Name: a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense og École Polytechnique. Vi takker vores kollega Yann Plantier fra École Polytechnique, som gav indsigt og ekspertise, som i høj grad hjalp produktionen af videofilen. Forfatterne takker Benoit Peuteman og Charlotte Auriau fra INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif for deres dyrevelfærd og plejeekspertise i løbet af dette projekt.

Alle forsøg blev godkendt af det franske institut for videregående uddannelse og forskning (studienummer: 1221620171116161767670v2 og DAP180012). Alle mus var enkelt-op-op-til-ankomsten i plast bure og fik lov en 7-dages akklimatisering periode forud for undersøgelsen. Dyrerummet blev vedligeholdt ved en lys/mørke cyklus døgnet rundt (lys tændt kl. 07.00). Mad og vand fra hanen blev leveret ad libitum. BALB/c og SKH1-Hrhr mus blev fodret med traditionel hvede/soy-baseret kost. Savsmuld strøelse blev leveret sammen med redemateriale.
1. Forberedelse af udstyr
<ol><li>Klargør en brændende anordning til proceduren og indstil den til 80 °C ved hjælp af temperaturregulatoren (Figur 1A). Kontroller temperaturen i messingskabelonen (Figur1B,C) vedhjælp af det infrarøde termiske billedkamera.</li>
	<li>Sørg for, at det digitale manometer fungerer korrekt.</li>
	<li>Dæk scenen med en kirurgisk drapere og justere højden af bordet (Figur 1A).</li>
</ol>2. Præoperativ og intraoperativ pasning af dyr
<ol><li>Erhverve BALB/c og SKH1-Hrhr mus, 6-8 uger.</li>
	<li>Der tilsættes paracetamol suspension ved 3 mg/ml til drikkevand og tilførsel 12 timer før og op til 72 timer efter indgrebet.</li>
	<li>Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål, administrere buprenorphin subkutane på 0,05 μg/g 30 min før proceduren og hver 6 timer i de første 72 timer efter indgrebet.</li>
	<li>Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål, administrere lidocain til dorsum af musen og 2-3 mm distalt til det område af brænde såret. Injicer lidocain ved 0,05 μg/g subkutanely 15 min før induktion af forbrændingssåret.</li>
	<li>Anesthetize mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion af xylazin på 10 mg/kg og ketamin 100 mg/kg. Brug en 1 ml sprøjte og en 26 G nål til at administrere injektionen.</li>
	<li>Kritisk trin: Placer den bedøvede mus på en opvarmet pude, og hold musen varm for at forhindre hypotermi i de første 30 minutter efter induktion af anæstesi og i mindst 15 minutter efter helbredelsen fra anæstesi. Ud over den opvarmede pad, heat lampsandre modaliteter, herunder varmelamper, cirkulerende varme væsker eller luft, og forvarmede varmereservoirer kan anvendes til at regulere kropstemperaturen. heat</li>
	<li>Påfør smøregel på øjnene af musen for at forhindre dehydrering af hornhinden.</li>
	<li>Brug tå knivspids tilbagetrækning refleks til at vurdere dybden af anæstesi.</li>
	<li>Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G nål administreres 200 μL lakteret ringeropløsning suppleret med 5% dextrose. Væskeudskiftning kutane umiddelbart efter induktion af anæstesi og 6 timer efter proceduren for at forhindre dehydrering.</li>
</ol>3. Fuld tykkelse brænde sår induktion
<ol><li>Barber den bedøvede mus med hårklipperen.</li>
	<li>Påfør depileringscreme på dorsumoverfladen på musen i 1 minut. Tør cremen af med noget steril gaze, og rengør området med et stykke fugtig gaze. Blot huden med nogle gaze indtil tør.</li>
	<li>Placer musen på scenen dækket med en kirurgisk drapere og flytte scenen opad tættere på forvarmet messing skabelon.</li>
	<li>Påfør den cirkulære messingskabelon på bagsiden af musen (80 °C i 20 s) ved konstant tryk på 0,15 N (Figur 2).</li>
	<li>
Kritisk trin: Umiddelbart efter forbrændingsinduktionen skal det bedøvede dyr placeres på den opvarmede pude for at forhindre hypotermi og holde musen varm under og efter proceduren. Når inddrives fra anæstesi, returnere musen tilbage til buret.</li>
	<li>
Kritisk trin: Giv en mosede kost på buret gulvet for de første 72 timer efter den kirurgiske procedure. Mus er undertiden tilbageholdende med at nå op til en sipper rør til at drikke vand efter en brænde sår skade.</li>
</ol>4. Høst af donortransplantaet
<ol><li>Lav et langsgående snit med en skalpel i den øverste del af donormusens hale og fjern forsigtigt huden ved hjælp af kirurgiske håndsving.</li>
	<li>Halehuden placeres i en steril petriskål fyldt med 10 ml steril 0,9% saltopløsning. Brug en lineal til at måle de enkelte grafts og skær hale huden i stykker, hver måler 15 mm, ved hjælp af en skalpel.</li>
	<li>Når hudtransplantationerne er klargjort, skal det opbevares i 0,9 % saltvand ved 4 °C i op til 2 timer.</li>
</ol>5. Kirurgisk excision og hudtransplantation
<ol><li>Fireogtyve timer efter forbrændinginduktionen forberedes musen til anæstesi ved indånding af isofluran. Anfør musen i induktionskammeret, og fremvirker anæstesi med 5 % isofluran i 100 % ilt med en strømningshastighed på 4 L/min. For at opretholde anæstesi under operationen, bruge 2% isofluran på 2 L/ min.</li>
	<li>Placer en kirurgisk drapere på musen og skåret ud af et vindue for at afsløre det kirurgiske felt. Ved hjælp af aseptisk teknik, podning såret først med povidone-jod og derefter med 70% alkohol.</li>
	<li>Forsigtigt afhente den brændte væv med et par kirurgiske pincet og punktafgifter alle nekrotiske og ikke-levedygtige væv med steril kirurgisk saks og pincet. Fjern panniculus carnosus lag af hypodermis at skabe en stabil modtager seng.</li>
	<li>Placer hudtransplantationen på den frisklavede sårseng. Træk forsigtigt den omgivende hud mod hudtransplantatet ved hjælp af kirurgiske pincet. Påfør nogle kirurgiske lim til at fastgøre transplantatet til sårsengen og tryk forsigtigt for at tilpasse hudkanterne. Kritisk trin: Størrelsen af sårsengen skal være mindre end størrelsen af hudtransplantation for at sikre en vellykket indpodning.</li>
	<li>Lad musen komme sig efter anæstesi. Kritisk trin:Placer musen på en opvarmet pude. Hold musen varm under og efter proceduren for at forhindre hypotermi.</li>
	<li>Påfør inert paraffin gaze dressing og klæbende sekundær dressing over podede sår.</li>
	<li>Placer musen i et individuelt bur. Kritisk skridt: Giv nogle mosede kost på buret gulvet for de første 72 timer efter den kirurgiske procedure og overvåge dagligt.</li>
	<li>Giv legetøj og berige miljøet.</li>
</ol>6. Indsamling af digitale billeddannelses- og post mortem-sår
<ol><li>Fotografi sår med et digitalt kamera ved at placere en lineal ved siden af såret (Figur 3).</li>
	<li>Ved forsøgets slutpunkt aflives dyrene ved at blive udsat for kuldioxid og cervikal dislokation. Kritisk trin: Overdreven trækhandling i huden under livmoderhalskræftforskydningen kan beskadige transplantatet.</li>
	<li>Ved post-mortem, kirurgisk punktafgifter dorsale brænde sår til fascia ved hjælp af en saks. Bisect sår. Fix halvdelen i 10% buffered formalin og proces for histologi og immunhistokemi. Fastfrysning af den anden halvdel i flydende nitrogen til RNA-ekstraktion og proteinkrytificering og opbevares ved -80 °C.</li>
</ol>7. Hud histologi, immunhistokemi og kollagen visualisering
<ol><li>Integrer prøver af huden i paraffin, skåret i 4 μm sektioner og sted på positivt ladede dias.</li>
	<li>Brug slides farves med hæmatoxylin og eosin til at vurdere hastigheden af re-epithelialization (% af det oprindelige sår). Det område af såret, der er dækket med neo-epidermis kan udtrykkes som en procentdel af hele såret (Figur 4). Brug et digitalt mikroskop program og ImageJ software til at udføre den mikroskopiske analyse af sektionerne.</li>
	<li>Brug histologiske sektioner (4 μm tykkelse) fremstillet af formalin-fast og paraffin-indlejret væv og underkaste dem immunhistokemi.</li>
	<li>For at vurdere kollagen I og fibronectin udtryk i sår, anvende primære antistoffer og inkubat i 1 h. Detektion kan udføres af artsspecifikke peberrodperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP)-konjugeret sekundære antistoffer.</li>
	<li>Reagersektioner med enten: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidin (DAB) eller (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabel over Materialer), som giver en lys rød farve (Figur 5). Scan sektionerne ved hjælp af et instrument og analysere med det digitale mikroskop ansøgning og ImageJ.</li>
	<li>For at muliggøre histologisk vurdering af kollagen aflejring, udføre trichrom farvning på histologiske sektioner ved hjælp af en kommerciel kit.</li>
	<li>For kollagen fiber visualisering, bruge multiphoton mikroskopi og anden harmoniske generation teknik (Figur 5). Brug et multifotonmikroskop til vævsscanning som tidligere beskrevet20. Brug en Ti:Sapphire laser med en center bølgelængde ved 810 nm som laserkilde til at generere anden harmoniske og to-foton ophidset fluorescens signaler (TPEF).</li>
	<li>Brug en laserstråle udstyret med en 25x/0,95 W mål at indsamle og ophidse anden harmoniske generation (SHG) og TPEF. Detekter signaler som beskrevet tidligere21 af NDD PMT-detektorer. Brug software til laserscanning kontrol og billede erhvervelse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shakir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+and+Limitations+of+Bilayer+Wound+Matrix-Based+Lower+Extremity+Reconstruction:+A+Multidisciplinary+Case-Control+Study+of+191+Wounds.">Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).</li><li>Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Burns.">Management of Burns.</a> New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).</li><li>Bosse, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+outcomes+of+reconstruction+or+amputation+after+leg-threatening+injuries.">An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries.</a> New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).</li><li>Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2019).</li><li>Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+atmospheric+plasma+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+signalling+and+enhances+burn+wound+neovascularisation.">Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation.</a> Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).</li><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration:+mechanisms,+signaling,+and+translation.">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).</li><li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Expression+of+Indoleamine+2,3,+Dioxygenase+Prolongs+Allogenic+Skin+Graft+Take+in+a+Mouse+Model.">Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 58-70 (2019).</li><li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+skin+grafting+in+murine+model.">A new method for skin grafting in murine model.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).</li><li>McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+allograft+rejection.">Skin allograft rejection.</a> Current Protocols in Immunology. , (2009).</li><li>Cristobal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Growth+Hormone+Therapy+for+Pressure+Ulcer+Healing+on+a+Human+Skin+Mouse+Model.">Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).</li><li>Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+to+study+bacterial+infections+targeting+the+microvasculature.">Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+maturation+of+Langerhans+cells+in+skin+transplants+and+explants.">Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants.</a> Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).</li><li>Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+towards+tolerance+and+the+importance+of+skin-specific+immunobiology.">Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology.</a> Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).</li><li>Stoikes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+evaluation+of+fixation+properties+of+fibrin+glue+for+ventral+incisional+hernia+repair.">Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair.</a> Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).</li><li>Foster, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+a+fibrin+sealant+for+adherence+of+autologous+skin+grafts+to+burn+wounds:+results+of+a+phase+3+clinical+study.">Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study.</a> Journal of Burn Care &amp; Research. 29 (2), 293-303 (2008).</li><li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL/6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters.">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Animal+Models+of+Wound+Healing.">Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li><li>Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+excisional+wound+splinting+model,+including+applications+for+stem+cell+transplantation.">The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation.</a> Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).</li><li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan+PPAR+agonist+IVA337+is+effective+in+prevention+and+treatment+of+experimental+skin+fibrosis.">Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).</li><li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+genetic+background+and+gender+in+a+mouse+model+of+bleomycin-induced+skin+fibrosis.">Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17, 145 (2015).</li><li>Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+Healing+and+Tissue+Engineering.">Wound Healing and Tissue Engineering.</a> Journal of Burn Care &amp; Research. 38 (3), 605-613 (2017).</li><li>Shakespeare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+wound+healing+and+skin+substitutes.">Burn wound healing and skin substitutes.</a> Burns. 27 (5), 517-522 (2001).</li><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds.">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li><li>Miller, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Staphylococcus+aureus+reporter+strain+with+click+beetle+red+luciferase+for+enhanced+in+vivo+imaging+of+experimental+bacteremia+and+mixed+infections.">Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Ifølge tykkelsen klassificering af brænde skade23, fuld tykkelse forbrændinger er karakteriseret ved tydelig involvering af hele tykkelsen af huden og visse del af det subkutane væv. Denne type sår kan kun helbrede ved sammentrækning eller med hudtransplantation2. En iboende begrænsning af den metode, der er beskrevet i denne artikel er, at kun fuld tykkelse grafts, i modsætning til split tykkelse grafts, som ofte anvendes i den kliniske indstilling, blev høstet fra halen af en mus. Dette skyldtes de tekniske vanskeligheder, da musehuden er for tynd til at opnå split tykkelse grafts. Det skal påpeges, at fuld tykkelse grafts kræver en godt vaskulariseret sår seng, mens split tykkelse hudtransplantater er i stand til at overleve på donor steder med mindrevaskularisering 24. Tidligere undersøgelser viste, at et forbrændingssår fremkaldt på bagsiden af musen var forbundet med en robust dannelse af nye vaskulatur5. Dette tyder på, at et godt vaskulært område, såsom dorsum af musen, kunne betragtes som den anatomiske vartegn for induktion af brænde sår.
Brænd sårdybde er en vigtig faktor at overveje. Dybden af forbrændingssåret skal være konsistent mellem de enkelte mus. Reproducerbarheden af brændsåret dybde afhænger af temperaturen af messing skabelon, tryk og varigheden af varmeeksponeringen. Forbrændingssårets dybde skal verificeres histologisk. Det er vigtigt at huske på, at overdrevent tryk eller langvarig eksponering af huden til forvarmet messing skabelon kan skade det underliggende væv. Vævet omkring rygsøjlen, herunder komponenterne i det centrale og perifere nervesystem, er følsomme over for varme, og hvis beskadiget kan resultere i bagben lammelse.
Selv om ingen postoperativ dødelighed var direkte forbundet med den kirurgiske procedure, et lille antal hårløse SKH1-Hrhr mus, som er særligt følsomme over for kulde, udviklet hypotermi og undlod at komme sig efter den generelle anæstesi. Derfor skal der være supplerende varme under alle æstetiske begivenheder, og konstant overvågning er påkrævet, mens musen bedøves.
Den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse, var ikke forbundet med infektion på operationsstedet. Der skal dog anvendes aseptisk teknik for at forhindre overførsel af mikroorganismer til det kirurgiske sår i den perioperative periode. Inokulering af såret med bioluminescerende eller fluorescerende mikroorganismer kan indarbejdes i proceduren. Denne teknik kan være nyttig til at studere infektiøse organismer og deres patogenese25. Eksogen tilsætning eller injektion af bioluminescerende bakterier kanf.eks. I betragtning af at musehår er kendt for at forstyrre in vivo hele dyr fluorescens og bioluminescens imaging, hårløse SKH1-Hrhr mus er ideelle værter for undersøgelser, der involverer fluorescerende eller bioluminescerende reportere.
Sårvævsprøver kan indsamles på forskellige tidspunkter og behandles med henblik på histologisk og immunhistokemisk analyse. Protein og RNA kan isoleres fra hudens biopsi, og molekylærbiologiske teknikker kan anvendes til at vurdere ekspressionen af nøglemolekyler, der er involveret i sårheling.
I denne undersøgelse beskrev vi en eksperimentel model af brænde sårheling og allogen hud engraftment. Denne procedure kan ændres og tjene som model for prækliniske undersøgelser.

Kirurgisk debridering og hudtransplantation er almindelige kliniske praksis, der anvendes i forvaltningen af kroniske sår1,brændesår 2, og akutte sår såsom traumatiske sår3. Hudtransplantation refererer til den kirurgiske procedure, som indebærer fjernelse af sund hud fra en del af kroppen og overføre det til en anden. Donorgrafter erstatter det tabte væv og giver et strukturelt stillads til cellulær migration og vækst. Efter integration i modtageren site, hudtransplantationer erstatte den tabte hud barriere ved at yde beskyttelse mod mikrobielle invasion, skadelige virkninger af det ydre miljø og overdreven tab af fugt4. Vellykket hudtransplantation integration afhænger af flere faktorer. Disse omfatter tilstrækkelig immunrespons ved tilstedeværelse af mikrobielle infektioner og rettidig opløsning af inflammation, robust angiogenese på sårstedet og etablering af vaskulære anastomoses mellem recipientsengen og donortransplantat5. Efterhånden som transplantatet begynder at nedbrydes, skal hjemmehørende hudceller erstattes af celler, der kan producere nye ekstracellulære matrixer. Samtidig skal de epidermale keratinocytter kravle over den nyproducerede matrix for at danne neo-epidermis og re-epithelialize såret. Det er derfor indlysende, at effektiv migration af celler fra recipientsengen til donortransplantaten er en anden afgørende faktor, der påvirker en vellykket graft inkorporering. I betragtning af det store antal faktorer, der er involveret isårheling 6, som kan være umuligt at kontrollere i de menneskelige forsøg på grund af etiske begrænsninger, modeller af præ-kliniske eksperimentelle hudtransplantation er nødvendige. Udvikling af prækliniske modeller for brændsårheling og tilhørende hudtransplantation vil være vigtig for forståelsen af komplekse mekanismer, der er involveret i kutan vævsreparation og afgørende for afprøvning af nye terapeutiske midler. In vitro-modellerne af sårheling er ude af stand til præcist at efterligne kompleksiteten af det kutane væv. In vivo-dyremodellerne er et uundværligt efterforskningsværktøj til at forstå de mekanismer, der er involveret i vævsreparation.
Flere metoder til hudtransplantation teknik blev udviklet i gnavere til at efterligne kirurgisk excision og brænde sår rekonstruktion7,8,9. De fleste af de tidligere beskrevne procedurer kunne imidlertid ikke fremkalde en termisk forbrændingsskade før hudtransplantation. I stedet for brænde sår, en fuld tykkelse excisional sår blev induceret, som derefter blev rekonstrueret med en fuld tykkelse hud allograft7. Forskellige anatomiske vartegn såsom øre, hale og ryg er blevet brugt til høst af donor huden i gnavere7,8. Der blev rapporteret forskellige graftfikserings- og stabiliseringsteknikker, herunder en "no suture technique"9,suturer 7 og kirurgisklim 10,11,12.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af en fuld tykkelse brænde sår, der ville opsummere den nuværende guld standard tilgang i brænde behandling, som indebærer ikke-levedygtige væv excision og hudtransplantation. En termisk brænde blev induceret på dorsum overfladen af en mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Burn eschar blev fjernet og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en donor mus. Der er tre vigtige fordele ved denne eksperimentelle model. For det første kan der induceres mere end ét brandsår på bagsiden af modtagermusen, og der kan høstes fire donorhudtransplantationer fra en enkelt hale af donormusen. Det betyder, at flere forsøgs- og kontrolbehandlinger potentielt kan sammenlignes med samme modtager- og donordyr. Afhængigt af den ønskede indgivelsesvej kan kontrolbehandlingen omfatte lokal eller systemisk administration af køretøjet eller placebo-kontrollen (f.eks. lokal anvendelse af salve, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs injektion af opløsning). For det andet kan tidspunktet for behandlingen og forsøgets endepunkt kontrolleres. For det tredje, denne model afhænger af genopbygningen af sår ved hjælp af fuld tykkelse grafts høstet fra halen, som er kendt for at have en højere sandsynlighed for en vellykket inkorporering i donor site i forhold til huden høstetfra bagsiden 13. Dette kan skyldes det lavere antal epidermale Langerhans celler, som spiller en central rolle i kutan immunobiologi, og er forbundet med hudtransplantationafstødning 14.
Den foreslåede model for sårheling og graft integration kan meget vel anvendes på transgene og knockout mus. Brugen af genetisk modificerede mus vil hjælpe med at belyse de roller, som visse gener kan spille under sårreparation. Eksogen påføring af topiske sårpræparater eller subkutan administration af terapeutiske antistoffer på skadesstedet kan også overvejes.
På grund af tekniske vanskeligheder er hudtransplantationer, der består af epidermis og en del af dermis, vanskelige at opnå i mus. Fuld tykkelse hudtransplantationer bestående af epidermis og fuld tykkelse dermis er kendt for at kræve en godt vaskulære sår seng for en vellykket integration. Den manglende evne til at høste hudtransplantationer i spaltetykkelser i mus kan betragtes som en begrænsning af denne model. Fikseringen af hudtransplantatet på modtagerens sårleje blev opnået ved anvendelse af den kirurgiske limlim, som er forbundet med mindre traume og hurtig nedbrydning sammenlignet med andre vævsfikseringsmidler15. Tidligere undersøgelser har vist, at suturering er forbundet med stærkere vævfiksering end den kirurgiske lim ved 24 timer efter den kirurgiske procedure15,som kan betragtes som en ulempe ved indgrebet. Men på senere tidspunkt, den biomekaniske styrke af sår behandlet med et kirurgisk klæbemiddel bliver sammenlignelig med suturer15 og bedre end korte fiksering16. Efter vævsfiksering med kirurgisk lim skal sår være dækket med en sårforbinding. Selv om sår på dorsale overflade af musen er vanskelige for dyret at nå, såret dressing, på den anden side, er let for dyret at manipulere og fjerne. Hyppige sårbandage ændringer kan være berettiget.
Anæstesi-induceret hypotermi hos små gnavere er et veldokumenteret fænomen17. Hypotermi er en bivirkning af denne procedure, som forårsager komplikationer, og potentielt kompromitterer både dyresundhed og datakvalitet. Derfor berettiger denne metode til gennemførelse af temperaturstyringsstrategier, især hvis der anvendes hårløse SKH1-Hrhr.
Den mest markante begrænsning ved at bruge mus til at efterligne menneskers sårlukning er forskellen mellem hudens anatomi og fysiologi. Musesår heler det meste via sammentrækning, mens menneskelige sår heler gennem granulering væv dannelse og re-epitelialization18. For at tage højde for denne uoverensstemmelse, den nuværende model kan ændres og anvendes i kombination med en splinting ring stramt klæbet omkring såret for at forhindre hud sammentrækning19. I betragtning af nogle fordele og ulemper ved denne in vivo protokol, denne model kunne tjene som et redskab til at studere visse processer, der er involveret i sårheling, der er umuligt at studere in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringue</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS + 01T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>NN-2613R</td>
			<td>1/2&#39;&#39; - 0,45 X 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96X21 mm Petri Dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing scale</td>
			<td>Kern</td>
			<td>EMB 5.2K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mouse</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td>BALB/cAnNRj</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M476-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond polymer Refine Red</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass block</td>
			<td>BVG</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Circular 10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPRECARE)</td>
			<td>Axience</td>
			<td>FR/V/6328396 3/2011</td>
			<td>administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burning apparatus Kausistar 400</td>
			<td>Tra&#231;aMatrix</td>
			<td>34010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaseViewer</td>
			<td>3DHISTECH Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>3Dhistech, Budapest, Hungary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Recommanded concentration 1:50; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)- glucose (Dextrose)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8769-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>D3400</td>
			<td>objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpels</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P04-36300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23750</td>
			<td>Recommanded dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22um</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Petelevage</td>
			<td>120070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Piramal healthcare</td>
			<td>FR/V/03248850/2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Imalgene</td>
			<td>FR/V/0167433 4/1992</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringers solution</td>
			<td>Flee-Flex</td>
			<td>1506443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamina multilabel slide scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>version 2.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Bond III</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>1757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukosilk dressing</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>72669-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>N01BB02</td>
			<td>local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Kern</td>
			<td>HDB-5K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson Trichrome Staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromesh Biopsy cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DM500</td>
			<td>Scanner 8000Hz NDD PMT detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non adhering dressing Adaptic</td>
			<td>Systagenix</td>
			<td>A6222</td>
			<td>12.7cm X 22.9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocrygel</td>
			<td>Tvm France</td>
			<td>###</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paracetamol 300mg</td>
			<td>Dolliprane</td>
			<td>Liquiz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde 4%</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>1169945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>MEDA pharma</td>
			<td>D08AG02</td>
			<td>diluted to 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKH1-Hrhr mouse</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>686SKH1-HR</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>AGAA000080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical adhesive</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>9927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>418545/9</td>
			<td>10 X 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Versylene Fresenius</td>
			<td>B230521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>2775161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ChameleonUltra</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>DS 16-02-16 F</td>
			<td>690-1040 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal imaging Camera</td>
			<td>Testo</td>
			<td>Testo 868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompum 2%)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>FR/V/ 8146715 2/1980</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft

Trivielle overfladiske sår helbrede uden komplikationer ved primær hensigt. Dybe sår, såsom fuld tykkelse forbrændinger, helbrede ved sekundær hensigt og kræver kirurgisk debridering og hudtransplantation. Vellykket integration af donortransplantat i en modtager sår seng afhænger rettidig rekruttering af immunceller, robust angiogenic respons og nye ekstracellulære matrix dannelse. Udviklingen af nye terapeutiske midler, som er rettet mod nogle vigtige processer, der er involveret i sårheling, hindres af manglen på pålidelige prækliniske modeller med optimeret objektiv vurdering af sårlukning. Her beskriver vi en billig og reproducerbar model af eksperimentel fuld tykkelse brænde sår rekonstrueret med en allogen hudtransplantation. Såret er induceret på dorsum overfladen af bedøvet indavlede vilde type mus fra BALB / C og SKH1-Hrhr baggrunde. Forbrændingen er fremstillet ved hjælp af en messing skabelon måler 10 mm i diameter, som er forvarmet til 80 °C og leveres ved et konstant tryk i 20 s. Burn eschar er punkteret 24 timer efter skaden og erstattet med en fuld tykkelse graft høstet fra halen af en genetisk lignende donor mus. Ingen specialiseret udstyr er nødvendig for proceduren og kirurgiske teknikker er ligetil at følge. Metoden kan uden besvær implementeres og gengives i de fleste forskningsindstillinger. Der er knyttet visse begrænsninger til modellen. På grund af tekniske vanskeligheder er høsten af tyndere hudtransplantater i spaltningstykkelse ikke mulig. Den kirurgiske metode, vi beskriver her giver mulighed for rekonstruktion af brænde sår ved hjælp af fuld tykkelse hudtransplantationer. Det kan anvendes til at udføre prækliniske terapeutiske test.

Resultaterne viser, at den udviklede protokol er en enkel metode, som tillader induktion af en fuld tykkelse brænde sår i mus. Forbrændinger er induceret ved hjælp af en forvarmet messing skabelon( Figur 1A-C). Det brændte område fremstår som et cirkulært sår med en hvid eschar og en hyperæmisk zone. Størrelsen af brænde sår er lidt større på 24 timer efter brænde skade som følge af den velbeskrevet fænomen kendt som brænde skade progression, som muligvis skyldes akut inflammation22. Efter excision rekonstrueres brandsår ved hjælp af allogen hudtransplantation (figur 3). På dag 7 efter forbrændingsskaden bliver sårvaskulære 5, hvilket er en indikation af en vellykket indpodning. Epidermal keratinocytter migrere fra den tilstødende modtager hud i bestræbelserne på at lukke såret og bygge bro mellem de to kanter af sårene. Mikroskopisk analyse af H og E farvede del af sår viste, at længden af neo-epidermis bliver betydeligt længere på dag 7 efter brænde skade i forhold til dag 3 efter brænde skade (Figur 4B). Før der udføres en stor undersøgelse, anbefales det på det kraftigste, at forskerne gennemfører en pilotundersøgelse, som gør det muligt at undersøge en ny intervention, vurdering af gennemførligheden, identifikation af ændringer af metoden for at sikre reproducerbarhed. Statistisk signifikante virkninger er vanskelige at påvise i mindre stikprøver, mens en forøgelse af stikprøvestørrelsen er en måde at øge en tests statistiske effekt på. For at påvise en statistisk signifikant forskel (p < 0,05) i hastigheden af re-epitialization(figur 4) mellem grupper, skal stikprøvestørrelsen være mellem seks og otte mus pr. gruppe. Alle forsøg bør gentages mindst to gange. Som matrix producerende celler, såsom fibroblaster, migrere fra modtageren væv ind i transplantatet, centrale komponenter i den ekstracellulære matrix, herunder kollagen I og fibronectin bliver stærkt udtrykt i den nydannede matrix (Figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg"> Figur 1: Opsætning af brænder enhed. (A) Placering og opsætning af den brændende enhed. Forbrændingsanordningen er tilsluttet temperaturregulatoren og er fastgjort til det digitale monometer for at muliggøre overvågning af trykket. Den brændende enhed er suspenderet over en justerbar fase - flad overflade, hvorpå mus er placeret til induktion af brænde. (B-C) Et nærbillede af messingskabelonen, der bruges til at fremkalde sårforbrændinger. (C) Diameteren af messing skabelon er 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk illustration af de forskellige trin, der kræves for at gengive den forsøgsmodel, der er beskrevet i denne artikel. Der er tre hovedtrin til proceduren: (i) induktion af brændesåret ved hjælp af en forvarmet messing skabelon; ii) kirurgisk excision af det ikke-levedygtige nekrotiske væv 24 timer efter forbrændingsskaden iii) kirurgisk sårrekonstruktion ved hjælp af en allogen hudtransplantation af fuld tykkelse, der er høstet fra en donormus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg"> Figur 3: Den makroskopiske opfattelse af rekonstruerede mus brænde sår. Repræsentative digitale billeder af brandsår rekonstrueret med allogene hudtransplantationer på dag 0, 1, 3 og 7 efter forbrændingsskade. Linealen på billederne er i millimeter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg"> Figur 4: Mikroskopisk udseende af sår 3 og 7 dage efter forbrændingsskade. H&E-farvede dele af sår 3 og 7 dage efter brænde skade. Længden af neo-epidermis (stiplet linje) er signifikant forøget i (A) dag 3 sår i forhold til (B) dag 7 sår. I (A) og (B) er skalabjælken 100 μm. (C) Grafisk repræsentation af procentdelen af reepiialisering af sår. Dette blev vurderet ved at måle længden af neo-epidermis på dag 3 og 7 post-burn skade og udtrykt som en procentdel af hele såret længde. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± S.E.M. (n = 6 mus i dag 3-gruppen; n = 6 mus i dag 7-gruppen, *p < 0,05; Studerendes t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg"> Figur 5: Vurdering af den ekstracellulære matrix og kollagen I visualisering. Repræsentative billeder af immunhistokemianalyse på dag 7 musesår farves for (A) kollagen og (B) fibronectin. Bemærk intens rød farvning i aflange spindelformede kollagen I-positive celler. Bemærk brun farvning i fibronectin-positive celler i dermis af dag 7 sår. Skalabar = 50 μm i alle billeder. I (A) og (B) angiver e epidermis og d betegner dermis. (C) Visualisering af kollagen fibre og histologisk vurdering af kollagen deposition. (D) Repræsentant TPEF / SHG kollagen billede af dag 7 musesår. Samtidig TPEF/SHG-anskaffelse ved hjælp af cirkulær polarisering og SHG-signaler blev selektivt behandlet for at opnå en binær fordeling af SHG efter at have anvendt en tærskel. TPEF-billeder (grønne) og SHG-billeder (hvide) var pseudofarvede og overlejrede. Skalabar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft at JoVE.com

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en murine model af brænde sårheling. En termisk brænde blev induceret på brystskind af mus ved hjælp af en forvarmet messing skabelon. Brændt væv blev debrideret og overlejret med en hudtransplantation høstet fra halen af en genetisk lignende donormus.

En Murine Model af en Burn Sår rekonstrueret med en allogeneic hudtransplantation

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Det overordnede mål med denne procedure er at skabe en reproducerbar murine model af fuld tykkelse brænde sår rekonstrueret med en allergisk hudtransplantation. Huden er opdelt i to komponenter epidermis og dermis. Under dermis er subkutane fedt, som dækker knogle, sener eller fascia.Tykkelsen klassificering af brænde skade bruges ofte til at definere omfanget af brænde skade dybde. Overfladiske forbrændinger involverer kun epidermis, Overfladiske delvise tykkelse forbrændinger inddrage epidermis og kun pillory eller øvre dermis. Dyb dermal delvis tykkelse forbrændinger inddrage epidermis og dermis, den retikulære dermis indeholder blodkar, hårsækkene, olie og sved kirtler.Fuld tykkelse forbrændinger er karakteriseret ved bevisindsindydelse af hele tykkelsen af huden og eventuelt subkutane væv. Denne type sår kan kun hele ved sammentrækning eller med hudtransplantation. Det overordnede mål med denne procedure var at skabe en fuld tykkelse brænde sår og rekonstrueret med en fuld tykkelse hudtransplantation.Dette blev opnået ved at sætte en cirkulær messing blok forvarmet til 80 grader Celsius og anvendes på munden hud i løbet af 20 sekunder. Nekrotisk væv blev kirurgisk fjernet 24 timer efter forbrændingsskaden. Hudtransplantationer med fuld tykkelse, der blev høstet fra halen på en donormus, blev lagt over de punkterede brændesår.Transplantaterne vil derefter sikret med et kirurgisk klæbemiddel. Både donor- og recipientdyr kommer fra den samme indavlede stamme af mus. Biopsimus anvendes i løbet af undersøgelsen.Men, også stamme af mus kan også anvendes. Dette omfatter immunkompetente hårløse mus, som er særligt nyttige i sårheling undersøgelser. Som hårfjerning og tilhørende inflammation en hobo gjorde og hår genvækst ikke forstyrrer digital billedanalyse, når området målinger og andre typer af mikroskopiske sår vurdering.Dette gælder især i modeller for infektion, hvor vores suspension af bio-organisme og bakterier anvendes på dette dit ansigt af såret og bio-organisme signal måles for at angive hastigheden af bakterievækst. Den termiske brænde skade enhed består af en skræddersyet cirkulær messing blok måler 10 millimeter i diameter forvarmet til 80 grader Celsius. Temperaturen af messing blok er verificeret ved hjælp af en infrarød termisk billedbehandling kamera.For at skabe en fuld tykkelse brænde sår, messing blok anvendes i 20 sekunder ved hjælp af et konstant tryk på 0,15 Newton, som overvåges af digitale manometer. Multimodal analgesi er den bedste praksis for smertebehandling i invasive dyreforsøg. Den ideelle administration ordning analgesi omfatter forebyggende eller præ-proceduremæssige smertestillende administration.Paracetamol ved tre milligram pr måltid blev tilsat drikkevand og leveret 12 timer før og i 72 timer efter indgrebet. Buprenorphin ved 0,05 mikrogram pr. gram blev administreret subkutigt 30 minutter før indgrebet og hver sjette time i de første 72 timer efter indgrebet. Lidocain på fem milligram pr kg blev administreret subkutant omkring dorsum af hver mus 15 minutter før proceduren, et samlet volumen på 200 mikroliter af lactated ringers Løsning på 5% dextrose blev injiceret subkutant før proceduren, og seks timer efter proceduren for at forhindre dehydrering.Mus var nisertid ved hjælp af en intraperitoneal injektion af Xylazine på 10 mg / kg, og Ketamin på 100 mg / kg. Bedøvelsesdybde kan vurderes via en tå knivspids. Anæstesi afskaffer blink refleks, forhindrer forfriskning af tåre film, der kræves for vedligeholdelse af hornhinde hydrering og øjet kontinuerligt udsættes for luft hurtigt bliver dehydreret, et smøremiddel blev anvendt på øjnene for at opretholde hydrering af hornhinden.Dorsum af hver mus er klippet og depilerende creme anvendes i et minut for at fjerne hår. Nisertide dyret er placeret udsat på et fladt bord og termisk brænde er skabt ved at anvende en cirkulær messing blok forvarmet til 80 grader Celsius for varigheden af 20 sekunder. Musen, er placeret tilbage på varmepuden for at holde det varmt og forhindre hypotermi, en hyppig bivirkning af bedøvelsesmidler.Når musen er kommet sig efter bedøvelse, kan den anbringes i et enkelt bur. 24 timer efter induktion af brænde skade. Nekrotisk væv er kirurgisk ophidser.Fire sygdomshud graft er høstet fra euthanize donor mus hale. Selv om den anden side, så der er under halen kan også bruge musen model. Så graden af menneskelig respons kan variere afhængigt af oprindelsen af donor hudtransplantation.For eksempel har øre og ryg hud ikke længere i salg i forhold til hale hud og provokere en mere robust menneskelig reaktion, hvilket kan føre til graft afvisning. Hudtransplantater tykkelse kan også tages i betragtning, da det kan spille en afgørende faktor i en vellykket engraftment af hudtransplantation tage. Sikker hud som den fra bagsiden har højere sandsynlighed for fiasko på grund af de højere metaboliske krav af vævet.Derfor er den rapporterede succes med allergifremkaldende hudtransplantation engraftment for ryghuden lavere end den rapporterede succes for hale hudtransplantation. Anæstesi blev induceret ved indånding af 5% Isofluran i 100% ilt ved en strømningshastighed på fire liter i minuttet, efterfulgt af vedligeholdelse af anæstesi ved hjælp af 2% Isoflurane på to liter i minuttet til vedligeholdelse under operationen. Buprenorphin blev administreret ved indledningen af proceduren for at give postoperativ analgesi.Brænde sår blev prepped med Povidone-jod, efterfulgt af 70% alkohol. Nekrotisk Burn er fjernet med en saks til at fjerne den cirkulære fuld tykkelse hudfejl, panniculus carnosus lag af hypodermis fjernes for at skabe en stabil hud graft modtager seng nogle forfattere foreslår at bevare panniculus carnosus lag af hypodermis, da det menes at være nødvendigt for revaskularisering af transplantatet. Men i dette tilfælde kan mobiliteten af dette lag og de deraf følgende potentielle forskydningskræfter mellem transplantatet og modtagersengen blive problematisk.Fjernelse af panniculus carnosus lag ikke negativ indvirkning succes podning procedure. Fuld tykkelse grafts, er høstet fra halen af aflivede donor mus. Halen er indskåret i længderetningen, så huden kan adskilles fra det underliggende bløde væv.Hale huden spredes derefter på en petriskål fyldt med sterile, normale saltvand og skæres i cirkulære pletter ved hjælp af en lineal. Transplantaterne overføres derefter til en petriskål med en steril gaze dyppet i normalt saltvand og holdt de fire grader, indtil de er klar til podning. Transplantaterne fastgøres derefter til modtagersengen med kirurgisk lim.Hullerne mellem donor hudtransplantation og modtager sårseng er forsigtigt tryk for at tilpasse hudkanter. Sårene er klædt i inert paraffin gaze og klæbende sekundær dressing. Digitale fotografier, af podede sår blev taget på en, tre og syv dage efter brænde skade.Ved obduktionen blev de dorsale brændesår kirurgisk fjernet til fascia, sår blev gennemskåret med den ene halvdel fast i 10% buffered formalin, og behandles for histologi og immunhisemichemistry. Hudtransplantationer giver et stilladssystem til cellulær migration. Vellykket graft integration afhænger af effektive fibroblaster og keratinocyt migration fra modtageren bud i donortransplantation, som langsomt nedbrydes og erstattes af celler i stand til at producere den ekstracellulære matrix.Histologiske del af massesår blev udsat for hæmatoxylin og eosin farvning. Repræsentative billeder af hæmaxylin og eosin farvede dele af sår, viste, at længden af nær epidermis fremhævet i gult er steget betydeligt på dag syv, sammenlignet med dag tre efter brænde skade. For at vurdere hastigheden af re-epitelisering, det område af såret, der var dækket med nær epidermis blev udtrykt som en procentdel af hele såret.Den ekstracellulære matrix er den ikke cellulære komponent i huden, som giver stilladser til de cellulære komponenter. Den ekstracellulære matrix består af fibrøse proteiner, såsom kollagen og fibronectin. Disse molekyler øge modenhed sår og opretholde den strukturelle integritet af huden semiquantitative immunohistochemistry for kollagen type et, og histologiske pletter såsom Mason's trichrome kan bruges til at hjælpe den ekstracellulære matrix integritet fra foto mikrograf.Mere avancerede metoder såsom anden harmoniske generation mikroskopi er opstået som et kraftfuldt redskab til kvantitativ analyse af kollagen struktur. Murine hudpodning giver en fremragende potentiel præklinisk model til at undersøge integrationen af grafer i modtagersiden. Denne undersøgelse viser en pålidelig metode til at udføre hudtransplantationer i en musemodel samt den histologiske vurdering af de helbredende sår.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Udvikling af en kvantitativ rekombinase Polymerase amplifikationsanalyse med et indre Positiv kontrol

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

En Murine Model af Lodret Ærme gastrektomi

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Kvantificere leukocyt udgang via lymfekar fra Murine hud og tumorer

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Inhibering af sårepidermisdannelse via fuld hudklapkirurgi under regenerering af axolotl-lemmer

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Bioluminescerende overvågning af transplantatoverlevelse i en adoptiv overførselsmodel af autoimmun diabetes hos mus

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...