Name: a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures
Uploaded: 2021-03-18T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר ביחידת הביו-הדמיה של המכון המולקולרי של מדיצ'ינה ז'ואאו לובו אנטונס, על כל ההצעות הנוגעות לרכישת תדמית.
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) באמצעות פרויקט PTDC/MEDFAR/30933/2017 ופקולדה דה מדיצ'ינה דה אוניברסיטת ליסבון.

החוק הפורטוגלי והנחיות האיחוד האירופי (2010/63/EU) כובדו בכל ההליכים הנוגעים להגנה על בעלי חיים למטרות מדעיות. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הגוף המוסדי לרווחת בעלי חיים (ORBEA-iMM) והרשות הלאומית המוסמכת (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. הכנת פרוסות קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס
הערה: הכנת פרוסות קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס משתמשת בחולדות P6-7 ספראג-דוולי.
<ol><li>מערך תרבות והכנה בינונית<ol>
<li>ביום שלפני התרבות, הכינו את המדיה הנדרשת והניחו אותם על 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הכינו מדיום ניתוח: 25 מ"מ גלוקוז בתמיסת המלח המאוזן (GBSS) של גיי.</li>
		<li>הכינו מדיום תרבותי: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% סרום סוסים (HS), 25 מ"מ גלוקוז, 30 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין.</li>
		<li>הכן אמצעי תחזוקה: נוירובסאל-A (NBA), 2% B27, 1 מ"מ ל-גלוטמין, 30 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, HS (15%, 10%, 5% ו-0%).</li>
	</ol></li>
	<li>קצירת מוח<ol>
<li>רגע לפני תחילת התרבות, הוסיפו 1.1 מ"ל של מדיום תרבות לכל באר של צלחת 6 בארות עם פיפטה P1000 ומניחים אותה ב 37 °C (66 °F).</li>
		<li>מניחים את כל הציוד (מיקרוסקופ דיסקציה, מסוק רקמות, מנורת ניתוח, כלי ניתוח, אלקטרודות, צלחות, מוסיף ונייר סינון) בתוך ארון הבטיחות הביולוגית לעקר תחת אור UV במשך 15 דקות.</li>
		<li>להתאים את עובי הפרוסה ל 350 מיקרומטר.</li>
		<li>משוך את GBSS מהמקרר. הוסיפו 5 מ"ל של GBSS לשש מנות פטרי. שש מנות פטרי יידרשו לכל חיה.</li>
		<li>המתת חסד לגור החולדות. בצע עריפת ראש באמצעות מספריים חדים בבסיס גזע המוח של החיה.</li>
		<li>לשטוף את ראש החיה שלוש פעמים GBSS קר ולקחת אותו בתוך ארון הבטיחות.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד רקמות והכנת פרוסות<ol>
<li>הכנס בחוזקה מלקחיים חדים לארובות העין כדי להחזיק את הראש.</li>
		<li>באמצעות מספריים דק לחתוך את העור / הקרקפת לאורך קו האמצע החל הקדמי החוליות לכיוון האונות הקדמיות ולשים אותו בצד.</li>
		<li>חותכים באותו אופן את הגולגולת ולאורך הסדק הרוחבי המוחי (רווח בין המוח למוח הקטן). עם מלקחיים ארוכים מעוגלים, תזיזו את זה לגזרים.</li>
		<li>השלך את נורות הריח עם מרית. הסירו את המוח מהראש והניחו אותו ב-GBSS קר כקרח כשמשטח הגב פונה כלפי מעלה (איור 1A).</li>
		<li>הכנס את המלקחיים העדינים לתוך המוח הקטן ולך לאורך קו האמצע עם המרית שפותחת כל חצי כדור בזהירות רבה(איור 1B).</li>
		<li>עם מלקחיים עקומים קצרים, להסיר בזהירות את הרקמה העודפת המכסה את ההיפוקמפי, מבלי לגעת במבנה ההיפוקמפוס. לאחר מכן, עם מרית, חותכים מתחת לכל היפוקמפוס(איור 1C).</li>
		<li>להרים חצי כדור אחד ומניחים אותו, עם היפוקמפוס פונה כלפי מעלה, על נייר סינון. חזור על ההליך עם ההמיספרה האחרת ומקם אותו במקביל לראשון, בנייר הסינון. שים את נייר הסינון על מסוק הרקמות, כאשר ההמיספרות ניצבות ללהב, וחתך את ההמיספרות בפרוסות של 350 מיקרומטר(איור 1D).</li>
		<li>מניחים את הרקמה הפרוסה בצלחת פטרי עם GBSS קר(איור 1E).</li>
		<li>הפרד בזהירות את הפרוסות באמצעות אלקטרודות הקצה העגול(איור 1F). שמור רק את הפרוסות עם קליפת רין שלם מבנית והיפוקמפוס. אזורי DG ו- CA צריכים להיות מוגדרים בצורה מושלמת, כמו גם את קליפת המוח האנטורינלית והפרירינאלית(איור 1G).</li>
		<li>מניחים כל פרוסה על התוסף (איור 1H-I), עם מרית ואלקטרודה עם קצה עגול. הסר מדיום ניתוח עודף סביב כל פרוסה באמצעות פיפטה P20 (איור 1J). ארבע פרוסות קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס יכולות להיות תרבותיות בהכנסה אחת(איור 1K).</li>
	</ol></li>
	<li>תחזוקת תרבות<ol>
<li>לשנות את המדיום כל יומיים.</li>
		<li>מחממים את המדיום ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קח את הצלחות מהחממה. הרם כל הוספה על-ידי החזקת קצה הפלסטיק עם מלקחיים (איור 1L).</li>
		<li>השתמש ביד חופשית כדי לשאוף את המדיום מהבאר. מניחים את ההוספה בחזרה לבאר ומוסיפים 1 מ"ל, עם פיפט P1000, של מדיום מחומם טרי (איור 1M). חזור על הפעולה עבור כל התוספות. ודא שאין בועות אוויר לכודים בין הממברנה למדיום.</li>
	</ol></li>
</ol>הערה: פרוסות דמויי אפילפטיות עוברות מחסור הדרגתי ומבוקר בסרום במדיום. מ 9 ימים במבחנה (DIV) על, פרוסות נשמרים ב-NBA ללא HS14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig01.jpg"> איור 1: הליך מפורט להכנת פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. (A)הסר את המוח מהראש והנח אותו ב GBSS קר כקרח עם משטח הגב פונה כלפי מעלה. (B) הכנס את המלקחיים לתוך המוח הקטן. פתח את המוח דרך קו האמצע ולהסיר את הרקמה העודפת מעל ההיפוקמפוס. (C) עם מרית לחתוך מתחת להיפוקמפוס, כפי שצוין על ידי החצים. (D)מניחים את ההיפוקמפי פונים כלפי מעלה ומקבילים זה לזה על נייר המסנן וחותכים פרוסות 350 מיקרומטר על מסוק הרקמות. (E)מניחים את ההיפוקמפוס הפרוס ב- GBSS קר כקרח. (ו)להפריד את הפרוסות בעזרת אלקטרודות זכוכית עגולות. (G) בחר רק את הפרוסות המתארות קליפת רין שלמה והיפוקמפוס. (H, I) בעזרת אלקטרודה זכוכית עגולה הטה לדחוף כל פרוסה למרית ומניחים אותו על הכנס. (J) הסר את GBSS המקיף את הפרוסה. (K) מקם ארבע פרוסות לכל הוספה. (L)כדי לשנות את המדיום, הרם את ההכנס ושואף את המדיום עם פיפטה מזכוכית. (M) הוסף מדיום טרי על ידי הצבת פיפטה בין הכנס ואת הקירות של צלחת 6 בארות. ודא שאין בועות אוויר מתחת לפרוסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות
הערה: הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בוצעו בפרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס ב-7, 14 ו-21 DIV בתא מסוג ממשק. הקלטות התקבלו עם מגבר, דיגיטציה ונותחו עם תוכנה. כל ההקלטות סוננו על ידי מעבר פס (מסנן בסל שמונה עמודים במסנן 60 הרץ וגאוסיאני ב-600 הרץ).
<ol><li>הכנת התקנה<ol>
<li>הכן 50 מ"ל של מדיום NBA עם 1 מ"ל של B27 ו 250 μL של L-גלוטמין. להתחמם ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הגדר את מערך האלקטרופיזיולוגיה במעגל סגור. ודא אם קצב הזרימה הוא 2 מ"ל לדקה.</li>
		<li>פתח את תיבת התיו (5% CO2/95% O2)שסתום ולבדוק את מפלס המים במערכת.</li>
		<li>שים את נייר המסנן בתא הקלטת הממשק כדי לנקז מדיום עודף ואת נייר ניקוי העדשה מתחת למסגרת כדי לספק בינוני לפרוסה.</li>
		<li>הפעל את בקר הטמפרטורה, את המגברים ואת המיקרומניפולטור.</li>
		<li>תן את הטמפרטורה בתא ממשק להתייצב ב 37 °C (69 °F) לפני תחילת ההקלטות.</li>
		<li>הכן נוזל שדרתי מלאכותי (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 25 מ"מ NaHCO3, 10 מ"מ גלוקוז, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 עם pH 7.4) ולהשתמש בו כדי למלא את אלקטרודה זכוכית עם מזרק. שים את זה באלקטרודה המקבלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקלטות של פעילות ספונטנית<ol>
<li>לאחר שהטמפרטורה יציבה, מוציאים את הצלחת מהחממה וחותכים פרוסה אחת מההכנסה עם להב חד מאוד. מניחים אותו בצלחת 60 מ"מ עם טיפה של בינוני. קח את זה לתא ההקלטה של הממשק.</li>
		<li>מניחים את הפרוסה בתא הממשק עם ההיפוקמפוס בפינה הימנית התחתונה. מקם את האלקטרודה המקבלת בשכבת התא הפירמידלי CA3.</li>
		<li>המשך לפרוטוקול הרכישה הרציף ורשומה למשך 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מבחני ספיגת PI
הערה: מוות תאי הוערך על ידי ניטור ספיגת הסלולר של יודיד צבע פלואורסצנטי (PI). PI הוא תרכובת קוטבית, אשר נכנס לתאים עם קרום התא פגום אינטראקציה עם DNA פולט פלואורסצנטיות אדומה (ספיגה 493 ננומטר, פליטה 630 ננומטר). מאז PI אינו חדיר לתאים חיים, הוא משמש כדי לזהות תאים מתים באוכלוסייה.
<ol><li>דגירה PI<ol>
<li>הכן, במדיום תרבות, דילול טרי 1:10 של מלאי PI.</li>
		<li>לבדיקת ספיגת PI להסיר את הצלחת מן החממה בזהירות להעלות את הכנס. הוסף 13 μL של PI למדיום, עם פיפטה P20, קבלת ריכוז סופי של 2 מיקרומטר.  להתסיס לאט את הצלחת לפני לשים את הכנס בחזרה במקום. ודא שאין בועות מתחת לפרוסות.</li>
		<li>מחזירים את הפרוסות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.</li>
		<li>המשך עם פרוטוקול האימונוהיסטוכימיה, כמתואר בסעיף הבא. מכסים את הצלחות עם אלומיניום, שכן PI הוא רגיש לאור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. אימונוהיסטוכימיה
הערה: באימונוהיסטוכימיה נוגדן ספציפי לנוירונים, כמו גם נוגדנים המסוגלים להפלות פנוטיפים נחים ומגיבים של מיקרוגליה ואסטרוציטים, שימשו להערכת משך המוות העצבי והגליוזיס בפרוסות אורגנוטיפיות דמויי קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס.
<ol><li>קיבוע רקמות<ol>
<li>מוציאים את הצלחת מהחממה ושואבים את המדיום. לתקן את הפרוסות עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 1 שעה ב RT, על ידי הוספת 1 מ"ל של PFA מתחת ומעל הפרוסות, עם פיפטה P1000.</li>
		<li>הסר את PFA ולהוסיף 1 מ"ל של PBS. הוסיפו גם PBS מתחת ומעל לפרוסות.</li>
		<li>שמור את הפרוסות ב 4 מעלות צלזיוס, ב PBS, עד לשימוש נוסף. תמיד לשים parafilm סביב הצלחות, כדי למנוע ייבוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שלבים חיסוניים<ol>
<li>לשטוף פעמיים, 10 דקות בכל פעם, עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>הכינו פתרון חדירות/חסימה המכיל 1% טריטון-X100, 10% HS ו-10% BSA ב-PBS. הכן פתרון BSA של 5%.</li>
		<li>ציירו שני מלבנים בעזרת העט ההידרופובי (איור 2A). חותכים את הפרוסות מההכנסה (איור 2B)בלהב חד במיוחד. שים שתי פרוסות לשקופית (איור 2C)והוסף 140 μL של פתרון חדירה/חסימה בחלק העליון של כל פרוסה, באמצעות פיפטה P200. דגירה במשך 3 שעות ב RT.</li>
		<li>לדלל את הנוגדנים העיקריים לדילול העבודה ב 5% BSA ב PBS. דגירה עם הנוגדנים העיקריים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>דגירה עם הנוגדנים המשניים עבור 4 שעות ב RT. משלב זה הלאה, להגן על הצלחת מפני אור מאז פלואורופורים הם עובדים עם.</li>
		<li>מניחים טיפה 50 μL של פתרון Hoechst על החלק העליון של כל פרוסה דגירה במשך 20 דקות ב RT.</li>
		<li>לשטוף בין הדגירה. תמיד לשטוף שלוש פעמים, במשך 10 דקות בכל פעם, עם PBS-T.</li>
		<li>הסר Hoechst ולשטוף כמומלץ.</li>
		<li>מוסיפים 50 μL של מדיום הרכבה בחלק העליון של כל פרוסה. מכסים בכיסויי זכוכית ומקיפים בלק ציפורניים (איור 2D).</li>
		<li>תן לו להתייבש ב RT במשך 24 שעות.</li>
		<li>דמיינו את המערכת החיסונית מתחת למיקרוסקופ קונפוקאלי. שמור את הפרוסות המוכתמות ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig02.jpg"> איור 2: הליך ספציפי לבדיקת האימונוהיסטוכימיה. (A) עם העט ההידרופובי לצייר שני ריבועים בשקופית. (B) גזור את פיסת ההוספה המכילה את הפרוסה. (ג)מניחים כל פרוסה בריבועים המצוירים בעט הידרופובי ומתחילים את שלב ההחלחלה/חסימה. (D) לאחר סיום הפרוטוקול, לסיים על ידי הרכבה פרוסות בינוני הרכבה, מכסה עם כיסוי זכוכית ומקיף אותו עם לק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol>
	<li>Fisher, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy.">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51, 899-908 (2010).</li><li>Loscher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs.">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20, 359-368 (2011).</li><li>Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S., Pitk&#228;nen, A., Schwartzkroin, P. A., Mosh&#233;, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+in+vitro+seizure+models+in+acute+and+organotypic+slices.">An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices.</a> Models of seizures and epilepsy. , 35-44 (2006).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).</li><li>Holopainen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures:+a+model+system+to+study+basic+cellular+and+molecular+mechanisms+of+neuronal+cell+death,+neuroprotection,+and+synaptic+plasticity.">Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity.</a> Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).</li><li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage,+neuroprotection+and+neurorepair.">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair.</a> CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).</li><li>Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interictal+spikes+precede+ictal+discharges+in+an+organotypic+hippocampal+slice+culture+model+of+epileptogenesis.">Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis.</a> Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).</li><li>Chong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Inflammation+Is+a+Potential+Anti-Epileptogenic+Target+in+the+Organotypic+Hippocampal+Slice+Model.">Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model.</a> Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).</li><li>Li, Q., Han, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slices+as+models+for+stroke+and+traumatic+brain+injury.">Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury.</a> Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).</li><li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics.">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+a+review.">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+cerebellar+slices+as+a+model+to+investigate+demyelinating+disorders.">Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).</li><li>Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piriform,+perirhinal,+and+entorhinal+cortex+in+seizure+generation.">The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).</li><li>Magalh&#227;es, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltr&#227;o-Cavacas, C., Sebasti&#227;o, A. M., Valente, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+model+of+epilepsy+in+organotypic+slices+-+a+new+tool+for+drug+screening.">Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).</li><li>Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+prevention+of+epileptogenesis.">Inflammation and prevention of epileptogenesis.</a> Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).</li><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia.">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3+is+activated+in+human+AD+brain+and+is+required+for+neurodegeneration+in+mouse+models+of+amyloidosis+and+tauopathy.">Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy.</a> Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).</li><li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+3+-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases,+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia.">Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).</li><li>Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+conformational+forms+of+target-bound+iC3b+that+distinctively+bind+complement+receptors+1+and+2+and+two+specific+monoclonal+antibodies.">Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה היו חיוניים לגילוי של AEDs רבים, אולם הם דורשים בעלי חיים רבים ורובם זמן רב בשל התקופה הסמויה להתפרצות התקפים. אינדוקציה מגנזיום נמוך של פעילות אפילפטיפורם בפרוסות חריפה ההיפוקמפוס גם תוקן ביסודיות בספרות3, אבל פרוסות חריפות יש כדאיות 6-12 שעות מה שהופך את זה בלתי אפשרי להעריך שינויים ארוכי טווח. פרוסות organotypic ניתן לשמור בתרבות מימים עד שבועות, המאפשר להתגבר על זמן הכדאיות הקצרה של פרוסות חריפות, מודלים של אפילפטוגנזה בפרוסות היפוקמפוס organotypic הוצעו3,7,8.
כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות organotypic, הכולל את קליפת המוח rhinal ואת ההיפוקמפוס. לפרוסות אלה לוקח 15-20 דקות להכין לכל בעל חיים, החל מהקרבת בעלי חיים ועד להצבת פרוסות על התוספות, וניתן להשיג 6-8 פרוסות לכל חצי כדור. יש לנקוט משנה זהירות בעת פתיחת חצי הכדור כדי לחשוף את ההיפוקמפוס וכאשר מסירים את הרקמה מנייר הסינון לאחר ההסתעפות. עודף רקמה מעל ההיפוקמפוס יכול גם לסכן את שלמות הפרוסה במהלך ההחתכה.
פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס מתארות פעילות מתפתחת דמוית אפילפטית הדומה לאפילפסיה של vivo. לאחר שבוע בתרבות, רוב הפרוסות מתארות פעילות מעורבת דמוית ictal, אשר מתקדמת לאירועים דמויי ictal בלבד עם זמן בתרבות. עד כה, רשמנו כמה הפרשות interictal בפרוסות עם 2-3 שבועות. במערכת זו, פעילות דמוית אפילפטית נראה לפתח מהר יותר מאשר פרוסות היפוקמפוס organotypic. ניתן לייחס זאת לנוכחות קליפת המוח הריאנלית, המשמרת את רוב הקלט הפונקציונלי להיפוקמפוס. כדי לטפל באופן מלא בבעיה זו, אפיון מלא של האותות האפילפטיים המוצגים על ידי פרוסות אלה לאורך זמן בתרבות, כגון מספר ומשך האירועים ictal, יחד עם משרעת ותדירות שלהם, מתבצע כעת.
מערכת זו יכולה להישמר בתרבות במשך יותר משלושה שבועות, ומחקה קורלציות מולקולריות רבות של אפילפסיה, כגון מוות עצבי, הפעלה של microglia ואסטרוציטים וייצור מוגבר של ציטוקינים פרו דלקתיים14, המאפשר אפיון ארוך טווח של היבטים אלה. הוא מייצג גם פלטפורמת סינון קלה לשימוש, שבה ניתן ליישם התערבויות תרופתיות המכוונות למסלולים תאיים ספציפיים וניתן לבדוק מטרות טיפוליות פוטנציאליות. אין ספק, המערכת המוצגת כאן יכולה לעזור להאיר עוד יותר את המנגנונים של אפילפטוגנזה.

אפילפסיה, אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר בעולם, מאופיינת בהתרחשות תקופתית ובלתי צפויה של פעילות עצבית מסונכרנת ומוגזמת במוח. למרות תרופות אנטי אפילפטיות שונות (AEDs) זמין, שליש מהחולים עם אפילפסיה הם עקשן לטיפול1 וממשיכים לחוות התקפים וירידה קוגניטיבית. יתר על כן, AEDs זמין לעכב קוגניציה בשל פעולות כלליות יחסית שלהם על פעילות עצבית. אפילפטוגנזה קשה ללמוד בבני אדם, בשל פציעות אפילפטוגניות מרובות והטרוגניות, תקופות סמויות ארוכות שנמשכות חודשים עד עשרות שנים, ואת ההשפעות המטעות של טיפול נוגד פרוצים לאחר ההתקף הספונטני הראשון.
זיהוי של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול באפילפסיה התאפשר עקב מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה: 1) מודלים גנטיים, המשתמשים בבעלי חיים נטייה גנטית שבהם התקפים מתרחשים באופן ספונטני או בתגובה לגירוי חושי; 2) מודלים של התקפים הנגרמים על ידי גירוי חשמלי; ו -3) מודלים תרופתיים של אינדוקציה התקפים המשתמשים pilocarpine (אגוניסט קולטן muscarinic), kainate (אגוניסט קולטן kainate) או 4-aminopyridine (חוסם ערוץ אשלגן), בין היתר. מודלים אלה היו חיוניים בהבנת השינויים ההתנהגותיים, כמו גם מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס האפילפסיה, והם הובילו לגילוי של AEDs רבים2.
ההכנות Ex vivo הם גם כלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים הבסיסיים אפילפטוגנזה ו ictogenesis. פרוסות היפוקמפוס חריפות, המאפשרות מחקרים אלקטרופיזיולוגיים של תאים חיים על פני תקופה של 6-12 שעות, ופרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפי שניתן לשמר באינקובטור על פני תקופה של ימים או שבועות שימשו בהרחבה במחקרים על פעילות אפילפטיפורם3.
פרוסות מוח אורגנוטיפיות מוכנות מרקמה מושתלת ומייצגות מודל תלת מימדי פיזיולוגי של המוח. פרוסות אלה משמרות את הציטו-ארכיטקטורה של אזור העניין וכוללות את כל תאי המוח ואת התקשורת הבין-תאית שלהם4.  האזור הנפוצץ ביותר עבור תרבויות organotypic לטווח ארוך הוא ההיפוקמפוס, כמו אזור זה מושפע אובדן עצבי בתנאים ניווניים מרובים. הם היו בשימוש נרחב כדי מודל הפרעות מוחיות נחשבים כלים מצוינים להערכת הפוטנציאל neuroprotective וטיפולי של התרופה5,6. מודלים של אפילפטוגנזה, שבץ ורעילות הנגרמת על ידי Aβ תוארו בפרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס7,8,9,10. מחלת פרקינסון נחקרה במזנספלון גחוני ובסטריאטום, כמו גם בקליפת המוח-קורפוס כפיסטום-סטריאטום-סובסטנציה ניגרה, פרוסות אורגנוטיפיות11. תרבויות פרוסת המוח הקטן Organotypic לחקות היבטים רבים של myelination אקסון ותפקודים מוחיים והם מודל נפוץ לחקור אסטרטגיות טיפוליות חדשניות בטרשת נפוצה12.
עם זאת, מחקר קליני ומודלים של בעלי חיים של אפילפסיה הציעו כי קליפת המוח הריאנאלית, המורכבת על ידי קליפות קליפת המוח הפרירינלית והאנטוריניאלית, ממלאת תפקיד בדור ההתקפים13. לכן, מודל של אפילפטוגנזה בקליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס פרוסות organotypic הוקמה14. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיות, שלא כמו פרוסות אנלוגיות שתמיד נשמרות במדיום המכיל סרום.
באפילפסיה, כמו במחלות חריפות וכרוניות רבות של מערכת העצבים המרכזית, הראייה הנוירוצנטרית אינה מצליחה להבהיר את המנגנונים שבבסיס הופעת המחלה והתקדמותה. ראיות קליניות וניסיוניות מצביעות על דלקת במוח, שבה מיקרוגליה ואסטרוציטים ממלאים תפקיד רלוונטי, כאחד משחקני המפתח התורמים לתהליך האפילפטי. ניסויים תרופתיים במודלים של בעלי חיים של אפילפסיה מראים כי השפעות אנטי אפילפטוגניות ניתן להשיג על ידי מיקוד מסלולים פרו דלקתיים, וכיום neuroinflammation נחשב כאפשרות חדשנית לפיתוח גישות טיפוליות עבור אפילפסיה15.
כאן, אנו מתארים ביסודיות את הכנת תרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס rhinal, כמו גם את הפרטים לתיעוד פעילות אפילפטיפורמית ספונטנית מהם. אנו מדגישים כי מערכת זו מחקה מספר היבטים נוירו-אינפלציה של אפילפסיה, ובכך מתאים לחקור את התפקיד של תאי גליה ו neuroinflammation בפתולוגיה זו. יתר על כן, הוא מייצג פלטפורמה קלה לשימוש להקרנה של גישות טיפוליות פוטנציאליות לאפילפסיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-C3d (goat)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2655</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68 (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31630-125ug</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (mouse)</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108539</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN (rabbit)</td>
			<td>Werfen</td>
			<td>16712943S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#8482; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td>5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain/Tissue Slice Chamber System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>BB15, Function Line</td>
			<td>Set to 37 &#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08342.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution, 45% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope/magnifier</td>
			<td>MEIJI TECHNO CO. LTD</td>
			<td>122285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps Standard Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin stock solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution (GBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-919-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Electrodes</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-10</td>
			<td>Round tips homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stock solution at 2 mg/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, Heat Inactivated (HS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>BSC-HT Haas Top</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatula Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10092-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>HERASafe</td>
			<td>HS 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaning Paper</td>
			<td>TIFFEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM (Q)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72,699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Clich&#233;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (NBA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#174; I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,87,94,295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO&#8324;3- in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P10, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td>Stock solution at 1 mg/mL in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL</td>
			<td>SOL-M</td>
			<td>161000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27800.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#8206;</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Astro Med Inc GRASS Product Group</td>
			<td>S48 Stimulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Scissors Straight SharpSharp 12cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus&#8482; Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 6-Wells Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatue controller</td>
			<td>MEDICAL SYSTEMS CORP.</td>
			<td>TC-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 350 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures

תרבויות פרוסות Organotypic כבר בשימוש נרחב מודל הפרעות מוחיות נחשבים פלטפורמות מצוינות להערכת הפוטנציאל neuroprotective וטיפולי של התרופה. פרוסות Organotypic מוכנות מרקמה מוסברת ומייצגות סביבת אקס ויוו רב-תאית מורכבת. הם משמרים את הציטו-ארכיטקטורה התלת מימדית והסביבה המקומית של תאי המוח, שומרים על הקישוריות העצבית ועל האינטראקציה ההדדית בין הנוירונים לגליה. פרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס נחשבות מתאימות לחקור את המנגנונים הבסיסיים של אפילפטוגנזה, אך מחקר קליני ומודלים של בעלי חיים של אפילפסיה הראו כי קליפת המוח הריאנלית, המורכבת מקליפת המוח הפרירינלית והאנטורינית, ממלאת תפקיד רלוונטי בדור ההתקפים.
כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. הקלטות של פעילות ספונטנית מאזור CA3 תחת זלוף עם מדיום צמיחה מלא, בטמפרטורה פיזיולוגית ובהיעדר מניפולציות תרופתיות, הראו כי פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים לאורך זמן בתרבות. מוות תאי מוגבר, באמצעות propidium יודיד ספיגת asssay, גליוזיס, מוערך עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית, נצפתה גם. הגישה הניסיונית שהוצגה מדגישה את הערך של תרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס rhinal כפלטפורמה לחקר הדינמיקה וההתקדמות של אפילפטוגנזה ולסנן מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור פתולוגיה זו של המוח.

בהתבסס על תיאורים קודמים של ניתוח אותות אפילפטיים בפרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות, הפרשות אפילפטיות בין-מדינתיות מוגדרות כאן כפריקים פרוקסימליים המובחנים בבירור מפעילות רקע, עם שינוי פתאומי בקוטביות ומתרחשים בתדר נמוך (<2 הרץ). הפרשות Paroxysmal שנמשך יותר מ 10 s ומתרחשים בתדירות גבוהה יותר (≥2 הרץ) מאופיינים כפעילות אפילפטיפורם ictal. אם אירוע ictal מתרחש בתוך 10 s לאחר הקודם, שני אירועים אלה נחשבים רק אירוע ictal אחד.
פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנאלית ב-7 DIV (איור 3A)מתארות פעילות מעורבת דמוית אינטרקלים ואינטלים. ב-14 DIV (איור 3B),פעילות ספונטנית מאופיינת בהפרשות ictal, המתפתחות לפעילות ictal מדהימה ב- 21 DIV, עם אירועי ictal הנמשכים >1 דקות (איור 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig03.jpg"> איור 3: פעילות אפילפטיפורמית ספונטנית של פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. אירועים אלקטרוגרפיים מייצגים דמויי תפיסה, המתועדים מאזור CA3 בתא מסוג ממשק, לאחר (A) 7 DIV, (B) 14 DIV ו - (C) 21 DIV. פרטי תפיסה מוצגים במעקבים נמוכים יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בדיקות ספיגת PI ואחריו אימונוהיסטוכימיה נגד הסמן העצבי NeuN שמטרתו לזהות מוות עצבי. ספיגת PI על ידי נוירונים פרטניים ופירמידליים נצפתה ב-7 פרוסות DIV (חצים באיור 4A),אך מספר תאי העצב PI+ גדל ב-14 DIV (חצים באיור 4B),מה שמאשש מוות עצבי מוגבר עם התקדמות האפילפטוגנזה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig04.jpg"> איור 4: תמונות מייצגות של פרוסות אורגנוטיפיות מוכתמות בקליפת המוח של נויN ו-PI בהיפוקמפוס. תמונות של נוירונים בוגרים מוכתמים NeuN ותאים חיוביים PI נרכשו ב (A) 7 DIV ו - (B) 14 DIV, על מיקרוסקופ לייזר confocal עם מטרה 20x. מוצגות תמונות מוגדלות של האזורים המקווקווים. החצים מצביעים על נוירונים למוות (בכתום). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כתם כפול של Iba1, יחד עם CD68, שימש להערכת פנוטיפ microglia. Iba1 הוא סמן microglia/מקרופאגים, בעוד CD68 הוא חלבון ליזוזומלי לידי ביטוי ברמות גבוהות על ידי microglia תגובתי ברמות נמוכות על ידי מנוחה microglia. ב-7 פרוסות DIV, מיקרוגליה פרועה עם ביטוי CD68 נמוך (חצים באיור 5A)שופעת יותר מאיבא1+/CD68+ מיקרוגליה תגובתית (ראשי חץ באיור 5A),ואילו ב-14 DIV, בכל אזורי ההיפוקמפוס, Iba1+/CD68+ microglia M1 סבוך/אמובואיד (ראשי חץ באיור 5B)חורגים ממיקרוגליה עם ביטוי CD68 נמוך (חצים באיור 5B). ב 14 DIV כמה Iba1+/CD68+ תאים עם מראה היפר-השלכות ניתן להצביע (ראשי חץ פתוחים באיור 5B), אשר עשוי להציע את המופע של פנוטיפ אנטי דלקתי M2 של microglia. עם זאת, עניין זה דורש מחקר נוסף.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי פציעות מערכת העצבים המרכזית ייזום שונים יכולים לעורר לפחות שני סוגים של אסטרוציטים תגובתי, A1 ו- A2, עם אסטרוציטים A1 להיות neurotoxic16. A1 תת סוג של אסטרוציטים מאופיין בביטוי מוגבר של משלים C316,17,18. המשלים C3, אשר ממלא תפקיד מרכזי בהפעלת המערכת המשלימה, מייצר C3b, אשר מושפל עוד יותר iC3b, C3dg ו C3d19. לכן, כתם כפול של GFAP ו C3d הועסק כדי להעריך אסטרוליוזיס. ב- 7 DIV הביטוי של C3d בקושי ניתן לגילוי (איור 6A), ואילו ב- 14 פרוסות DIV ניתן לצפות ב- GFAPהיפרטרופי +/C3d+ אסטרוציטים (ראשי חץ באיור 6B), דבר המצביע על הפעלה הדרגתית של אסטרוציטים A1.
התוצאות מראות הפעלה מתקדמת של microglia ואסטרוציטים לאורך כל אפילפטוגנזה, מחקה את האירועים המתוארים בחולים עם אפילפסיה ובמודלים של בעלי חיים של פתולוגיה זו.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2.jpg"> איור 5: תמונות מייצגות של איבא1 ו-CD68 מוכתמות בפרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח-היפוקמפוס מוכתמות. תמונות של איבא1 ו- CD68 מיקרוגליה מוכתמת, וגרעיני מוכתם Hoechst, נרכשו ב (A) 7 DIV ו - (B) 14 DIV, על מיקרוסקופ לייזר confocal עם מטרה 20x. מוצגות תמונות מוגדלות של האזורים המקווקווים. החצים מצביעים על Iba1+/CD68- נח microglia, ראשי חץ מצביעים Iba1+/ CD68+ microglia סבוך / אמובואיד וראשי חץ פתוחים לחשוף Iba1+/ CD68+ microglia hyper-ramified. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig06.jpg"> איור 6: תמונות מייצגות של GFAP ופרוסות אורגנוטיות מוכתמות בקליפת המוח-היפוקמפוס C3d. תמונות של אסטרוציטים מוכתמים GFAP ו- C3d, וגרעיני מוכתם Hoechst, נרכשו ב (A) 7 DIV ו - (B) 14 DIV, על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי עם מטרה 20x. מוצגות תמונות מוגדלות של האזורים המקווקווים. ראשי חץ מצביעים על GFAP+/C3d+ אסטרוציטים A1 תגובתי (בצהוב). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים ויכולים להיחשב מודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו מייצגת כלי מצוין לניטור הדינמיקה של פעילות ספונטנית, כמו גם להערכת ההתקדמות של תכונות נוירואינפלמטוריות לאורך כל מהלך אפילפטוגנזה.

מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

אפילפסיה היא מחלה נוירולוגית נפוצה. פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיות הדומים לאפילפסיה של vivo ולכן יכולים לשמש כמודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו היא אכן כלי מצוין לניטור הדינמיקה וההתקדמות של אפילפטוגנזה, כמו גם לסינון מטרות טיפוליות פוטנציאליות לפתולוגיה זו של המוח.מי שידגימו את ההליכים איתי יהיו התלמידים שלי פרנסיסקו מדה ומפאלדה קרבאליו. כדי לקצור את המוח מיום שלאחר הלידה שישה עד שבעה גור Sprague-Dawley, הראשון לשטוף את הראש שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של GBSS. עובדים בארון biosafety, בחוזקה להכניס מלקחיים חדים לתוך ארובות העין להחזיק את הראש במקום ולהשתמש מספריים קצה דק לחתוך את הקרקפת לאורך קו האמצע מן הקדמי החוליות לאונות הקדמיות.חותכים את הגולגולת באותו אופן ולאורך הסדק הרוחבי המוחי ומשתמשים במלקחיים ארוכים מעוגלים כדי להפריד את חתיכות הגולגולת. השתמש מרית כדי להשליך את נורות חוש הריח ולהעביר את הצד הגבי של המוח לתוך צלחת 60 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של GBSS קר. הכנס מלקחיים עדינים לתוך המוח הקטן והכנס את המרית לאורך קו האמצע כדי לפתוח בזהירות את חצי הכדור.השתמש במלקחיים מעוגלים קצרים כדי להסיר בזהירות את הרקמה העודפת המכסה את ההיפוקמפוס מבלי לגעת במבנה ההיפוקמפוס, ולאחר מכן לחתוך מתחת לכל היפוקמפוס. מעבירים חצי כדור אחד בכל פעם בצד ההיפוקמפוס למעלה ומקבילים זה לזה על פיסת נייר סינון. מניחים את נייר המסנן על מסוק טישו עם ההמיספרות בניצב ללהב וחותכים את ההמיספרות ל -350 פרוסות מיקרון.מעבירים את הרקמה הפרוסה לצלחת פטרי חדשה המכילה חמישה מיליליטר של GBSS קר ולהשתמש באלקטרודות קצה עגולות כדי להפריד בזהירות את הפרוסות השומרות רק על הדגימות עם קליפת המוח הנזלת וההיפוקמפוס שלמים מבחינה מבנית. אזורי DG ו- CA צריכים להיות מוגדרים בצורה מושלמת, כמו גם את אזורי קליפת המוח האנטורינלית וההירינלית. השתמש מרית ואלקטרודה קצה עגול למקם עד ארבע פרוסות שלמות על מוסיף בודדים במספר המתאים של בארות של צלחת שש באר המכיל 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות לכל באר.השתמשו בפיפט P20 להסרת כל מדיום ניתוח עודף מסביב לכל פרוסה. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא. שנה את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.השתמש במלקחיים כדי להרים את ההוספה. שאפו את המדיום מהבאר המתאימה והניחו את ההכנסה בחזרה במקומה. השתמש פיפטה P1000 להוסיף מיליליטר אחד של טרי 37 מעלות צלזיוס בינוני לכל באר.הכינו את מערך האלקטרופיזיולוגיה במעגל סגור. ודא שקצב הזרימה של תא סוג הממשק מוגדר לשני מיליליטר לדקה ופתח את שסתום פחמימות-שור. בדוק את מפלס המים במערכת והנח פיסת נייר סינון בתא הקלטת הממשק כדי לנקז כל מדיום עודף.הנח פיסת נייר לניקוי עדשה מתחת למסגרת כדי לספק מדיום לפרוסה והפעל את בקר הטמפרטורה, המגברים והמיקרו מניפולטורים. השתמש במזרק כדי לטעון אלקטרודה זכוכית עם נוזל שדרתי מלאכותי מוכן טרי. מניחים את אלקטרודה זכוכית לתוך האלקטרודה המקבלת ולחכות הטמפרטורה בתא ממשק להתייצב ב 37 מעלות צלזיוס.עובדים בארון biosafety, מניחים את הכנס בצלחת 60 מילימטר עם טיפה של בינוני. השתמש להב חד כדי לחתוך פרוסה מן הכנס ומניחים את הפרוסה בתא ממשק עם ההיפוקמפוס בפינה הימנית התחתונה, ולאחר מכן למקם את האלקטרודה המקבלת לשכבת תא פירמידלי CA3, ליזום את פרוטוקול הרכישה רציפה, ולהקליט את הפרוסה במשך 30 דקות. כדי לבצע את מבחני ספיגת היודיד פרופידיום, לעבוד בארון biosafety.להרים את הכנס מן הבאר ולהוסיף יודיד propidium בינוני לריכוז הסופי של שני micromolar לכל באר. לאט להתסיס את הצלחת לפני הצבת הכנס בחזרה לתוך הבאר, דואג כי אין בועות מתחת לפרוסות. כאשר כל הפרוסות טופלו, להחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבות התא.עבור immunostaining של הפרוסות, בסוף הדגירה יודיד propidium, לשאוף את המדיום מתחתית כל באר ולהוסיף מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde לחלק העליון והתחתון של כל הכנס. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את הפרוסות פעמיים במשך 10 דקות ומיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף ולהשתמש בעט הידרופובי לצייר שני מלבנים על שקופיות מיקרוסקופ. השתמש בלהב חד כדי לחתוך את הפרוסות מהתוספות ולמקם פרוסה אחת בכל מלבן.הוסיפו תמיסת חסימת חדירות לכל פרוסה להדגרה של שלוש שעות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים את הנוגדנים העיקריים של עניין לכל פרוסה עבור דגירה של ארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את הפרוסות עם PBS-Tween שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף ולהדגיר את הפרוסות עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לשטוף את הפרוסות כפי שהוכח ולהוסיף 50 microliters של פתרון Hoechst לכל פרוסה עבור דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה Hoechst, לשטוף את הפרוסות שוב ולהוסיף 50 microliters של הרכבה בינונית לכל אחד, ולאחר מכן מניחים כיסוי על הפרוסות ולאטום עם לק. לאחר מתן אפשרות למגלשות להתייבש במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר, דמיינו את ספיגת האימונוסטין וההתעודדות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס מתארות פעילות בין-כוכבית ואיטלית מעורבת בשבעה ימים במבחנה. ב 14 ימים במבחנה, פעילות ספונטנית מאופיינת הפרשות ictal, אשר להתפתח לפעילות ictal מכריע ב 21 ימים במבחנה עם אירועי ictal שנמשך יותר מדקה אחת. ספיגת יודיד Propidium ואימונוהיסטוכימיה נגד הסמן העצבי NeuN גילה כמה מוות עצבי בשבעה ימים פרוסות במבחנה כי הוא גדל במידה ניכרת ב 14 ימים במבחנה בכל אזורי ההיפוקמפוס.בשבעה ימים במבחנה, microglia ramified עם ביטוי CD68 נמוך הם בשפע יותר מאשר Iba1 חיובי CD68 חיובי מגיב microglia. בעוד ב 14 ימים במבחנה, בכל האזורים של ההיפוקמפוס, Iba1 חיובי CD68 חיובי amoeboid M1 microglia יעלה microglia עם ביטוי CD68 נמוך. ב 14 ימים במבחנה, כמה איבא1 חיובי CD68 תאים חיוביים עם מראה השפעה היפר ניתן להצביע, מה שמרמז על האפשרות של פנוטיפ microglia אנטי דלקתיות M2.בשבעה ימים במבחנה, הביטוי של CD3 הוא בקושי לזיהוי, בעוד ב 14 יום פרוסות במבחנה, חלבון חומצי פרפור גליה היפרטרופית חיובי CD3 אסטרוציטים חיוביים ניתן לראות, מה שמרמז על הפעלה מתקדמת של אסטרוציטים A1. הכינו פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס בזהירות רבה. הקפד להסיר את הרקמה העודפת מעל ההיפוקמפוס כפי שהוא יכול לסכן את שלמות הפרוסה במהלך ההחתכה.גירעון מבני ישפיע לרעה על הכדאיות הפרוסה. בנוסף לגישות שהוכחו, ניתן להחיל על מערכת זו שפע של מבחנים כגון ניתוח כתמים מערביים, PCR בזמן אמת ו- ELISA כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי אפילפטוגנזה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

הכנת דגם לערער של Epileptogenesis פוסט במכרסמים

Partially isolated cortex ("undercut") is an animal model of posttraumatic epileptogenesis. The surgical procedure involves cutting through the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...