Name: a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures
Uploaded: 2021-03-18T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
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作者要感谢美第奇纳分子研究所生物成像股对图像采集的所有建议。
该项目已获得欧洲联盟Horizon 2020研究和创新方案的资金，根据赠款协定，诺952455、通过PTDC/MEDFAR/30933/2017项目获得特克诺诺尼亚基金会（FCT）和利斯博亚大学医学学院法库达德。

葡萄牙法律和欧洲联盟准则（2010/63/欧盟）在有关为科学目的保护动物的所有程序中都得到尊重。此处描述的所有方法均得到 iMM 机构动物福利机构 （ORBEA-iMM） 和国家主管机关 （DGAV ） 的批准。
1. 准备鼻皮质-河马片
注：鼻皮质-海马片的制备使用P6-7斯普拉格-道利大鼠。
<ol><li>文化设置和媒介准备<ol>
<li>在文化的前一天，准备所需的媒体，并将它们放置在4°C。</li>
		<li>准备解剖介质：盖的平衡盐溶液（GBSS）中的25毫米葡萄糖。</li>
		<li>准备培养介质： 50% Opti-MEM， 25% HBSS， 25% 马血清 （HS）， 25 mM 葡萄糖， 30μg/mL 根塔霉素.</li>
		<li>准备维护介质：神经巴萨-A （NBA）， 2% B27， 1 mM L-谷氨酰胺， 30μg/mL 根塔霉素， HS （15%， 10%， 5% 和 0%）.</li>
	</ol></li>
	<li>大脑收获<ol>
<li>在开始培养之前，在 6 井板的每口井中加入 1.1 mL 的文化介质，并配有 P1000 移液器，并将其放置在 37 °C。</li>
		<li>将所有设备（解剖显微镜、组织直升机、解剖灯、解剖工具、电极、板材、插入物和滤纸）放在生物安全柜内，并在紫外线下消毒15分钟。</li>
		<li>将切片厚度调整为 350μm。</li>
		<li>从冰箱中取出 GBSS。在六道培养皿中加入 5 mL 的 GBSS。每只动物需要六道培养皿。</li>
		<li>安乐死老鼠小狗。在动物的脑干底部使用锋利的剪刀进行斩首。</li>
		<li>用冷的 GBSS 清洗动物头三次，并将其带入安全柜。</li>
	</ol></li>
	<li>组织分离和切片准备<ol>
<li>将锋利的钳子牢牢地插入眼窝以保持头部。</li>
		<li>使用细剪刀将皮肤/剪刀沿中线切开，从椎前额切开，朝前叶切开，放在一边。</li>
		<li>切开头骨和大脑横向裂变（大脑和小脑之间的空间）。用弯曲的长钳子，将其移开。</li>
		<li>用铲子丢弃嗅球。将大脑从头部取出，并将其置于冰冷的 GBSS 中，并朝上（图 1A）。</li>
		<li>将细钳插入小脑，沿着中线，铲子非常小心地打开每个半球（图1B）。</li>
		<li>使用短曲线钳，小心地去除覆盖海马的多余的组织，而不会接触海马结构。然后用铲子，切到每个海马下面（图1C）。</li>
		<li>拿起一个半球，把它，海马朝上，放在过滤纸上。与另一个半球重复该过程，并将其与第一个半球平行放置在滤纸中。将滤纸放在组织切碎器上，半球垂直于刀片，并将半球切成350μm切片（图1D）。</li>
		<li>将切片组织放入带冷 GBSS（图 1E）的培养皿中。</li>
		<li>使用圆尖电极（图1F）小心地分离切片。只保留结构完整的鼻皮质和海马的切片。DG 和 CA 区域应完美定义，以及腹腹皮质和腹叶皮质 （图 1G）。</li>
		<li>将每片切片放在插入物上（图1H-I），配上铲子和圆形尖端电极。用 P20 移液器（图 1J）去除每片周围的多余解剖介质。四个鼻皮皮质-河马片可以在一个单一的插入培养（图1K）。</li>
	</ol></li>
	<li>文化维护<ol>
<li>每隔一天更换一次媒体。</li>
		<li>在 37 °C 时加热介质。</li>
		<li>从孵化器中取下盘子。用钳子（图1L）握住塑料边缘，拾取每个插入物。</li>
		<li>使用一只自由的手从井中吸气介质。将插入物放回井中，并添加 1 mL，配有 P1000 移液器，即新鲜加热介质（图 1M）。重复所有插入。确保膜和介质之间没有气泡。</li>
	</ol></li>
</ol>注：癫痫样切片在介质中逐渐和可控地剥夺血清。从 9 天在体外 （DIV） 开始， 切片在 NBA 中保持没有 HS14。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig01.jpg"> 图1：准备鼻皮皮质-河马器官切片的详细程序。（A） 将大脑从头部取出，放在冰冷的 GBSS 中，面朝后。（B） 将钳子插入小脑。通过中线打开大脑，去除海马体上的多余组织。（C） 在海马下面用铲子切开，箭头表示。（D） 将两个海马朝上和平行放在滤纸上，并在组织切碎机上切下 350 μm 切片。（E） 将切片海马放在冰冷的 GBSS 中。（F） 使用圆形倾斜玻璃电极将切片分离。（G） 只选择描绘完整鼻皮质和海马的切片。（H ， I）在圆形倾斜玻璃电极的帮助下，将每片玻璃片推至铲子上，并将其放在插入物上。（J） 删除切片周围的 GBSS。（K） 每次插入四片。（L） 要更换介质，请抬起插件，用玻璃移液器吸气介质。（M） 将移液器放在6井板的插入物和墙壁之间，以添加新鲜介质。确保切片下方没有气泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
2. 电生理学记录
注：在界面式腔室中，在7、14和21 DIV的鼻皮皮质-河马有机切片中进行了电生理记录。通过放大器获取记录，用软件进行数字化和分析。所有录音均经过带状通过过滤（60赫兹的八极贝塞尔滤波器和 600 Hz 的高斯滤波器）。
<ol><li>设置准备<ol>
<li>准备 50 毫升的 NBA 介质与 1 毫升的 B27 和 250 μL 的 L - 谷氨酰胺。在37°C热身。</li>
		<li>将电生理学设置设置在闭路中。验证流速是否为 2 mL/分钟。</li>
		<li>打开车箱（5% CO2/95% O2）阀门，检查系统中的水位。</li>
		<li>将滤纸放入接口记录室，以排干多余的介质和框架下方的透镜清洁纸，为切片提供介质。</li>
		<li>打开温度控制器、放大器和微脉冲器。</li>
		<li>在开始录音之前，让接口室中的温度稳定在 37 °C。</li>
		<li>准备人工脑脊液（aCSF： 124 m NaCl， 3mM KCl， 1.2 mM NaH2PO4， 25 mM NaHCO3， 10 mM 葡萄糖， 2 mM 卡Cl2， 1 mM MgSO4 与 pH 7.4）， 并用它来填充玻璃电极与注射器.将其放置在接收电极中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自发活动的录音<ol>
<li>温度稳定后，从孵化器中取出板，用锋利的刀片从插入物上切下一片。将其放置在 60 毫米板中，并带有一滴介质。将其带到界面录音室。</li>
		<li>将切片与海马放在右下角的界面室中。将接收电极放置在CA3金字塔细胞层中。</li>
		<li>继续执行连续收购协议并记录 30 分钟。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PI 吸收分析
注：通过监测荧光染料碘化物（PI）的细胞吸收情况，评估了细胞死亡。PI是一种极性化合物，它进入细胞与受损的细胞膜，并与DNA相互作用，发出红色荧光（吸收493纳米，发射630纳米）。由于PI不渗透到活细胞中，因此它用于检测种群中的死细胞。
<ol><li>PI 孵化<ol>
<li>在文化媒介中，准备重新稀释 PI 库存。</li>
		<li>对于 PI 吸收检测，请从孵化器中取出板，并小心地提起插入物。将 13 μL 的 PI 添加到介质中，配有 P20 移液器，最终浓度为 2 μM。 在将插入物放回原位之前，缓慢搅拌板。确保切片下方没有气泡。</li>
		<li>将切片放回 37 °C 孵化器中 2 小时。</li>
		<li>继续执行下一节所述的免疫化学协议。用铝盖住板材，因为 PI 对光线敏感。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫化学
注：在免疫造血术中，使用神经元特定抗体以及能够区分微胶质和天体细胞的休息和反应表型的抗体来评估鼻皮质-河马癫痫样有机细胞切片中神经元死亡和胶质的延伸。
<ol><li>组织固定<ol>
<li>从孵化器中取出板并吸气介质。在 RT 处用 4% 的副甲醛 （PFA） 修复切片 1 小时，在切片下面和上面添加 1 mL 的 PFA，并配上 P1000 移液器。</li>
		<li>删除PFA并添加1 mL的PBS。还要在切片下面和上面添加 PBS。</li>
		<li>将切片保持在 4 °C，在 PBS 中，直到进一步使用。始终在盘子周围放置护身符以避免干燥。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫染色步骤<ol>
<li>每次洗两次，10分钟，1毫升PBS。</li>
		<li>在 PBS 中准备包含 1% Triton-X100、10% HS 和 10% BSA 的渗透/阻塞解决方案。准备 5% BSA 解决方案。</li>
		<li>用疏水笔绘制两个矩形（图2A）。用高度锋利的刀片从插头（图 2B）切开切片。每片幻灯片（图 2C）放两片，每片顶部使用 P200 移液器添加 140μL 的渗透/阻塞溶液。在RT孵化3小时。</li>
		<li>在PBS中将工作稀释的主要抗体稀释到5%的BSA中。在4°C的夜间与主要抗体一起孵化。</li>
		<li>在RT与二次抗体一起孵育4小时。从这一步开始，保护板免受光，因为氟磷正在处理。</li>
		<li>将 50 μL 滴的 Hoechst 溶液放在每片的顶部，并在 RT 孵化 20 分钟。</li>
		<li>在孵化之间清洗。始终使用 PBS-T 洗三次，每次洗 10 分钟。</li>
		<li>删除霍赫斯特，并按建议清洗。</li>
		<li>在每片的顶部添加 50μL 的安装介质。盖上玻璃盖，用指甲油（图2D）包围。</li>
		<li>让它在 RT 干燥 24 小时。</li>
		<li>可视化共聚焦显微镜下的免疫污渍。将染色切片保持在-20°C。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig02.jpg"> 图2：免疫化学检测的具体程序。（A） 用疏水笔在幻灯片中画两个正方形。（B） 切开包含切片的插入件。（C） 将每片切片放入用疏水笔绘制的方块中，开始渗透/阻塞步骤。（D） 缔结协议后，通过在安装介质中安装切片，用玻璃盖片覆盖，并用指甲油环绕它完成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

癫痫的动物模型对于许多抗癫痫药的发现至关重要，但是它们需要许多动物，而且由于癫痫发作的潜在期，它们大多很耗时。海马急性切片中癫痫活性的低镁诱导也已在文献3中进行了彻底修改，但急性切片具有6-12小时生存能力，无法评估长期变化。有机切片可以在文化中维持数天到数周，从而克服急性切片的短暂生存时间，并提出了有机海马片的癫痫发生模型3，7，8。
在这里，我们描述器官切片的准备，包括鼻皮质和海马。这些切片需要15-20分钟准备每个动物，从动物牺牲开始，直到将切片放置到插入物上，每个半球可以获得6-8片。打开半球暴露海马体时，以及切片后从滤纸中取出组织时，必须格外小心。海马上方的过量组织也会在切片过程中损害切片完整性。
鼻皮质-河马细胞型切片描绘了一种进化的癫痫样活动，类似于体内癫痫。在文化中一周后，大多数片断描绘了混合的间歇和类似ictal的活动，这些活动在文化中随着时间的流传而发展到完全像ictal一样的活动。到目前为止，我们在2-3周内记录的切片间放电很少。在这个系统中，癫痫样活动的发展速度似乎比有机海马片快。这可能归因于鼻皮层的存在，它保留了海马的大部分功能输入。为了充分解决这个问题，目前正在对这些切片在文化中在整个时间内显示的癫痫信号进行完整描述，例如ictal事件的数量和持续时间，以及它们的振幅和频率。
该系统可以在培养中维持三周以上，并模仿癫痫的许多分子相关性，如神经元死亡、微胶质和星形细胞的激活以及增加亲炎细胞因子14的产生，从而使这些方面具有长期特征。它还代表一个易于使用的筛查平台，可以实施针对特定细胞通路的药理干预措施，并测试潜在的治疗目标。毫无疑问，本文所介绍的系统有助于进一步启发癫痫发生机制。

癫痫是全世界最普遍的神经系统疾病之一，其特征是大脑中同步和过度神经元活动的周期性和不可预知性发生。尽管有各种抗癫痫药物（AEDs），三分之一的癫痫患者对治疗1 有难治性，并且继续经历癫痫发作和认知衰退。此外，可用的 AED 由于对神经元活动相对普遍的操作而妨碍认知。癫痫在人类中很难研究，因为多发性和异质性癫痫性损伤，持续数月至数十年的漫长潜伏期，以及第一次自发发作后抗惊厥治疗的误导性影响。
由于癫痫动物模型，确定治疗癫痫的潜在治疗剂已成为可能：1） 遗传模型，使用遗传倾向动物，在这种动物中，癫痫发作是自发发生的或对感官刺激的反应：2） 电刺激引起的癫痫发作模型：和 3） 使用皮洛卡平 （粘液受体激动剂）， kainate （卡辛受体激动剂） 或 4 氨基皮里丁 （钾通道阻滞剂） 等的癫痫诱导药理模型。这些模型对于理解癫痫背后的行为变化以及分子和细胞机制至关重要，它们导致了许多AEDs2的发现。
活体制剂也是探索癫痫发生和成语背后的机制的有力工具。急性海马片，使电子生理学研究活细胞在6-12小时期间，和有机海马片，可以保存在孵化器在几天或几个星期内已广泛用于癫痫活性3的研究。
有机脑片是从外植组织中制备的，代表大脑的生理三维模型。这些切片保留了感兴趣区域的细胞结构，包括所有脑细胞及其细胞间交流4。 长期有机文化最常用的区域是海马，因为该地区受多种神经退行性条件下神经元损失的影响。它们被广泛用于模拟脑部疾病，被认为是评估药物神经保护和治疗潜力的极好工具。在海马器官切片7、8、9、10中描述了癫痫、中风和A+诱发毒性的模型。帕金森病在腹膜脑膜和纹状体，以及皮层-语料库-细胞-纹状体-亚斯坦蒂娅尼格拉，有机切片11探索。有机脑切片培养模仿轴心授精和小脑功能的许多方面，是研究多发性硬化症12的新疗法策略的广泛模型。
然而，临床研究和癫痫动物模型表明，由腹膜和内皮质组成的鼻皮质在癫痫发作第13代中起着一定的作用。因此，在鼻皮质-河马细胞切片中建立了癫痫发生模型。在血清逐渐和可控的剥夺下，鼻皮质-河马细胞型切片描绘了进化的癫痫样事件，不像总是保存在含有血清的介质中的类似切片。
在癫痫症中，与中枢神经系统的许多急性和慢性疾病一样，神经中心视力无法阐明疾病发病和进展背后的机制。临床和实验证据表明，脑部炎症是导致癫痫过程的关键因素之一，其中微胶质和星形细胞起着相关作用。癫痫动物模型的药理实验表明，通过靶向亲炎途径可以达到抗癫痫作用，而如今神经炎症被认为是开发癫痫15治疗方法的新选择。
在这里，我们彻底描述了鼻皮质-河马细胞切片培养物的准备情况，以及记录自发性癫痫活性的细节。我们强调，该系统模仿癫痫的几种神经炎方面，因此适合探索胶质细胞和神经炎在这个病理学中的作用。此外，它代表着一个易于使用的平台，用于筛查癫痫的潜在治疗方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-C3d (goat)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2655</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68 (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31630-125ug</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (mouse)</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108539</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN (rabbit)</td>
			<td>Werfen</td>
			<td>16712943S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#8482; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td>5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain/Tissue Slice Chamber System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>BB15, Function Line</td>
			<td>Set to 37 &#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08342.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution, 45% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope/magnifier</td>
			<td>MEIJI TECHNO CO. LTD</td>
			<td>122285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps Standard Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin stock solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution (GBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-919-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Electrodes</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-10</td>
			<td>Round tips homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stock solution at 2 mg/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, Heat Inactivated (HS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>BSC-HT Haas Top</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatula Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10092-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>HERASafe</td>
			<td>HS 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaning Paper</td>
			<td>TIFFEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM (Q)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72,699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Clich&#233;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (NBA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#174; I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,87,94,295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO&#8324;3- in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P10, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td>Stock solution at 1 mg/mL in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL</td>
			<td>SOL-M</td>
			<td>161000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27800.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#8206;</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Astro Med Inc GRASS Product Group</td>
			<td>S48 Stimulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Scissors Straight SharpSharp 12cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus&#8482; Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 6-Wells Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatue controller</td>
			<td>MEDICAL SYSTEMS CORP.</td>
			<td>TC-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 350 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures

有机切片培养物已被广泛用于模拟脑部疾病，并被认为是评估药物神经保护和治疗潜力的极好平台。有机切片由外植组织制成，代表复杂的多细胞体外活体环境。它们保留了脑细胞的三维细胞结构和局部环境，维持神经元连接和神经元-胶质相互作用。河马细胞切片被认为适合探索癫痫发生的基本机制，但临床研究和癫痫动物模型表明，由腹膜和阴囊皮质组成的鼻皮质在癫痫发作生成中起着相关作用。
在这里，我们描述了鼻皮质-黑猩猩有机切片的准备。在灌注下，CA3区域在生理温度和没有药理学操作的情况下，在灌注下自发活动的记录表明，这些切片描绘了文化中整个时间演变的癫痫类事件。还观察到通过丙酸碘化物吸收检测和用荧光耦合免疫化学评估的胶质化，细胞死亡增加。提出的实验方法突出了鼻皮层-河马细胞切片培养的价值，作为研究癫痫发生动态和进展以及筛查大脑病理学潜在治疗目标的平台。

根据以前对有机海马片中癫痫信号分析的描述，间皮癫痫放电被定义为明显与背景活动区分的偶数放电，极性突然变化，在低频（<2 Hz）下发生。持续超过10s且以较高频率（≥2 Hz）发生的帕罗西斯马尔放电被描述为ical癫痫活性。如果冰塔事件发生在上一个事件之后的 10s 内，则这两个事件仅被视为一个冰塔事件。
7 DIV（图3A）的鼻皮质-海马细胞切片描绘了混合的间歇和冰晶状活动。在14 DIV（图3B），自发活动的特点是ictal放电，在21 DIV进化为压倒性的ictal活动，其活动持续>1分钟（图3C）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig03.jpg"> 图3：鼻皮质-河马细胞切片的自发性癫痫活性。具有代表性的电图癫痫发作样事件，记录自CA3区域在界面类型腔室后（A） 7 DIV， （B） 14 DIV 和 （C） 21 DIV. 癫痫发作细节显示在较低的痕迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
PI吸收检测，然后是免疫化学对神经元标记NeuN，旨在识别神经元死亡。在7个DIV切片（ 图4A中的箭头）中观察到颗粒和金字塔神经元的PI吸收，但PI+ 神经元的数量在14DIV（ 图4B中的箭头）增加，证实了癫痫发生进展增加的神经元死亡。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig04.jpg"> 图4：NeuN和PI染色鼻皮质-河马细胞型切片的代表图像。NeuN染色成熟神经元和PI阳性细胞的图像是在（A） 7 DIV 和 （B） 14 DIV 上获得的，在具有 20 倍目标的共焦激光显微镜上获取。显示虚张画像。箭指向死亡神经元（橙色）。秤条，50微米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
Iba1 的双染色以及 CD68 用于评估微胶质表型。Iba1 是微胶质/巨噬细胞标记物，而 CD68 是一种通过反应性微胶质在高水平上表达的溶酶蛋白，通过休息微胶质表示在低水平上。在 7 个 DIV 切片中，CD68 表达低的撞击微胶质（ 图 5A中的箭头）比 Iba1+/CD68+ 反应微胶质（ 图 5A中的箭头）更丰富，而在 14 DIV 时， 在海马区的所有区域，Iba1+/ CD68+ 浓密/阿莫博德 M1 微胶质（ 图 5B中的箭头） 超过微胶质，CD68 表达低（ 图 5B中的箭头）。在 14 DIV 时，可以精确定位一些具有超影响外观的 Iba1+/CD68+ 细胞（ 图 5B中的开箭头），这可能表明微胶质的 M2 抗炎表型的发生。然而，这个问题需要进一步研究。
最近的研究表明，不同的启动CNS损伤可以引起至少两种类型的反应性星形细胞，A1和A2，A1星体是神经毒性16。A1亚型星形细胞的特点是补充C316，17，18的表达增加。补充 C3 在激活补充系统中起着核心作用，它产生 C3b，进一步退化为 iC3b、C3dg 和 C3d19。因此，采用了GFAP和C3d的双重污渍来评估天文滑翔。在7 DIV时，C3d的表达几乎无法检测（图6A），而在14个DIV切片中，可以观察到肥大的GFAP+/C3d+星形细胞（图6B中的箭头），这表明A1星形细胞的渐进激活。
结果表明，在整个癫痫发生过程中，微胶质和星形细胞逐渐激活，模仿癫痫患者和动物病理模型中描述的事件。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2.jpg"> 图5：Iba1和CD68彩色鼻皮质-海马细胞型切片的代表图像。Iba1 和 CD68 彩色微胶质和霍奇斯特染色核的图像是在（A） 7 DIV 和 （B） 14 DIV 上获得的，在具有 20 倍目标的圆角激光显微镜上。显示虚张画像。箭头指向 Iba1+/ CD68-休息微胶质，箭头指示 Iba1+/CD68+ 浓密/阿莫博德微胶质和开放箭头显示 Iba1+/CD68+ 超冲洗微胶质。秤条，50微米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig06.jpg"> 图6：GFAP和C3d染色鼻皮质-河马细胞型切片的代表图像。GFAP 和 C3d 彩色星形细胞和霍奇斯特染色核的图像是在（A） 7 DIV 和 （B） 14 DIV 上获得的，在具有 20 倍目标的共聚焦激光显微镜上。显示虚张画像。箭头指向GFAP+/C3d+反应性A1星形细胞（黄色）。秤条，50微米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

在这里，我们描述了鼻皮质-黑猩猩有机切片的准备。在血清逐渐和可控的剥夺下，这些切片描绘了进化的癫痫样事件，可以被认为是癫痫发生的前活体模型。该系统是监测自发活动动态以及评估整个癫痫发生过程中神经炎特征进展的极好工具。

莱纳尔皮质-希波坎普斯有机切片文化中的癫痫发生模型

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

癫痫是一种普遍的神经系统疾病。鼻皮质-海马细胞切片描绘了进化的癫痫样事件，类似于体内癫痫，因此可用作癫痫的前活体模型。该系统确实是监测癫痫发生动态和进展，以及筛查这种脑病理学的潜在治疗目标的极好工具。和我一起演示程序的是我的学生弗朗西斯科·梅达和马法达·卡瓦略。为了从产后第六天到第七天收获大脑，首先用五毫升的 GBSS 洗头三次。在生物安全柜中工作，将锋利的钳子牢牢地插入眼窝，将头部固定到位，并使用细尖剪刀将头皮沿中线从椎骨前额切到前叶。以同样的方式切割头骨，沿着大脑横向裂变，并使用弯曲的长钳将头骨碎片分开。使用铲子丢弃嗅球，并将大脑的后侧转移到含有5毫升冷GBSS的60毫米板中。将细钳插入小脑，沿中线插入铲子，小心地打开半球。使用短弯曲的钳子小心地去除覆盖海马体的多余的组织，而无需接触海马结构，然后切到每个海马体下面。一次将一个半球移到海马区，并平行到一张滤纸上。将滤纸放在组织切碎器上，半球垂直于刀片，将半球切成350微米切片。将切片组织转移到含有五毫升冷 GBSS 的新培养皿中，并使用圆尖电极小心地分离切片，只保留结构完整的鼻皮质和海马的样品。DG 和 CA 区域应完美定义以及腹腹和腹皮质区域。使用铲子和圆形尖端电极，将多达四个完好无损的切片放入六井板的适当数量的单独插入物上，每口井含有 1.1 毫升培养介质。使用 P20 移液器从每个切片周围去除任何多余的解剖介质。将盘子放在细胞培养孵化器中。每两到三天更换一次介质。使用钳子解除插入。从相应的井中吸气介质，并将插入物放回原位。使用 P1000 移液器为每口井添加一毫升 37 摄氏度的新鲜介质。在闭路中准备电生理学设置。验证接口类型腔室的流速设置为每分钟两毫升，并打开碳水化合物-牛阀。检查系统中的水位，并将一张滤纸放入接口记录室，以排出任何多余的介质。将一张透镜清洁纸放在框架下方，为切片提供介质，并打开温度控制器、放大器和微型操纵器。使用注射器用新制备的人造脑脊液装载玻璃电极。将玻璃电极放入接收电极中，等待接口腔中的温度稳定在 37 摄氏度。在生物安全柜中工作，将插入物放在一个 60 毫米的板中，并放置一滴介质。使用锋利的刀片从插入处切下一片，将切片与海马放在右下角的接口室中，然后将接收的电极放入CA3金字塔细胞层，启动连续采集协议，并将切片记录30分钟。要执行丙酸碘化物吸收检测，请在生物安全柜中工作。将插入物从井中提起，在中等温度下加入碘化物，最终浓度为每口油井两微摩尔。在将插入物放回井中之前，请慢慢搅拌板，注意切片下方没有气泡。处理好所有切片后，将板返回细胞培养孵化器。对于切片的免疫染色，在硫化物培养的末尾，从每个井的底部吸气介质，并在每个插入物的顶部和底部加入一毫升4%的副甲醛。在室温下一小时后，每次洗两次10分钟和一毫升PBS，然后用疏水笔在显微镜幻灯片上画两个矩形。使用锋利的刀片从插入处切下切片，并将一片切片放入每个矩形中。在每片上加入渗透阻塞溶液，在室温下进行三小时的孵化。在孵化结束时，在每片中加入主要的抗体，在一夜之间进行四摄氏度的潜伏。第二天早上，用PBS-Tween清洗切片三次，每次洗涤10分钟，并在室温下用适当的二次抗体孵育切片4小时。之后，按演示清洗切片，并在每个切片中加入 50 微升的 Hoechst 溶液，在室温下进行 20 分钟的孵化。在 Hoechst 孵化后，再次清洗切片，并在每个切片上加入 50 微升安装介质，然后在切片上放置盖片，然后用指甲油密封。在允许幻灯片在室温下干燥 24 小时后，通过共焦显微镜可视化免疫染色和碘化物的吸收。鼻皮质-海马细胞切片描绘了体外七天的混合间歇和冰晶状活动。在体外14天，自发活动的特点是ictal放电，在体外21天进化为压倒性的ictal活动，ictal事件持续超过1分钟。对神经元标记NeuN的碘化物吸收和免疫化学在7天内在体外切片中暴露出一些神经元死亡，在海马体的所有区域，体外14天时，神经元死亡显著增加。在体外七天，低CD68表达的充血微胶质比Iba1正CD68正反应微胶质更丰富。而在体外14天，在海马的所有区域，Iba1正CD68正阿莫博德M1微胶质超过微胶质与低CD68表达。在体外14天，一些Iba1阳性CD68阳性细胞具有超后果的外观可以精确定位，这表明M2抗炎微胶质表型的可能性。在体外7天，CD3的表达几乎无法检测，而在14天的体外切片中，可以观察到高营养胶质纤维酸性蛋白阳性CD3正星形细胞，这表明A1星形细胞的渐进激活。准备鼻皮质-河马片与极端小心。确保去除海马上方多余的组织，因为它可能会在切片过程中损害切片完整性。结构性赤字将对切片生存能力产生负面影响。除了演示的方法外，还可以在该系统中应用大量检测方法，如西方污点分析、实时 PCR 和 ELISA，以解决有关癫痫发生的具体问题。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

海马脑片的器官型检查神经元损伤的文化模式

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

科研

神经科学

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

切片的制备，组织器官型培养，并记录在视交叉上核时钟基因活性的荧光素酶

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海马切片培养

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

器官型小脑文化：细胞凋亡的挑战和检测

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从大脑皮层的器官型切片制备全细胞记录

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器官型培养的神经元雪崩多电极阵列记录

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