Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) og K23DC014517 (Johnson, PI) fra National Institute on Deafness og andre kommunikasjonsforstyrrelser ved National Institutes of Health.

Denne studien ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee ved New York University School of Medicine.
1. Disseker rotte larynx
<ol><li>Euthanize rotte i henhold til den institusjonelt godkjente protokollen. Barber ventralhalsen fra mandibelen til manubrium og vattpinne med alkohol for å forhindre pelsforurensning i vevsprøvene.</li>
	<li>Under et dissekeringsomfang med 10x forstørrelse slukker hele strupehodet ved å skape et midtlinjehals snitt med en skalpell t...

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Forberedelse av rottevokalfolder for nevromuskulær analyse kan by på ulike utfordringer. Ikke bare er laryngeale muskler små og omgitt av brusk, og dermed gjør det vanskelig å trekke ut målmuskelen direkte, høy variasjon ble også funnet mellom dyr i dybden av laryngeale anatomiske landemerker. For muskel tverrsnittsplanprotokollen oppstod komplette vokalfoldesnitt mellom 21-85 seksjoner (10 μm per seksjon) etter det første utseendet på den ventrale skjoldbruskbruskkjertelen, som er ganske mye færre enn de 63-...

Rottestrupehodet er en veletablert modell for å undersøke strukturelle og funksjonelle nevromuskulære laryngeale tilpasninger til utvikling, aldring, sykdom og farmakologiske midler1,2,3,4,5. Konsistens av histologiske metoder er avgjørende for denne arbeidslinjen, da det er flere vanskeligheter involvert i muskelforberedelse og analyse, samt utfordringer forbundet med laryngeal størrelse, form og topografi av musklene innkapslet i laryngeal brusk1,6,7,8,9,10,11 . På grunn av den lille størrelsen på rotteintrinsiske laryngeale muskler, er systematisk innebygging, frysing og kryoseksjon avgjørende for å oppnå konsistente og nøyaktige resultater. For eksempel, når du seksjonerer rottevokalfolden i koronalplanet, ligger de nevromuskulære kryssene (NMJs) av fire av de iboende laryngeale musklene innen mindre enn 1,8 mm vevdybde11. Derfor er presis overvåking av laryngeal muskelanatomi under kryooseksjon viktig for å nøyaktig identifisere delen (e) av interesse og forhindre overseksjon av vev. Overseksjon av målmuskelen kan resultere i unøyaktig identifisering av antall og topografi av NMJs11 eller kan resultere i generelle reduksjoner i prøvestørrelsen hvis målmuskelen kastes på grunn av landemerke orientering forvirring12. Etter hvert som nye modeller for studiet av laryngeal muskel og deres respektive tilpasninger utvikles, er standard driftsprosedyrer avgjørende for å sikre at resultatene er presise, pålitelige og reproduserbare på tvers av studier.
Målet med denne artikkelen er å detaljere forberedelsen av rottevokalfolden for optimal langsgående og tverrsnittsanalyse. Detaljerte metoder som brukes regelmessig i laboratoriet vårt, er beskrevet for å identifisere målmuskellandemerker under kryooseksjon. Selv om lignende metoder brukes i flere laboratorier, er det gitt flere detaljer her enn i litteraturen for å sikre pålitelig og nøyaktig replikering når den implementeres av nybegynnere etterforskere. Målet med denne opplæringen er å gi en standardmetodikk for immunhiistokjemisk (IHC) evaluering av rottevokalfolden for å forbedre konsistensen på tvers av laboratorier og undersøkelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Formålet med denne opplæringen er å beskrive utarbeidelsen av rottevokalfolden for histokjemisk nevromuskulær studie. Denne protokollen skisserer prosedyrer for rotte laryngeal disseksjon, flash-frysing og kryosectioning av vokalfoldene. Denne studien beskriver hvordan man gråter vokalfolder i både langsgående og tverrsnittsplan. En nyhet i denne protokollen er laryngeal sporing under kryosectioning som sikrer nøyaktig identifisering av de iboende laryngeale musklene og reduserer sjansen for vevstap. Figurer viser den progressive kryoseksjonen i begge flyene. Tjueni rotte hemi-larynges ble gråtoseksjonert og sporet fra fremveksten av skjoldbruskbruskkjertelen til utseendet til den første delen som inkluderte hele vokalfolden. Den fulle vokalfolden ble visualisert for alle dyr i begge flyene. Det var høy variasjon i avstanden fra utseendet på skjoldbruskbruskkjertelen til utseendet på den fulle vokalfolden i begge flyene. Vekten var ikke korrelert med dybden av laryngeale landemerker, noe som tyder på at individuell variasjon og andre faktorer knyttet til vevsforberedelse kan være ansvarlig for den høye variasjonen i utseendet på landemerker under seksjonering. Denne studien beskriver en metodikk og presenterer morfologiske data for å forberede rottevokalfolden for histokjemisk nevromuskulær undersøkelse. På grunn av høy individuell variasjon bør laryngeale landemerker spores nøye under kryoseksjon for å forhindre overseksjon av vev og vevstap. Bruken av en konsistent metodikk, inkludert tilstrekkelig vevsforberedelse og bevissthet om landemerker i rottestrupehodet, vil hjelpe med konsistente resultater på tvers av studier og hjelpe nye forskere som er interessert i å bruke rottevokalfolden som modell for å undersøke laryngeale nevromuskulære mekanismer.

De representative resultatene var en del av en pågående undersøkelse av effekten av vokaløvelse på laryngeal nevromuskulært system. 29 mannlige Fischer 344/brune norske rotter (12 9 måneder gamle, 17 24 måneder gamle) ble veid og avlivet med CO2-innånding etterfulgt av en bilateral thoraxotomi.
Prosedyrene fulgte den skisserte protokollen for å merke NMJs og fiberstørrelse på laterale og medial TA muskler. Avstanden mellom laryngeale landemerker ble sporet i både langsg...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Denne protokollen beskriver metoder som brukes til å forberede rottevokalfolder for histokjemisk nevromuskulær studie.

Forberedelse av Rat Vocal Fold for nevromuskulære analyser

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekvensiell Foto bleking å avgrense Enkelt Schwann celler på nevromuskulær Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disseksjon av Transversus Abdominis Muscle for hel-mount Neuromuscular Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Måle nevromuskulær Junction funksjonalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Mikrostaten og Omega kompleksitet analyser av hvile-statlige Elektroencefalogram

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Forberedelse for undersøkelse av pattedyr nevromuskulær overføring Under spenning klemme forhold

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Samling av frosne gnagerhjerneregioner for nedstrøms analyser

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluorescerende og morfometriske analyser av hel-mount nevromuskulære veikryss

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Disseksjon og immunhiistokjemi av Drosophila voksenben for å oppdage endringer ved neuromuskulært kryss for en identifisert motor neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...