Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00
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Esta investigación fue apoyada por las subvenciones F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) y K23DC014517 (Johnson, PI) del Instituto Nacional de Sordera y otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud.

Este estudio se realizó de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York.
1. Diseccionar la laringe de la rata
<ol><li>Eutanasia de rata de acuerdo con el protocolo aprobado institucionalmente. Afeitar el cuello ventral desde la mandíbula hasta el manubrium e hisopo con alcohol para evitar la contaminación del pelaje en las muestras de tejido.</li>
	<li>Bajo un endoscopio de disección con aumento de 10x ex...

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

La preparación de las cuerdas vocales de las ratas para el análisis neuromuscular puede presentar varios desafíos. Los músculos laríngeos no solo son pequeños y están rodeados de cartílago, lo que dificulta la extracción directa del músculo objetivo, sino que también se encontró una alta variabilidad entre los animales en la profundidad de los puntos de referencia anatómicos laríngeos. Para el protocolo del plano de sección transversal muscular, las secciones completas de las cuerdas vocales aparecieron en...

La laringe de rata es un modelo bien establecido para investigar las adaptaciones laríngeas neuromusculares estructurales y funcionales al desarrollo, el envejecimiento, la enfermedad y los agentes farmacológicos1,2,3,4,5. La consistencia de los métodos histológicos es fundamental para esta línea de trabajo, ya que existen múltiples complejidades involucradas en la preparación y el análisis muscular, así como desafíos asociados con el tamaño, la forma y la topografía de la laringe de los músculos encapsulados dentro de los cartílagos laríngeos1,6,7,8,9,10,11 . Debido al pequeño tamaño de los músculos laríngeos intrínsecos de la rata, la incrustación sistemática, la congelación y la crioseccionación son fundamentales para lograr resultados consistentes y precisos. Por ejemplo, al seccionar la cuerda vocal de la rata en el plano coronal, las uniones neuromusculares (NMJ) de cuatro de los músculos laríngeos intrínsecos se encuentran a menos de 1,8 mm de profundidad tisular11. Por lo tanto, el monitoreo preciso de la anatomía del músculo laríngeo durante la criosecciona es imperativo para identificar con precisión la (s) sección (s) de interés y evitar la sobreseccionamiento del tejido. La sobresección del músculo objetivo puede dar lugar a una identificación inexacta del número y la topografía de nmJs11 o puede dar lugar a reducciones generales en el tamaño de la muestra si el músculo objetivo se descarta debido a la confusión de orientación de punto de referencia12. A medida que se desarrollan nuevos modelos para el estudio del músculo laríngeo y sus respectivas adaptaciones, los procedimientos operativos estándar son esenciales para garantizar que los resultados sean precisos, confiables y reproducibles en todos los estudios.
El objetivo de este artículo es detallar la preparación de la cuerda vocal de la rata para un análisis longitudinal y transversal óptimo. Se describen métodos detallados utilizados regularmente en nuestro laboratorio para identificar puntos de referencia musculares objetivo durante la crioseccionación. Aunque se utilizan métodos similares en varios laboratorios, aquí se proporciona un mayor detalle que en la literatura para garantizar una replicación confiable y precisa cuando es implementada por investigadores novatos. El objetivo de este tutorial es proporcionar una metodología estándar para la evaluación inmunohistoquímica (IHC) de la cuerda vocal de la rata para mejorar la consistencia en los laboratorios e investigaciones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

El propósito de este tutorial es describir la preparación de la cuerda vocal de la rata para el estudio neuromuscular histoquímico. Este protocolo describe los procedimientos para la disección laríngea de ratas, la congelación por flash y la crioseccionación de las cuerdas vocales. Este estudio describe cómo crioseccionar las cuerdas vocales tanto en planos longitudinales como transversales. Una novedad de este protocolo es el seguimiento laríngeo durante la crioseccionación que garantiza la identificación precisa de los músculos laríngeos intrínsecos y reduce la posibilidad de pérdida de tejido. Las cifras demuestran la crioseccionación progresiva en ambos planos. Veintinueve hemi-laringes de rata fueron crioseccionados y rastreados desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la primera sección que incluía el pliegue vocal completo. La cuerda vocal completa se visualizó para todos los animales en ambos planos. Hubo una alta variabilidad en la distancia desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la cuerda vocal completa en ambos planos. El peso no se correlacionó con la profundidad de los puntos de referencia laríngeos, lo que sugiere que la variabilidad individual y otros factores relacionados con la preparación del tejido pueden ser responsables de la alta variabilidad en la aparición de puntos de referencia durante la sección. Este estudio detalla una metodología y presenta datos morfológicos para la preparación de la cuerda vocal de la rata para la investigación neuromuscular histoquímica. Debido a la alta variabilidad individual, los puntos de referencia laríngeos deben rastrearse de cerca durante la criosecciona para evitar la sobresección del tejido y la pérdida de tejido. El uso de una metodología consistente, incluida la preparación adecuada del tejido y el conocimiento de los puntos de referencia dentro de la laringe de la rata, ayudará con resultados consistentes en todos los estudios y ayudará a los nuevos investigadores interesados en usar el pliegue vocal de la rata como modelo para investigar los mecanismos neuromusculares laríngeos.

Los resultados representativos fueron parte de una investigación en curso de los efectos del ejercicio vocal en el sistema neuromuscular laríngeo. Veintinueve machos de ratas Fischer 344/brown Norway (12 de 9 meses de edad, 17 de 24 meses de edad) fueron pesadas y sacrificadas con inhalación de CO2 seguida de una toracotomía bilateral.
Los procedimientos siguieron el protocolo descrito para etiquetar nmj y el tamaño de la fibra de los músculos LATERALES y mediales de la AT. La...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Este protocolo describe los métodos utilizados para preparar las cuerdas vocales de las ratas para el estudio neuromuscular histoquímico.

Preparación de la cuerda vocal de la rata para análisis neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

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Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

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