Name: a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures
Uploaded: 2021-03-18T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Отдел биовизуализации Молекулярного института медицины Жуана Лобо Антунеса за все предложения, касающиеся получения изображений.
Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 952455, Фонда за десятые технологии (FCT) через проект PTDC / MEDFAR / 30933/2017 и Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

<ol>
	<li>Fisher, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy.">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51, 899-908 (2010).</li><li>Loscher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs.">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20, 359-368 (2011).</li><li>Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S., Pitk&#228;nen, A., Schwartzkroin, P. A., Mosh&#233;, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+in+vitro+seizure+models+in+acute+and+organotypic+slices.">An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices.</a> Models of seizures and epilepsy. , 35-44 (2006).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).</li><li>Holopainen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures:+a+model+system+to+study+basic+cellular+and+molecular+mechanisms+of+neuronal+cell+death,+neuroprotection,+and+synaptic+plasticity.">Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity.</a> Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).</li><li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage,+neuroprotection+and+neurorepair.">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair.</a> CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).</li><li>Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interictal+spikes+precede+ictal+discharges+in+an+organotypic+hippocampal+slice+culture+model+of+epileptogenesis.">Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis.</a> Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).</li><li>Chong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Inflammation+Is+a+Potential+Anti-Epileptogenic+Target+in+the+Organotypic+Hippocampal+Slice+Model.">Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model.</a> Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).</li><li>Li, Q., Han, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slices+as+models+for+stroke+and+traumatic+brain+injury.">Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury.</a> Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).</li><li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics.">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+a+review.">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+cerebellar+slices+as+a+model+to+investigate+demyelinating+disorders.">Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).</li><li>Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piriform,+perirhinal,+and+entorhinal+cortex+in+seizure+generation.">The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).</li><li>Magalh&#227;es, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltr&#227;o-Cavacas, C., Sebasti&#227;o, A. M., Valente, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+model+of+epilepsy+in+organotypic+slices+-+a+new+tool+for+drug+screening.">Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).</li><li>Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+prevention+of+epileptogenesis.">Inflammation and prevention of epileptogenesis.</a> Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).</li><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia.">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3+is+activated+in+human+AD+brain+and+is+required+for+neurodegeneration+in+mouse+models+of+amyloidosis+and+tauopathy.">Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy.</a> Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).</li><li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+3+-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases,+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia.">Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).</li><li>Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+conformational+forms+of+target-bound+iC3b+that+distinctively+bind+complement+receptors+1+and+2+and+two+specific+monoclonal+antibodies.">Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Животные модели эпилепсии имели решающее значение для открытия многих БЭП, однако они требуют многих животных, и большинство из них отнимают много времени из-за латентного периода начала припадка. Низко магниевая индукция эпилептиформной активности при острых срезах гиппокампа также была тщательно пересмотрена в литературе3,но острые срезы имеют жизнеспособность 6-12 ч, что делает невозможным оценку долгосрочных изменений. Олово-ломтики могут сохраняться в культуре от дней до недель, что позволяет преодолевать короткие сроки жизнеспособности острых срезов, а предложены модели эпилептогенеза в органотипических срезах гиппокампа3,7,8.
Здесь мы описываем подготовку органотипических срезов, включающих ринную кору и гиппокамп. Эти ломтики занимают 15-20 мин для приготовления каждого животного, начиная от жертвоприношения животного до размещения ломтиков на вставках, и можно получить 6-8 ломтиков на полусферу. Особую осторожность необходимо соблюдать при вскрытии полушария для обнажения гиппокампа и при удалении ткани из фильтровальной бумаги после нарезки. Избыток ткани над гиппокампом также может поставить под угрозу целостность среза во время нарезки.
Ринная кора-гиппокамп органотипические срезы изображают развивающуюся эпилептикоподобную активность, напоминающую in vivo эпилепсию. После одной недели в культуре большинство срезов изображают смешанную межиктальную и иктальную активность, которая со временем в культуре прогрессирует до исключительно иктально-подобных событий. До сих пор мы зафиксировали несколько межстворных выделений в срезах за 2-3 недели. В этой системе эпилептическая активность, по-видимому, развивается быстрее, чем в органотипических срезах гиппокампа. Это может быть связано с наличием ринальной коры, которая сохраняет большую часть функционального входа в гиппокамп. Для полного решения этой проблемы в настоящее время проводится полная характеристика эпилептических сигналов, отображаемых этими срезами на протяжении всего времени в культуре, таких как количество и продолжительность иктальных событий вместе с их амплитудой и частотой.
Эта система может поддерживаться в культуре более трех недель и имитирует многие молекулярные корреляты эпилепсии, такие как гибель нейронов, активация микроглии и астроцитов и повышенная выработка провоспалительных цитокинов14,что позволяет долгосрочно охарактеризовать эти аспекты. Он также представляет собой простую в использовании платформу скрининга, где могут быть реализованы фармакологические вмешательства, нацеленные на конкретные клеточные пути, и могут быть протестированы потенциальные терапевтические мишени. Несомненно, представленная здесь система может помочь в дальнейшем просветить механизмы эпилептогенеза.

Эпилепсия, одно из самых распространенных неврологических расстройств во всем мире, характеризуется периодическим и непредсказуемым возникновением синхронизированной и чрезмерной нейронной активности в головном мозге. Несмотря на различные доступные противоэпилептические препараты (ПЭП), одна треть пациентов с эпилепсией рефрактерны к терапии1 и продолжают испытывать судороги и снижение когнитивных функций. Кроме того, имеющиеся ТПЗ препятствуют познанию из-за их относительно обобщенного действия на активность нейронов. Эпилептогенез трудно изучать на людях из-за множественных и гетерогенных эпилептогенных повреждений, длительных латентных периодов, длящихся от месяцев до десятилетий, и вводящих в заблуждение эффектов противосудорожного лечения после первого спонтанного припадка.
Выявление потенциальных терапевтических агентов для лечения эпилепсии стало возможным благодаря животным моделям эпилепсии: 1) генетическим моделям, в которых используются генетически предрасположенные животные, у которых судороги возникают спонтанно или в ответ на сенсорный раздражитель; 2) модели судорог, вызванных электростимуляцией; и 3) фармакологические модели индукции судорог, в которые используются пилокарпин (агонист мускариновых рецепторов), каинат (агонист рецептора каината) или 4-аминопиридин (блокатор калиевых каналов), среди прочих. Эти модели имели решающее значение для понимания поведенческих изменений, а также молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, и они привели к открытию многих AED2.
Препараты ex vivo также являются мощным инструментом для изучения механизмов, лежащих в основе эпилептогенеза и иктогенеза. Острые срезы гиппокампа, которые позволяют проводить электрофизиологические исследования живых клеток в течение 6-12 ч периода, и органотипические срезы гиппокампа, которые могут сохраняться в инкубаторе в течение нескольких дней или недель, широко использовались в исследованиях эпилептиформной активности3.
Органотипические срезы мозга получают из эксплантированной ткани и представляют собой физиологическую трехмерную модель мозга. Эти срезы сохраняют цитоархитектуру интересуемой области и включают все клетки мозга и их межклеточную связь4.  Наиболее используемой областью для долгосрочных органотипических культур является гиппокамп, так как эта область подвержена потере нейронов в нескольких нейродегенеративных состояниях. Они широко используются для моделирования расстройств головного мозга и считаются отличными инструментами для оценки нейропротекторного и терапевтического потенциала препарата5,6. Модели эпилептогенеза, инсульта и Aβ-индуцированной токсичности были описаны в органотипических срезах гиппокампа7,8,9,10. Болезнь Паркинсона исследовали в вентральном мезенцефалоне и полосатом теле, а также коре-телец, мозолистом теле- полосатом теле, субстанции нигры, органотипических срезах11. Органотипические культуры срезов мозжечка имитируют многие аспекты миелинизации аксонов и мозжечковых функций и являются широко распространенной моделью для исследования новых терапевтических стратегий при рассеянном склерозе12.
Тем не менее, клинические исследования и животные модели эпилепсии показали, что риновая кора, состоящая из периринальной и энторинальной коры, играет роль в припадкахпоколения 13. Таким образом, модель эпилептогенеза в эринных корно-гиппокампомповых органотипических срезах была установлена14. При постепенном и контролируемом лишении сыворотки органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают развивающиеся эпилептические события, в отличие от аналогичных срезов, всегда хранящихся в сывороточной среде.
При эпилепсии, как и при многих острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы, нейроцентрическое зрение не в состоянии прояснить механизмы, лежащие в основе начала и прогрессирования заболевания. Клинические и экспериментальные данные указывают на воспаление мозга, в котором микроглия и астроциты играют соответствующую роль, как один из ключевых игроков, способствующих эпилептическому процессу. Фармакологические эксперименты на животных моделях эпилепсии показывают, что антиэпилептогенные эффекты могут быть достигнуты путем нацеливания на провоспалительные пути, и в настоящее время нейровоспаление рассматривается как новый вариант для разработки терапевтических подходов к эпилепсии15.
Здесь мы подробно опишем подготовку ринных корно-гиппокампообразных олово-срезовых культур, а также детали для регистрации спонтанной эпилептиформной активности у них. Мы подчеркиваем, что эта система имитирует несколько нейровоспалительных аспектов эпилепсии, таким образом, подходя для изучения роли глиальных клеток и нейровоспаления в этой патологии. Кроме того, он представляет собой простую в использовании платформу для скрининга потенциальных терапевтических подходов к эпилепсии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Manuel Vieira, Lda</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-C3d (goat)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2655</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68 (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31630-125ug</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (mouse)</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108539</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN (rabbit)</td>
			<td>Werfen</td>
			<td>16712943S</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#8482; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB04602</td>
			<td>5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain/Tissue Slice Chamber System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE</td>
			<td>Millipore SAS</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>SCHOTT</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>BB15, Function Line</td>
			<td>Set to 37 &#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08342.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution, 45% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.06580.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope/magnifier</td>
			<td>MEIJI TECHNO CO. LTD</td>
			<td>122285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilute at a ratio 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps Standard Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin stock solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution (GBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-919-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Electrodes</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-10</td>
			<td>Round tips homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stock solution at 2 mg/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, Heat Inactivated (HS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>1.09057.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>BSC-HT Haas Top</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatula Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10092-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>HERASafe</td>
			<td>HS 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaning Paper</td>
			<td>TIFFEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM (Q)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 0.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72,699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 2.0 mL, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Clich&#233;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (NBA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#174; I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, powder</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,87,94,295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate saline buffer (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate standard solutions, PO&#8324;3- in water</td>
			<td>BDH ARISTAR</td>
			<td>452232C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P10, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum 5 blades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td>Stock solution at 1 mg/mL in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Medium retention 11&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL</td>
			<td>SOL-M</td>
			<td>161000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27800.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#8206;</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>535C549998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Astro Med Inc GRASS Product Group</td>
			<td>S48 Stimulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Scissors Straight SharpSharp 12cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus&#8482; Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Treated Sterile 6-Wells Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CORN3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatue controller</td>
			<td>MEDICAL SYSTEMS CORP.</td>
			<td>TC-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td>
			<td>MTC/2</td>
			<td>Set to 350 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>14630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of epileptogenesis in rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures

Олово-оловородные культуры срезов широко используются для моделирования расстройств головного мозга и считаются отличными платформами для оценки нейропротекторного и терапевтического потенциала препарата. Оловоорганические срезы получают из эксплантированной ткани и представляют собой сложную многоклеточную среду ex vivo. Они сохраняют трехмерную цитоархитектуру и локальную среду клеток мозга, поддерживают нейронную связь и взаимное взаимодействие нейрон-глия. Органотипические срезы гиппокампа считаются подходящими для изучения основных механизмов эпилептогенеза, но клинические исследования и животные модели эпилепсии показали, что риновая кора, состоящая из периринальной и энторинальной коры, играет соответствующую роль в генерации судорог.
Здесь мы опишем приготовление ринных корно-гиппокампомповых органотипических срезов. Записи спонтанной активности из области CA3 при перфузии с полной средой роста, при физиологической температуре и при отсутствии фармакологических манипуляций показали, что эти срезы изображают развивающиеся эпилептические события на протяжении всего времени в культуре. Также наблюдалось увеличение гибели клеток через анализ поглощения йодида пропидия и глиоз, оцененный с помощью иммуногистохимии, связанной с флуоресценцией. Представленный экспериментальный подход подчеркивает ценность органотипических культур срезов ринальной коры-гиппокампа как платформы для изучения динамики и прогрессирования эпилептогенеза и скрининга потенциальных терапевтических мишеней для этой патологии головного мозга.

Основываясь на предыдущих описаниях анализа эпилептических сигналов в органотипических срезах гиппокампа, междожественные эпилептиформные разряды здесь определяются как пароксизмальные разряды, которые четко отличаются от фоновой активности, с резким изменением полярности и происходящие на низкой частоте (<2 Гц). Пароксизмальные разряды, длящиеся более 10 с и происходящие на более высокой частоте (≥2 Гц), характеризуются как иктальная эпилептиформная активность. Если иктальное событие происходит в течение 10 с после предыдущего, эти два события рассматриваются только как одно иктальное событие.
Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа при 7 DIV(рисунок 3A)изображают смешанную межиктальную и иктал-подобную активность. При 14 DIV(рисунок 3B)спонтанная активность характеризуется иктальными разрядами, которые эволюционируют в подавляющую иктальную активность при 21 DIV, при этом иктальные события длятся >1 мин(рисунок 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig03.jpg"> Рисунок 3: Спонтанная эпилептиформная активность органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Репрезентативные электрографические судорожные события, регистрируемые из области CA3 в камере интерфейсного типа, после(A)7 DIV,(B)14 DIV и(C)21 DIV. Детали захвата показаны в более низких следах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Анализ поглощения PI с последующим иммуногистохимией против нейронального маркера NeuN, направленным на идентификацию гибели нейронов. Поглощение PI гранулярными и пирамидальными нейронами наблюдалось в 7 срезах DIV (стрелки на рисунке 4A),но количество PI+ нейронов увеличилось на 14 DIV (стрелки на рисунке 4B),что подтверждает повышенную гибель нейронов прогрессированием эпилептогенеза.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig04.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные изображения NeuN и PI окрашенных эринной коры-гиппокампа органотипическими срезами. Изображения окрашенных NeuN зрелых нейронов и PI-положительных клеток были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV, на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Стрелки указывают на гибель нейронов (оранжевый). Шкала-бар, 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Двойное окрашивание Iba1 вместе с CD68 использовалось для оценки фенотипа микроглии. Iba1 является маркером микроглии / макрофагов, в то время как CD68 представляет собой лизосомальный белок, экспрессируемый в высоких уровнях реактивной микроглией и в низких уровнях микроглией покоя. При 7 DIV срезах разветвленная микроглия с низкой экспрессией CD68 (стрелки на рисунке 5A)более распространены, чем Iba1+/CD68+ реактивная микроглия (наконечники стрел на рисунке 5A),тогда как при 14 DIV во всех областях гиппокампа микроглия Iba1+/CD68+ кустистая/амебоидная микроглия M1 (наконечники стрел на рисунке 5B)превосходят микроглию с низкой экспрессией CD68 (стрелки на рисунке 5B). При 14 DIV некоторые Iba1+/CD68+ клетки с гиперрементификацией могут быть точно определены (открытые наконечники стрел на рисунке 5B),что может свидетельствовать о возникновении противовоспалительного фенотипа микроглии M2. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Недавние исследования показали, что различные инициирующие повреждения ЦНС могут вызывать, по крайней мере, два типа реактивных астроцитов, A1 и A2, причем астроциты A1 являются нейротоксичными16. Подтип астроцитов А1 характеризуется повышенной экспрессией комплемента С316,17,18. Комплемент C3, который играет центральную роль в активации системы комплемента, генерирует C3b, который в дальнейшем деградирует до iC3b, C3dg и C3d19. Таким образом, для оценки астроглиоза было использовано двойное окрашивание GFAP и C3d. При 7 DIV экспрессия C3d едва обнаруживается(рисунок 6A),в то время как в 14 DIV-срезах можно наблюдать гипертрофические GFAP+/ C3d+ астроциты (наконечники стрел на рисунке 6B),предполагая прогрессирующую активацию астроцитов A1.
Результаты демонстрируют прогрессирующую активацию микроглии и астроцитов на протяжении всего хода эпилептогенеза, имитируя события, описанные у пациентов с эпилепсией и на животных моделях этой патологии.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные изображения Iba1 и CD68 окрашенных органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Изображения окрашенных микроглией Iba1 и CD68 и окрашенных ядрами Hoechst были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Стрелки указывают на Iba1+/CD68- покоящейся микроглии, наконечники стрел указывают на Iba1+/CD68+ кустистую/амебоидную микроглию, а открытые наконечники стрелок показывают Iba1+/CD68+ гипер-разветвленную микроглию. Шкала-бар, 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативные изображения GFAP и C3d окрашенных органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа. Изображения астроцитов, окрашенных GFAP и C3d, а также окрашенных ядрами Hoechst, были получены при(A)7 DIV и(B)14 DIV на конфокальном лазерном микроскопе с 20-кратным объективом. Показаны увеличенные изображения пунктирных областей. Наконечники стрел указывают на GFAP+/C3d+ реактивные А1 астроциты (желтого цвета). Шкала-бар, 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Здесь мы опишем приготовление ринных корно-гиппокампомповых органотипических срезов. При постепенном и контролируемом лишении сыворотки эти срезы изображают развивающиеся эпилептические события и могут считаться моделью эпилептогенеза ex vivo. Данная система представляет собой отличный инструмент для мониторинга динамики спонтанной активности, а также для оценки прогрессирования нейровоспалительных признаков на протяжении всего хода эпилептогенеза.

Модель эпилептогенеза в ринных корно-гиппокампомповых органотипических срезовых культурах

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Эпилепсия является распространенным неврологическим заболеванием. Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают развивающиеся эпилептические события, которые напоминают эпилепсию in vivo и поэтому могут быть использованы в качестве модели эпилептогенеза ex vivo. Эта система действительно является отличным инструментом для мониторинга динамики и прогрессирования эпилептогенеза, а также для скрининга потенциальных терапевтических мишеней для этой патологии головного мозга.Демонстрировать процедуры со мной будут мои ученики Франсиско Меда и Мафальда Карвальо. Чтобы собрать мозг с послеродового дня от шести до семи щенков Спрэга-Доули, сначала промыть голову три раза в пяти миллилитрах СГБ. Работая в шкафу биобезопасности, твердо вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удержать голову на месте, и используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать кожу головы вдоль средней линии от позвоночного цевья до лобных долей.Вырежьте череп таким же образом и вдоль поперечной трещины головного мозга и используйте изогнутые длинные щипцы, чтобы раздвинуть части черепа. Используйте шпатель, чтобы отбросить обонятельные луковицы и перенести дорсальную сторону мозга вверх в 60-миллиметровую пластину, содержащую пять миллилитров холодного GBSS. Вставьте тонкие щипцы в мозжечок и вставьте шпатель вдоль средней линии, чтобы осторожно открыть полушарие.Используйте короткие изогнутые щипцы, чтобы аккуратно удалить лишнюю ткань, которая покрывает гиппокамп, не касаясь структуры гиппокампа, затем разрезайте ниже каждого гиппокампа. Перенесите одно полушарие за раз гиппокампом стороной вверх и параллельно друг другу на лист фильтровальной бумаги. Поместите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей с полусферами, перпендикулярными лезвию, и разрежьте полусферы на 350 микронных ломтиков.Переложите нарезанную ткань в новую чашку Петри, содержащую пять миллилитров холодного GBSS, и используйте электроды с круглым наконечником, чтобы тщательно отделить ломтики, сохраняя только образцы со структурно неповрежденной ринальной корой и гиппокампом. Области DG и CA должны быть идеально определены, а также энторинальные и периринальные области коры. Используйте шпатель и электрод с круглым наконечником для размещения до четырех неповрежденных ломтиков на отдельные вставки в соответствующем количестве лунок шестияменной пластины, содержащей 1,1 миллилитра питательной среды на лунку.Используйте пипетку P20, чтобы удалить лишнюю среду для рассечения вокруг каждого среза. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры. Меняйте среду каждые два-три дня.Используйте щипцы, чтобы поднять вставку. Аспирировать среду из соответствующего колодца и поместить вставку обратно на место. Используйте пипетку P1000, чтобы добавить один миллилитр свежей среды 37 градусов Цельсия в каждую лунку.Подготовьте электрофизиологическую установку в замкнутом контуре. Убедитесь, что скорость потока камеры интерфейсного типа установлена на уровне двух миллилитров в минуту, и откройте карб-быковый клапан. Проверьте уровень воды в системе и поместите лист фильтровальной бумаги в интерфейсную камеру записи, чтобы слить любую лишнюю среду.Поместите лист бумаги для очистки линз под рамку, чтобы подать среду на срез, и включите регулятор температуры, усилители и микро манипуляторы. Используйте шприц для загрузки стеклянного электрода свежеприготовленной искусственной спинномозговой жидкостью. Поместите стеклянный электрод в принимающий электрод и дождитесь стабилизации температуры в интерфейсной камере при 37 градусах Цельсия.Работая в шкафу биобезопасности, поместите вставку в 60-миллиметровую пластину с каплей среды. Используйте острое лезвие, чтобы вырезать срез из вставки и поместить срез в интерфейсную камеру с гиппокампом в правом нижнем углу, затем поместите принимающий электрод в слой пирамидальной ячейки CA3, инициируйте протокол непрерывного сбора и записывайте срез в течение 30 минут. Чтобы выполнить анализ поглощения пропидия йодида, работайте в шкафу биобезопасности.Поднимите вставку из скважины и добавьте йодид пропидия в среде до конечной концентрации двух микромоляры на скважину. Медленно перемешиваем пластину, прежде чем поместить вставку обратно в колодец, заботясь о том, чтобы под ломтиками не было пузырьков. Когда все ломтики будут обработаны, верните пластину в инкубатор клеточной культуры.Для иммуноокрашивания срезов в конце инкубации йодида пропидиума аспирируют среду со дна каждой лунки и добавляют один миллилитр 4%-го параформальдегида в верхнюю и нижнюю части каждой вставки. Через час при комнатной температуре вымойте ломтики два раза в течение 10 минут и по одному миллилитру PBS за стирку и используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать два прямоугольника на слайдах микроскопа. Используйте острое лезвие, чтобы вырезать фрагменты из вкладыш и поместить по одному срезу в каждый прямоугольник.Добавьте раствор для блокировки пермеабилизации на каждый ломтик для трехчасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте первичные антитела, представляющие интерес, к каждому срезу для инкубации в четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующее утро промыть ломтики PBS-Tween три раза по 10 минут за одну стирку и инкубировать ломтики с соответствующими вторичными антителами в течение четырех часов при комнатной температуре.После этого промыть ломтики, как показано на демонстрации, и добавить 50 микролитров раствора Hoechst к каждому срезу для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. После инкубации Hoechst снова вымойте ломтики и добавьте к каждому из них 50 микролитров монтажной среды, затем поместите на ломтики и запечатайте лаком для ногтей. После того, как слайды высохнут в течение 24 часов при комнатной температуре, визуализируйте иммуноокрашивание и поглощение йодида пропидиума с помощью конфокальной микроскопии.Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают смешанную межиктальную и иктал-подобную активность на семь дней in vitro. На 14 днях in vitro спонтанная активность характеризуется иктальными разрядами, которые развиваются до подавляющей иктальной активности через 21 день in vitro с иктальными событиями, длящимся более одной минуты. Поглощение йодида пропидия и иммуногистохимия против нейронального маркера NeuN выявили некоторую гибель нейронов за семь дней срезов in vitro, которая значительно увеличивается через 14 дней in vitro во всех областях гиппокампа.Через семь дней in vitro разветвленные микроглии с низкой экспрессией CD68 более распространены, чем Iba1-положительная CD68-положительная реактивная микроглия. В то время как через 14 дней in vitro, во всех областях гиппокампа Iba1 положительная CD68 положительная микроглия амебоида M1 превосходит микроглию с низкой экспрессией CD68. Через 14 дней in vitro некоторые Iba1-положительные CD68-положительные клетки с гиперрементификацией могут быть точно определены, что предполагает возможность фенотипа противовоспалительной микроглии M2.Через семь дней in vitro экспрессия CD3 едва обнаруживается, в то время как через 14 дней срезов in vitro может наблюдаться гипертрофические глиальные фибриллярные кислые белки-положительные CD3-положительные астроциты, что предполагает прогрессирующую активацию астроцитов A1. Готовьте ломтики ринальной коры-гиппокампа с особой осторожностью. Обязательно удалите лишнюю ткань над гиппокампом, так как это может нарушить целостность среза во время нарезки.Структурный дефицит негативно скажется на жизнеспособности среза. В дополнение к продемонстрированным подходам, множество анализов, таких как анализ вестерн-блот, ПЦР в реальном времени и ИФА, могут быть применены к этой системе для решения конкретных вопросов, касающихся эпилептогенеза.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Подготовка фрагментов, органотипической культивирования тканей и люциферазы Запись часы активность генов в супрахиазматическое ядро

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

Подготовка Подрезанный Модель Посттравматическое Epileptogenesis в Грызунов

Partially isolated cortex ("undercut") is an animal model of posttraumatic epileptogenesis. The surgical procedure involves cutting through the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...