Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00
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Diese Forschung wurde durch die Zuschüsse F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) und K23DC014517 (Johnson, PI) des National Institute on Deafness and other Communication Disorders der National Institutes of Health unterstützt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der New York University School of Medicine durchgeführt.
1. Zerlegen Sie den Kehlkopf der Ratte
<ol><li>Euthanasierung der Ratte gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. Rasieren Sie den ventralen Hals vom Unterkiefer bis zum Manubrium und tupfen Sie ihn mit Alkohol ab, um eine Fellkontamination in den Gewebeproben zu verhindern.</li>
	<li>Unter einem Sezierfernrohr mit 10-facher Vergrößeru...

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Die Vorbereitung der Stimmlippen von Ratten für die neuromuskuläre Analyse kann verschiedene Herausforderungen mit sich bringen. Die Kehlkopfmuskulatur ist nicht nur klein und von Knorpel umgeben, was es schwierig macht, den Zielmuskel direkt zu extrahieren, sondern es wurde auch eine hohe Variabilität zwischen Tieren in der Tiefe der anatomischen Kehlkopfmarkierungen festgestellt. Für das Protokoll der Querschnittsebene des Muskels traten vollständige Stimmlippenabschnitte zwischen 21-85 Abschnitten (10 μm pro Abs...

Der Kehlkopf der Ratte ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung struktureller und funktioneller neuromuskulärer Kehlkopfanpassungen an Entwicklung, Alterung, Krankheit und pharmakologische Wirkstoffe1,2,3,4,5. Die Konsistenz histologischer Methoden ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da bei der Muskelvorbereitung und -analyse mehrere Feinheiten beteiligt sind, sowie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Größe, Form und Topographie der in den Kehlkopfknorpeln eingekapselten Muskeln1,6,7,8,9,10,11 . Aufgrund der geringen Größe der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur der Ratte sind systematisches Einbetten, Einfrieren und Kryosektion entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Wenn beispielsweise die Stimmlippe der Ratte in der koronalen Ebene geschnitten wird, befinden sich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) von vier der intrinsischen Kehlkopfmuskeln innerhalb von weniger als 1,8 mm Gewebetiefe11. Daher ist eine präzise Überwachung der Anatomie der Kehlkopfmuskulatur während der Kryosektion unerlässlich, um die interessierenden Abschnitte genau zu identifizieren und eine Übersektion des Gewebes zu verhindern. Eine Übersektion des Zielmuskels kann zu einer ungenauen Identifizierung der Anzahl und Topographie von NMJs11 oder zu einer Gesamtverringerung der Stichprobengröße führen, wenn der Zielmuskel aufgrund von Orientierungsverwechslungen verworfen wird12. Da neuartige Modelle für die Untersuchung des Kehlkopfmuskels und ihrer jeweiligen Anpassungen entwickelt werden, sind Standardarbeitsanweisungen unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse in allen Studien präzise, zuverlässig und reproduzierbar sind.
Ziel dieses Artikels ist es, die Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für eine optimale Längs- und Querschnittsanalyse detailliert zu beschreiben. Detaillierte Methoden, die regelmäßig in unserem Labor angewendet werden, werden beschrieben, um Zielmuskelmarker während der Kryosektion zu identifizieren. Obwohl ähnliche Methoden in mehreren Labors verwendet werden, werden hier mehr Details als in der Literatur bereitgestellt, um eine zuverlässige und genaue Replikation zu gewährleisten, wenn sie von unerfahrenen Forschern implementiert wird. Ziel dieses Tutorials ist es, eine Standardmethodik für die immunhistochemische (IHC) Bewertung der Rattengespinstfalte bereitzustellen, um die Konsistenz zwischen Labors und Untersuchungen zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Der Zweck dieses Tutorials ist es, die Vorbereitung der Rattengespinstfalte für histochemische neuromuskuläre Studien zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Larynxdissektion von Ratten, das Schockgefrieren und die Kryosektion der Stimmlippen. Diese Studie beschreibt, wie man Stimmlippen sowohl in Längs- als auch in Querschnittsebene kryosektioniert. Eine Neuheit dieses Protokolls ist die Kehlkopfverfolgung während der Kryosektion, die eine genaue Identifizierung der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit eines Gewebeverlusts verringert. Die Abbildungen zeigen die fortschreitende Kryosektion in beiden Ebenen. Neunundzwanzig Ratten-Hemi-Laryngen wurden kryosektiert und vom Aufkommen des Schilddrüsenknorpels bis zum Erscheinen des ersten Abschnitts verfolgt, der die volle Stimmlippe enthielt. Die volle Stimmlippe wurde für alle Tiere in beiden Ebenen visualisiert. Es gab eine hohe Variabilität im Abstand vom Auftreten des Schilddrüsenknorpels bis zum Auftreten der vollen Stimmlippe in beiden Ebenen. Das Gewicht korrelierte nicht mit der Tiefe der Kehlkopfmarkierungen, was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität und andere Faktoren im Zusammenhang mit der Gewebepräparation für die hohe Variabilität des Auftretens von Landmarken während des Schneidens verantwortlich sein könnten. Diese Studie beschreibt eine Methodik und präsentiert morphologische Daten zur Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für histochemische neuromuskuläre Untersuchungen. Aufgrund der hohen individuellen Variabilität sollten Kehlkopfmarkierungen während der Kryosektion genau verfolgt werden, um eine Übersektion von Gewebe und Gewebeverlust zu verhindern. Die Verwendung einer konsistenten Methodik, einschließlich einer angemessenen Gewebevorbereitung und des Bewusstseins für Landmarken im Kehlkopf der Ratte, wird zu konsistenten Ergebnissen in allen Studien beitragen und neuen Forschern helfen, die daran interessiert sind, die Stimmlippe der Ratte als Modell zur Untersuchung der neuromuskulären Kehlkopfmechanismen zu verwenden.

Die repräsentativen Ergebnisse waren Teil einer laufenden Untersuchung der Auswirkungen von Stimmübungen auf das kehlkopfe neuromuskuläre System. Neunundzwanzig männliche Fischer 344/braune Wanderratten (12 9 Monate alt, 17 24 Monate alt) wurden gewogen und mit CO2-Inhalation gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie eingeschläfert.
Die Verfahren folgten dem skizzierten Protokoll zur Kennzeichnung von NMJs und Fasergröße der lateralen und medialen TA-Muskeln. Der Abstand zwi...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

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Microstate und Omega Komplexität Analysen der ruhenden Zustand Elektroenzephalographie

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

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Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

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As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

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Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...