.Tvätta dem i DMEM flera gånger, sedan överföra dem till den inre ringen av en IVF-maträtt som innehåller PBS. Gör en bädd på fem gram FEP pulver i en 30 millimeter Petri-skålen. Fördela en enda droppe mognadsmedium som innehåller tre till fem COCs på FEP-pulvret.Rotera plattan försiktigt i en cirkelrörelse för att säkerställa att partiklarna helt täcker ytan av vätskedroppet och bildar flytande kulor, eller LMs. Förbered flera 60 millimeter IVF Petri-rätter, och tillsätt tre till fyra milliliter sterilt vatten till de yttre ringarna för att skapa en fuktighetskammare. Plocka upp den bildade LM med en 1000 microliter pipetter och placera den i den centrala brunnen.Inkubera kulorna i fyra dagar vid 38 grader Celsius i en fem procent koldioxidinkubator. För att ändra mediet, applicera 30 mikroliter av mognadsmedium på varje LM, vilket kommer att göra att det sprids. När marmorinnehållet löses upp, överför du de COCs som frigörs från bioreaktorn till en droppe färskt mognadsmedium i petriskålen.Efter tre till fyra tvättar i mognadsmedium överför du COCs, tillsammans med 30 mikroliter färskt medium, på FEP-puderbädden. Rotera försiktigt plattan i en cirkelrörelse för att säkerställa att pulverpartiklarna helt täcker ytan av vätskedroppet och bildar en ny LM.Därefter överför du LM till IVF Petriskålen. Båda in vitro mognadssystem produceras COCs med granulos celler som var tätt följs varandra och intakta skikt av cumulus celler.Coc-lönsamhetsanalysen bekräftade att optimala tillväxtförhållanden uppnåddes i båda inkapslingssystemen. I båda grupperna observerades endast platser med hög livskraft. Oocyterna var avbildade med transmissionselektronmikroskopi.Mitokondrierna var jämnt fördelade och hade en skalliknande form. Endast ett fåtal av dem var avlånga och deras klustring var sporadiskt observerades. Endoplasmic reticulum var antingen förknippas med mitokondrier eller fria i oocyte cytoplasman.Vätskedroppar uppträdde som små, mörka, runda strukturer, och Golgiapparaten uppstod med dilaterad cisternae. Det är viktigt att vara exakt och försiktig när du överför FA kapslar från inkubationskammaren till odlingsplattor och när du plockar upp och överför format LM i IVF Petri-skålen.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Inkapsling av Droppar

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Primer Extension Capture: Riktade Sequence hämtning från Kraftigt degraderad DNA Källor

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Cellular Inkapsling i 3D Hydrogeler för tissue engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

PuraMatrix Inkapsling av cancerceller

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mus Oocyte mikroinjektion, mognad och ploidi bedömning

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatiserad Hydrofob Interaktion kromatografikolonn val för användning i Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Enda oocyt bisulfit Mutagenes

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Tillverkning av amyloid-β-utsöndring Alginate Microbeads för användning vid modellering av Alzheimers sjukdom

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...