Name: a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft at JoVE.com

这项工作得到了L'Armement，国防创新和理工学院的支持。我们感谢来自理工学院的同事Yann Plantier先生，他提供了深入的见解和专业知识，极大地帮助了视频文件的制作。作者感谢贝诺伊特·皮特曼先生和夏洛特·奥里奥女士，他们来自因瑟姆·拉沃西耶（SEIVIL）美国33号医院，保罗·布卢斯医院，维尔朱伊夫，感谢他们在该项目过程中提供的动物福利和护理专业知识。

所有实验都得到法国高等教育和研究部的批准（研究编号：12216201711616517670v2 和DAP180012）。所有小鼠在抵达时都存放在塑料笼子里，在研究前可以进行7天的适应期。动物室保持12/12小时光/暗循环（07：00灯亮）。食物和自来水被提供。BALB/c和SKH1-Hrr小鼠被喂养传统的小麦/大豆为基础的饮食。提供锯末床上用品和筑巢材料。
1. 设备准备
<ol><li>为该过程准备一个燃烧装置，并使用温度控制器将燃烧装置设置为 80°C（图 1A）。使用红外热像仪验证黄铜模板的温度 （图 1B，C）。</li>
	<li>确保数字气压计工作正常。</li>
	<li>用手术窗帘盖住舞台并调整桌子的高度（图1A）。</li>
</ol>2. 术前和术内动物护理
<ol><li>获得BALB/c和SKH1-Hrr小鼠，6-8周大。</li>
	<li>将扑热息痛悬浮液以3毫克/mL添加到饮用水中，并在手术前12小时和手术后72小时内供应。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器和 26 G 针头，在手术前 30 分钟以 0.05 μg/g 的皮下施用丁丙诺啡，在手术后前 72 小时每 6 小时施用一次。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器和 26 G 针头，将利多卡因注射到小鼠的剂量和烧伤伤口区域的 2-3 mm在烧伤伤口感应前 15 分钟，在 0.05 μg/g 下皮注射利多卡因。</li>
	<li>麻醉小鼠使用内丙酮注射的木胺在10毫克/千克和氯胺酮100毫克/公斤。使用 1 mL 注射器和 26 G 针头进行注射。</li>
	<li>关键步骤：将麻醉小鼠放在加热垫上，使鼠标保持温暖，以防止麻醉诱导后前30分钟和麻醉恢复后至少15分钟体温过低。除加热垫外，其他方式，包括热灯、循环热液或空气，以及预热热储层，都可用于调节体温。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹润滑凝胶，以防止角膜脱水。</li>
	<li>使用手趾捏戒反射评估麻醉深度。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器和 26 G 针头管理 200 μL 的乳环环溶液，并辅以 5% 的葡萄糖。麻醉诱导后立即进行液体置换，并在手术后6小时立即更换液体，以防止脱水。</li>
</ol>3. 全厚度烧伤伤口感应
<ol><li>用剪发器剃麻醉鼠标。</li>
	<li>在鼠标的多苏姆表面涂抹脱毛霜1分钟。用无菌纱布擦去奶油，然后用一块湿纱布清洁区域。用纱布擦去皮肤，直到干燥。</li>
	<li>将鼠标放在覆盖着手术窗帘的舞台上，将舞台向上移动，靠近预热的黄铜模板。</li>
	<li>使用 0.15 N 的恒定压力在鼠标背面应用圆形黄铜模板（80 °C，20s）。</li>
	<li>
关键步骤：烧伤诱导后，立即将麻醉动物放在加热垫上，以防止体温过低，并在手术期间和之后保持小鼠温暖。麻醉后，将鼠标放回笼子。</li>
	<li>
关键步骤：在手术后的72小时内在笼子地板上提供捣碎的饮食。在烧伤受伤后，老鼠有时不愿意伸手到吸管前喝水。</li>
</ol>4. 收获捐赠嫁接
<ol><li>在捐赠小鼠尾部的上部用手术刀进行纵向切口，并使用手术钳轻轻切除皮肤。</li>
	<li>将尾皮放入无菌培养皿中，里面装满了 10 mL 的无菌 0.9% 盐水溶液。使用尺子测量出单个移植物，并使用手术刀将尾皮切成碎片，每个碎片尺寸为 15 mm。</li>
	<li>一旦准备好，保持皮肤移植在0.9%盐水溶液在4°C长达2小时。</li>
</ol>5. 手术切除和皮肤移植
<ol><li>烧伤诱导后24小时，通过吸入异氟兰为麻醉准备小鼠。将鼠标放入感应室，在 100% 氧气中使用 5% 异氟兰诱导麻醉，流速为 4 L/min。为了在手术期间保持麻醉，在2升/分钟时使用2%异氟。</li>
	<li>在鼠标上放置手术窗帘，切开窗户露出手术场。使用无菌技术，先用波维酮碘拭拭伤口，然后用70%的酒精拭拭伤口。</li>
	<li>用一对手术钳轻轻拾取烧伤的组织，用无菌手术剪刀和钳子切除所有坏死和不可行的组织。取出皮下层的潘尼库鲁斯肉管层，创建一个稳定的接受者床。</li>
	<li>将皮肤移植物放在新准备的伤口床上。使用手术钳子轻轻地将周围皮肤拉向皮肤移植。涂抹一些手术粘合剂，将移植物连接到伤口床上，轻轻按压以对齐皮肤边缘。关键步骤：伤口床的大小必须略大于皮肤移植的大小，以确保成功移植。</li>
	<li>让鼠标从麻醉中恢复过来。关键步骤：将鼠标放在加热垫上。在手术期间和之后保持鼠标温暖，以防止体温过低。</li>
	<li>在移植的伤口上涂抹惰性石蜡纱布敷料和粘合剂二次敷料。</li>
	<li>将鼠标放入单个保持架中。关键步骤：在手术后的72小时内在笼子地板上提供一些捣碎的饮食，并每天进行监测。</li>
	<li>提供玩具，丰富环境。</li>
</ol>6. 数字成像和验尸伤口收集
<ol><li>在伤口旁边放置一把尺子，用数码相机拍摄伤口（图3）。</li>
	<li>在实验的终点，通过接触二氧化碳和宫颈脱位来安乐死动物。关键步骤：在宫颈脱位期间皮肤的过度拉扯作用可能会损坏移植物。</li>
	<li>在验尸时，用剪刀手术将后伤切除到筋膜上。二分伤口。修复一半在10%缓冲的甲醛和过程组织学和免疫组织化学。快速冻结液氮中的另一半，用于RNA提取和蛋白质定量，并保持在-80°C。</li>
</ol>7. 皮肤组织学、免疫组织化学和胶原蛋白可视化
<ol><li>将皮肤样本嵌入石蜡中，切成4μm部分，并放入带正电的幻灯片上。</li>
	<li>使用沾有赤氧素和 eosin 的幻灯片来评估重新上皮率（原伤口的百分比）。用新表皮覆盖的伤口区域可以表示为整个伤口的百分比（图4）。使用数字显微镜应用和 ImageJ 软件对各部分进行微观分析。</li>
	<li>使用从形式固定和石蜡嵌入组织制备的组织学部分（4 μm 厚度），并受免疫组织化学治疗。</li>
	<li>要评估伤口中的胶原蛋白 I 和纤维素表达，应用初级抗体并孵育 1 小时。</li>
	<li>反应部分：（i） HRP，3，3'-二甲苯胺 （DAB） 或 （ii） AP，粘结聚合物精炼红色（材料表），产生明亮的红色（图5）。使用仪器扫描各部分，并使用数字显微镜应用和 ImageJ 进行分析。</li>
	<li>为了对胶原蛋白沉积进行组织学评估，使用商业试剂盒在组织学部分进行三色染色。</li>
	<li>对于胶原纤维可视化，请使用多光子显微镜和第二次谐波生成技术（图5）。使用多光子显微镜进行组织成像，如前面所述的20。使用中心波长为 810 nm 的 Ti：Sapphire 激光器作为产生二次谐波和双光子激动荧光信号 （TPEF） 的激光源。</li>
	<li>使用配备 25x/0.95 W 目标的激光束收集和激发二次谐波生成 （SHG） 和 TPEF。检测信号，如前21 所述，由 NDD PMT 探测器。使用软件进行激光扫描控制和图像采集。</li>
</ol>

<ol>
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提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。

根据烧伤23的厚度分类，全厚度烧伤的特点是皮肤整体厚度和皮下组织某些部分明显介入。这种类型的伤口只能通过收缩或皮肤移植2愈合。本文中描述的方法的固有限制是，只有全厚度嫁接，而不是分裂厚度嫁接，这是常在临床环境中使用，收获从小鼠的尾巴。这是由于技术难度，因为鼠标皮肤太薄，获得分裂厚度嫁接。必须指出，全厚度移植需要一个良好的血管化伤口床，而分裂厚度的皮肤移植能够生存在捐赠点与较少的血管24。先前的研究表明，在小鼠背部诱发的烧伤伤口与新血管5的强健形成有关。这表明，一个良好的血管化区域，如小鼠的伤口，可以被认为是诱导烧伤伤口的解剖里程碑。
烧伤伤口深度是需要考虑的重要因素。烧伤伤口的深度必须在单个小鼠之间保持一致。烧伤伤口深度的可重复性取决于黄铜模板的温度、压力和热暴露持续时间。必须组织验证烧伤伤口深度。重要的是要记住，过度的压力或皮肤长时间暴露在预热的黄铜模板可能会伤害底层组织。椎柱周围的组织，包括中枢和周围神经系统的成分，对热敏感，如果损坏可能导致后腿瘫痪。
虽然没有术后死亡率与外科手术直接相关，但少数无毛SKH1-Hrhr小鼠对感冒特别敏感，出现体温过低，全身麻醉后无法恢复。因此，在所有美容活动中必须提供补充热量，在麻醉小鼠时需要持续监控。
本研究中描述的方法与手术场感染不相关。然而，无菌技术必须用于防止微生物在手术周期内转移到手术伤口。用生物发光或荧光微生物接种伤口可以纳入手术程序。这项技术可能有助于研究传染性生物及其发病机制25。例如，外源性添加或注射生物发光细菌，可以允许监测微生物负担使用体内整个动物成像25。鉴于已知小鼠毛发会干扰体内整个动物荧光和生物发光成像，无毛SKH1-Hrhr小鼠是有关荧光或生物发光记者研究的理想宿主。
伤口组织样本可在不同的时间点采集，并处理进行组织学和免疫组织化学分析。蛋白质和RNA可能从皮肤活检中分离，分子生物学技术可用于评估参与伤口愈合的关键分子的表达。
本研究，我们描述了烧伤伤口愈合和异体皮肤的实验性模型。此过程可以修改，并用作临床前研究的模型。

手术脱毛和皮肤移植是用于管理慢性伤口1，烧伤伤口2，和急性伤口，如创伤伤口3的常见临床做法。皮肤移植是指外科手术，它涉及从身体的一个部位去除健康的皮肤，并转移到另一部分。捐赠者移植物取代了丢失的组织，为细胞迁移和生长提供了一个结构脚手架。在整合到接收方现场后，皮肤移植物通过提供微生物入侵、外部环境有害影响和水分过度流失等防护，取代了失去的皮肤屏障。成功的皮肤移植整合取决于几个因素。其中包括在微生物感染和及时解决炎症时作出充分的免疫反应，在伤口场建立健壮的血管生成，以及在接受者床和供体移植物之间建立血管性血管性血管。当移植物开始降解时，居民皮肤细胞必须被能够产生新的细胞外基质的细胞所取代。同时，表皮角蛋白细胞必须爬过新产生的基质，形成新表皮，重新上皮化伤口。因此，很明显，细胞从接受者床有效迁移到供体移植物是影响成功移植物结合的另一个决定性因素。鉴于伤口愈合涉及的大量因素，由于伦理限制，在人体试验中可能无法控制，因此有必要进行临床前实验皮肤移植模型。开发烧伤伤口愈合和相关皮肤移植的临床前模型对于了解皮肤组织修复所涉及的复杂机制非常重要，并且对于测试新的治疗剂至关重要。伤口愈合的体外模型无法准确模拟皮肤组织的复杂性。体内动物模型是了解组织修复机制不可或缺的调查工具。
在啮齿动物身上开发了几种皮肤移植技术，以模拟手术切除和烧伤伤口重建7，8，9。,8,9然而，大多数前面描述的程序未能在皮肤移植之前诱发热烧伤。而不是烧伤伤口，诱导一个完整的厚度切除伤口，然后重建与全厚度的皮肤同体7。各种解剖地标，如耳朵，尾巴和背部已被用来收获啮齿动物7，8的捐赠皮肤。报告了不同的移植固定和稳定技术，包括"无缝合技术"9，缝合7和手术胶10，11，12。10,11,12
本研究的目的是开发一个全厚度烧伤伤口的穆林模型，将回顾目前烧伤治疗的黄金标准方法，其中包括不活的组织切除和皮肤移植。使用预热的黄铜模板在鼠标的多苏姆表面引起热灼伤。烧伤埃沙尔被切除，并替换为从捐赠小鼠尾部收获的全厚移植物。这种实验模型有三个主要优点。首先，在受助小鼠的背上可能诱发多个烧伤伤口，从受助小鼠的单尾中可收获四个供体皮肤移植物。这意味着，可能使用相同的接受者和捐赠动物来比较几种实验和控制疗法。根据所需的给药途径，控制治疗可能包括对车辆或安慰剂控制的局部或全身给药（例如，软膏的局部应用、皮下、内皮或静脉注射溶液）。其次，可以控制治疗的时间和实验的终点。第三，这个模型取决于伤口的重建使用从尾巴收获的全厚度移植，这是已知的有更高的概率，成功地纳入捐赠地点相比，从背部13收获的皮肤。这可能是由于表皮兰格汉斯细胞的数量减少，在皮肤免疫生物学中起着关键作用，并且与皮肤移植排斥14有关。
建议的伤口愈合和移植整合模型很可能应用于转基因和敲除小鼠。使用转基因小鼠将有助于阐明某些基因在伤口修复过程中可能扮演的角色。也可以考虑在损伤现场进行局部伤口制剂或治疗抗体的皮下注射。
由于技术困难，由表皮和部分真皮组成的分厚皮肤移植在小鼠中很难获得。众所周知，由表皮和全厚真皮组成的全厚度皮肤移植物需要一个血管良好的伤口床才能成功整合。无法在小鼠身上收获分裂厚度皮肤移植物可能被视为此模型的一个限制。皮肤移植到接受者伤口床的固定是通过应用手术胶粘胶实现的，与其他组织固定方法相比，这种粘胶与更少的创伤和快速降解有关。先前的研究表明，在手术后15小时，与手术胶相比，粘附与更强的组织固定有关，这可能被认为是手术的缺点。然而，在后来的点，用手术胶粘剂治疗的伤口的生物力学强度变得可与缝合15和优于主食固定16。使用手术胶水固定组织后，伤口必须用伤口敷料覆盖。虽然小鼠的后面伤口很难被动物接触，但另一方面，伤口敷料很容易被动物操纵和切除。可能需要频繁更换伤口敷料。
麻醉引起的小啮齿动物体温过低是一个有据可查的现象17。体温过低是此过程的副作用，它会导致并发症，并可能损害动物健康和数据质量。因此，此方法保证实施温度管理策略，尤其是在使用无毛 SKH1-Hrhr 时。
使用小鼠模仿人体伤口闭合的最显著限制是皮肤解剖学和生理学的区别。老鼠的伤口主要通过收缩愈合，而人类伤口通过造粒组织形成和再上皮18愈合。为了解释这种差异，目前的模型可以修改，并结合夹板环紧紧粘在伤口周围，以防止皮肤收缩19。鉴于这种体内协议的一些优点和缺点，这个模型可以作为一个工具来研究伤口愈合中的某些过程，这些过程不可能在体外研究。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringue</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS + 01T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>NN-2613R</td>
			<td>1/2&#39;&#39; - 0,45 X 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96X21 mm Petri Dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing scale</td>
			<td>Kern</td>
			<td>EMB 5.2K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mouse</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td>BALB/cAnNRj</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M476-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond polymer Refine Red</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass block</td>
			<td>BVG</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Circular 10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPRECARE)</td>
			<td>Axience</td>
			<td>FR/V/6328396 3/2011</td>
			<td>administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burning apparatus Kausistar 400</td>
			<td>Tra&#231;aMatrix</td>
			<td>34010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaseViewer</td>
			<td>3DHISTECH Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>3Dhistech, Budapest, Hungary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Recommanded concentration 1:50; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)- glucose (Dextrose)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8769-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>D3400</td>
			<td>objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpels</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P04-36300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23750</td>
			<td>Recommanded dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22um</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Petelevage</td>
			<td>120070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Piramal healthcare</td>
			<td>FR/V/03248850/2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Imalgene</td>
			<td>FR/V/0167433 4/1992</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringers solution</td>
			<td>Flee-Flex</td>
			<td>1506443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamina multilabel slide scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>version 2.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Bond III</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>1757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukosilk dressing</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>72669-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>N01BB02</td>
			<td>local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Kern</td>
			<td>HDB-5K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson Trichrome Staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromesh Biopsy cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DM500</td>
			<td>Scanner 8000Hz NDD PMT detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non adhering dressing Adaptic</td>
			<td>Systagenix</td>
			<td>A6222</td>
			<td>12.7cm X 22.9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocrygel</td>
			<td>Tvm France</td>
			<td>###</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paracetamol 300mg</td>
			<td>Dolliprane</td>
			<td>Liquiz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde 4%</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>1169945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>MEDA pharma</td>
			<td>D08AG02</td>
			<td>diluted to 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKH1-Hrhr mouse</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>686SKH1-HR</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>AGAA000080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical adhesive</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>9927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>418545/9</td>
			<td>10 X 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Versylene Fresenius</td>
			<td>B230521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>2775161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ChameleonUltra</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>DS 16-02-16 F</td>
			<td>690-1040 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal imaging Camera</td>
			<td>Testo</td>
			<td>Testo 868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompum 2%)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>FR/V/ 8146715 2/1980</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft

琐碎的肤浅伤口愈合没有并发症的主要意图。深层伤口，如全厚烧伤，通过二次意图愈合，需要手术脱毛和皮肤移植。将供体移植物成功整合到受助人伤口床取决于及时招募免疫细胞、强健的血管反应和新的细胞外基质形成。新型治疗剂的发展，针对伤口愈合的一些关键过程，由于缺乏可靠的临床前模型和伤口闭合的优化客观评估而受阻。在这里，我们描述了一个廉价和可重复的模型，实验全厚度烧伤伤口重建与异体皮肤移植。伤口在BALB/C和SKH1-Hrhr背景麻醉的近亲繁殖野生型小鼠的多苏姆表面诱发。烧伤使用直径为10毫米的黄铜模板生产，该模板预热至80°C，以恒定压力提供20 s。 烧伤埃沙尔在受伤后24小时被切除，并更换为从基因相似的供体小鼠尾部收获的全厚度移植物。手术不需要专门的设备，手术技术也很容易遵循。在大多数研究环境中，该方法可以毫不费力地实现和复制。某些限制与模型相关。由于技术困难，无法收获较薄的分裂厚度皮肤移植。我们在这里描述的手术方法允许使用全厚度的皮肤移植重建烧伤伤口。它可用于进行临床前治疗测试。

结果表明，该协议开发是一种简单明了的方法，允许在小鼠中诱导全厚度烧伤伤口。烧伤是使用预热黄铜模板诱导的（图1A-C）。烧伤区域显示为圆形伤口，带白色 eschar 和高血区。烧伤伤口的大小在烧伤后24小时内稍大一些，因为众所周知的现象被称为烧伤进展，这可能是由于急性炎症22。切除后，烧伤伤口使用异体皮肤移植重建（图3）。烧伤后的第7天，伤口变得血管化5，这是成功移植的迹象。表皮角膜细胞从相邻的接受者皮肤迁移，以努力关闭伤口并弥合伤口两边缘之间的间隙。对伤口H和E染色部分的微观分析表明，与烧伤后第3天相比，烧伤后第7天新皮皮的长度明显延长（图4B）。在进行大型研究之前，强烈建议研究人员完成一项试验性研究，从而能够探索一种新的干预、评估可行性、确定修改方法以确保可重复性。在较小的样本中很难检测到具有统计显著性的影响，而增加样本大小是提高测试的统计能力的方法之一。例如，要检测组间伤口再上皮化率（p < 0.05）的统计显著差异（图4），样本大小应介于每组6至8只小鼠之间。所有实验至少应重复两次。当产生细胞的基质（如成纤维细胞）从接受组织迁移到移植体时，细胞外基质的关键成分，包括胶原蛋白 I 和纤维素在新形成的基质中变得高度表达（图 5）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg"> 图 1：刻录设备设置。（A） 刻录装置的放置和设置。燃烧装置连接到温度控制器，并连接到数字单度计，以便监控压力。燃烧装置悬浮在可调级以上 – 平坦的表面，将鼠标放置在其上以感应燃烧。（B-C）用于诱发伤口烧伤的黄铜模板的特写图像。（C） 黄铜模板的直径为1厘米<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">。请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg"> 图 2：本文中描述的复制实验模型所需的不同步骤的示意图。手术有三个主要步骤：（一） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（二） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（六） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（六） 使用预热（二） 烧伤后24小时对不可行的坏死组织进行手术切除;（三） 手术伤口重建使用从捐赠小鼠收获的全厚异体皮肤移植物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg"> 图3：重建小鼠烧伤伤口的宏观视角。烧伤伤口的代表性数字图像重建与异体皮肤移植在烧伤后的第0天，第1天，第3天和7天。图像上的标尺以毫米为单位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg"> 图4：烧伤后3天和7天伤口的微观外观。烧伤后 3 天和 7 天伤口的 H&E 染色部分。与（B）第7天伤口相比，第3天伤口的新表皮（虚线）长度显著增加。在 （A） 和 （B） 中，刻度杆为 100 μm. （C） 伤口再上皮化百分比的图形表示。通过测量第3天和7天烧伤后新皮毛的长度进行评估，并以整个伤口长度的百分比表示。结果表示均值 = S.E.M.（n = 第 3 组中的 6 只小鼠;第 7 组为 6 只小鼠，*p < 0.05;学生 t - 测试）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg"> 图5：细胞外基质和胶原蛋白 I 可视化的评估。免疫组织化学分析的代表图像，第7天老鼠伤口染色为（A） 胶原蛋白和（B） 纤维素.注意在拉长主轴形胶原蛋白 I 阳性细胞中强烈的红色染色。注意第7天伤口真皮中纤维素阳性细胞的棕色染色。在所有图像中缩放栏 = 50 μm。在 （A） 和 （B） 中 ， e 表示表皮， d 表示真皮.（C） 胶原纤维的可视化和胶原蛋白沉积的组织学评估。（D） 代表TPEF/SHG胶原蛋白图像第7天老鼠伤口。使用圆极化和SHG信号同时采集TPEF/SHG，在应用阈值后，选择性地处理，以获得SHG的二进制分布。TPEF 图像（绿色）和 SHG 图像（白色）为伪彩色并叠加。比例线 = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">μm. 请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

本研究的目的是开发烧伤伤口愈合的穆林模型。使用预热的黄铜模板在小鼠的后皮上引起热灼伤。燃烧的组织被除去，并覆盖与皮肤移植从基因相似的捐赠小鼠的尾巴收获。

用异体皮肤移植重建的烧伤伤口的穆林模型

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

该程序的总体目标是创建一个可重复的乳氨酸模型的全厚度烧伤伤口重建与过敏性皮肤移植。皮肤分为表皮和真皮两个组分。真皮下面是皮下脂肪，包括骨骼、肌腱或筋膜。烧伤的厚度分类通常用于定义烧伤深度的程度。表面烧伤只涉及表皮，表面部分厚度烧伤涉及表皮，只涉及皮毛或上皮。深皮部分厚度烧伤涉及表皮和真皮，包括血管，毛囊，油和汗腺的后额真皮。全厚度烧伤的特点是明显参与皮肤的整个厚度，并可能皮下组织。这种类型的伤口只能通过收缩或皮肤移植愈合。该程序的总体目标是创建一个全厚度烧伤伤口，并重建与全厚度的皮肤移植。这是通过将圆形黄铜块预热至 80 摄氏度，并应用于口腔皮肤 20 秒， 实现的。坏死组织在烧伤24小时后被手术切除。从捐赠小鼠尾部收获的全厚皮肤移植物被放在切除的烧伤伤口上。然后，移植物将用手术粘合剂固定。供体和接受动物都来自同一种近亲繁殖的小鼠。在研究过程中使用活检小鼠。然而，也可以使用小鼠应变。这包括免疫能力无毛小鼠，这在伤口愈合研究中特别有用。由于脱毛和相关炎症，流浪汉做了和头发再生不干扰数字图像分析，当面积测量和其他类型的显微伤口评估。这在感染模型中尤其如此，在感染模型中，我们的生物有机体和细菌的悬浮液被应用到此，您的伤口和生物有机体信号被测量，以指示细菌的生长速度。热烧伤装置由一个定制的圆形黄铜块组成，直径为10毫米，预热至80摄氏度。使用红外热像仪验证黄铜块的温度。为了创建全厚度烧伤伤口，使用由数字气压计监控的恒定压力 0.15 牛顿，黄铜块应用 20 秒。多模位镇痛是侵入性动物研究过程中疼痛管理的最佳做法。镇痛的理想管理制度包括先发制人或程序前镇痛治疗。每餐三毫克的扑热息痛被添加到饮用水中，并在手术前12小时和手术后72小时内供应。在手术前30分钟和手术后前72小时每6小时施用一次，每克0.05微克的丁丙诺啡被施用。在手术前15分钟，在每只小鼠的剂量周围以每公斤5毫克的利多卡因施用，在手术前以5%的葡萄糖注射200微升的乳酸环环剂溶液，在手术后6小时注射，以防止脱水。小鼠是尼塞肽使用内丙酮注射的锡拉辛每公斤10毫克，氯胺酮为每公斤100毫克。麻醉深度可以通过捏到手趾。麻醉可消除眨眼反射，防止用于维持角膜水化所需的泪膜的茶点，眼睛连续暴露在空气中迅速脱水，在眼睛上涂抹润滑剂以保持角膜的水化。每只鼠标的长毛被夹住，并应用脱毛霜一分钟来去除头发。尼瑟蒂德动物容易放置在平桌上，通过应用一个圆形黄铜块预热到80摄氏度，持续20秒，可以产生热燃烧。鼠标，被放回加热垫上，以保持其温暖，并防止体温过低，麻醉剂的频繁副作用。一旦从麻醉中恢复过来，小鼠可以放入单独的笼子。烧伤感应后24小时。坏死组织是手术兴奋。四种疾病皮肤移植物从安乐死捐赠鼠尾中收获。虽然另一边所以有尾巴下也可能使用鼠标模型。因此，人类的反应程度可能因捐赠者皮肤移植的起源而异。例如，与尾皮相比，耳皮和背部皮肤已不再在销售中，并引发更健壮的人类反应，这可能导致移植物排斥。皮肤移植厚度也可以考虑，因为它可能发挥一个决定性因素，成功地移植皮肤移植采取。安全的皮肤，如从背部有更高的失败概率，由于较高的代谢要求的组织。因此，报告的过敏性皮肤移植移植背部皮肤的成功低于报告的尾皮移植的成功。麻醉是由吸入5%异氟兰在100%氧气以每分钟4升的流速，其次是维持麻醉使用2%异氟兰在每分钟2升，在手术期间维护。在手术开始时施用丁丙诺啡，以提供术后镇痛。烧伤的伤口用波维酮碘来准备，其次是70%的酒精。坏死烧伤用剪刀切除圆形全厚皮肤缺陷，皮下层的潘尼库鲁斯肌膜层被切除，以创造一个稳定的皮肤移植接受者床一些作者建议保留皮下层的潘尼库鲁斯肌膜层，因为它被认为是必要的再血管化移植。然而，在这种情况下，此层的流动性和由此产生的嫁接床和接受床之间的潜在剪切力可能会成为问题。去除潘尼库鲁斯肉食层不会对嫁接程序的成功产生不利影响。全厚嫁接，都是从安乐死捐赠鼠的尾巴上收获的。尾巴纵向倾斜，使皮肤与底层软组织分离。然后，尾皮被撒在充满无菌、正常盐水的培养皿上，然后用尺子切成圆形斑块。然后，移植物被转移到培养皿中，用无菌纱布浸泡在正常的盐水中，并保持四度，直到准备被移植。然后用手术胶将移植物固定在接受者床上。捐赠者皮肤移植物和受助人伤口床之间的间隙轻轻按压以对齐皮肤边缘。伤口穿在惰性石蜡纱布和胶粘剂二次敷料内。在烧伤后一天、三天和七天拍摄了被移植伤口的数字照片。在验尸时，后伤被手术切除到筋膜上，伤口被一半固定在10%缓冲的甲蛋白中，并处理成组织学和免疫组织化学。皮肤移植物为细胞迁移提供了一个支架系统。成功的移植整合取决于有效的成纤维细胞和角蛋白细胞从接受者投标迁移到供体移植物，这种移植物被缓慢降解，取而代之的是能够产生细胞外基质的细胞。大规模伤口的组织学部分受到赤氧素和 eosin 染色。具有代表性的色氧林和 eosin 染色部分伤口的图像显示，与第三天烧伤后相比，以黄色突出显示的近表皮长度显著增加。为了估计重新表皮化的速度，用近表皮覆盖的伤口区域以整个伤口的百分比表示。细胞外基质是皮肤的非细胞成分，为细胞组分提供支架。细胞外基质由纤维蛋白组成，如胶原蛋白和纤维素。这些分子可增强伤口的成熟度，保持皮肤半量免疫组织化学的结构完整性，用于胶原蛋白一型，而组织学染色，如梅森的三色，可用于协助从照片显微图获得细胞外基质完整性。更复杂的方法，如第二次谐波生成显微镜已成为胶原蛋白结构定量分析的有力工具。Murine 皮肤嫁接提供了一个极好的潜在临床前模型，用于研究图形与接收方的集成。这项研究演示了一种可靠的方法，成功地执行皮肤移植在小鼠模型以及愈合伤口的组织学评估。

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