Name: a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense e École Polytechnique. Agradecemos ao nosso colega Yann Plantier, da École Polytechnique, que forneceu insights e conhecimentos que ajudaram muito na produção do arquivo de vídeo. Os autores agradecem aos senhores deputados Benoit Peuteman e Charlotte Auriau do INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif pelo seu bem-estar animal e pela experiência assistencial fornecida durante o curso deste projeto.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Departamento de Ensino Superior e Pesquisa da França (Número de Estudo: 122162017111616517670v2 e DAP180012). Todos os camundongos foram alojados sozinhos na chegada em gaiolas plásticas e foram permitidos um período de aclimatação de 7 dias antes do estudo. A sala dos animais foi mantida em um ciclo claro/escuro de 12/12 h (luzes acesas às 07:00). Comida e água da torneira foram fornecidos ad libitum. Os camundongos BALB/c e SKH1-Hrhr foram alimentados com dieta tradicional à base de trigo/soja. A cama de serragem foi fornecida juntamente com material de aninhamento.
1. Preparação do equipamento
<ol><li>Prepare um dispositivo de queima para o procedimento e coloque-o a 80 °C usando o controlador de temperatura(Figura 1A). Verifique a temperatura do modelo de latão(Figura 1B,C) usando a câmera de imagem térmica infravermelha.</li>
	<li>Certifique-se de que o manômetro digital está funcionando corretamente.</li>
	<li>Cubra o palco com uma cortina cirúrgica e ajuste a altura da mesa(Figura 1A).</li>
</ol>2. Cuidados com animais pré-operatórios e intra-operacionais
<ol><li>Adquira ratos BALB/c e SKH1-Hrhr, 6-8 semanas de idade.</li>
	<li>Adicione a suspensão do paracetamol a 3 mg/mL à água potável e forneça 12 horas antes e até 72 horas após o procedimento.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre buprenorfina subcutâneamente a 0,05 μg/g 30 min antes do procedimento e a cada 6 horas para as primeiras 72 horas após o procedimento.</li>
	<li>Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre lidocaína no dorso do rato e 2-3 mm distal na área da ferida queimada. Injete lidocaína a 0,05 μg/g subcutânea 15 min antes da indução da ferida queimada.</li>
	<li>Anesthetize camundongos usando uma injeção intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg e cetamina 100 mg/kg. Use uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G para administrar a injeção.</li>
	<li>Passo crítico: Coloque o rato anestesiado em uma almofada aquecida e mantenha o mouse aquecido para evitar hipotermia durante os primeiros 30 minutos após a indução da anestesia e por pelo menos 15 minutos após a recuperação da anestesia. Além da almofada aquecida, outras modalidades, incluindo lâmpadas de calor, líquidos quentes circulantes ou ar, e reservatórios de calor pré-aquecidos podem ser usados para regular a temperatura corporal.</li>
	<li>Aplique gel de lubrificação nos olhos do camundongo para evitar a desidratação da córnea.</li>
	<li>Use o reflexo de retirada do dedo do dedo do dedo do dedo para avaliar a profundidade da anestesia.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre 200 μL de Solução de Anel Lactado suplementada com 5% de dextrose. Administre a substituição do fluido subcutânea imediatamente após a indução da anestesia e 6 horas após o procedimento para evitar a desidratação.</li>
</ol>3. Indução total da ferida de queimadura de espessura
<ol><li>Raspe o rato anestesiado com os cortadores de cabelo.</li>
	<li>Aplique creme depilação na superfície dorsum do mouse por 1 minuto. Limpe o creme usando uma gaze estéril e limpe a área com um pedaço de gaze úmida. Borrique a pele com alguma gaze até secar.</li>
	<li>Coloque o mouse no palco coberto com uma cortina cirúrgica e mova o palco para cima mais perto do modelo de latão pré-aquecido.</li>
	<li>Aplique o modelo de latão circular na parte de trás do mouse (80 °C para 20 s) usando pressão constante de 0,15 N(Figura 2).</li>
	<li>
Passo crítico: Imediatamente após a indução da queimadura, coloque o animal anestesiado na almofada aquecida para evitar hipotermia e mantenha o rato aquecido durante e após o procedimento. Uma vez recuperado da anestesia, devolva o rato para a gaiola.</li>
	<li>
Passo crítico: Forneça uma dieta amassada no chão da gaiola durante as primeiras 72 horas após o procedimento cirúrgico. Ratos às vezes relutam em chegar a um tubo de sipper para beber água depois de uma lesão na ferida queimada.</li>
</ol>4. Colheita do enxerto de doador
<ol><li>Faça uma incisão longitudinal com um bisturi na parte superior da cauda do rato doador e remova suavemente a pele usando fórceps cirúrgicos.</li>
	<li>Coloque a pele da cauda em uma placa de Petri estéril cheia com 10 mL de solução salina estéril de 0,9%. Use uma régua para medir enxertos individuais e corte a pele da cauda em pedaços, cada um medindo 15 mm, usando um bisturi.</li>
	<li>Uma vez preparado, mantenha os enxertos de pele em solução salina de 0,9% a 4 °C por até 2 horas.</li>
</ol>5. Excisão cirúrgica e enxerto de pele
<ol><li>Vinte e quatro horas após a indução da queimadura, prepare o rato para anestesia por inalação de isoflurano. Coloque o rato na câmara de indução e induza a anestesia usando 5% de isoflurane em 100% de oxigênio a uma taxa de fluxo de 4 L/min. Para manter a anestesia durante a cirurgia, use 2% de isoflurano a 2 L/min.</li>
	<li>Coloque uma cortina cirúrgica no mouse e corte uma janela para expor o campo cirúrgico. Usando a técnica asséptica, cotonete a ferida primeiro com povidone-iodo e depois com 70% de álcool.</li>
	<li>Pegue suavemente o tecido queimado com um par de pinças cirúrgicas e extirda todo o tecido necrosado e inviável com tesouras cirúrgicas estéreis e pinças. Remova a camada panniculus carnosus da hipodermes para criar uma cama receptora estável.</li>
	<li>Coloque o enxerto de pele na cama de ferida recém-preparada. Puxe suavemente a pele circundante em direção ao enxerto de pele usando pinças cirúrgicas. Aplique algum adesivo cirúrgico para fixar o enxerto na cama da ferida e pressione suavemente para alinhar as bordas da pele. Passo crítico: O tamanho do leito da ferida deve ser ligeiramente maior do que o tamanho do enxerto de pele para garantir o enxerto bem sucedido.</li>
	<li>Permita que o rato se recupere da anestesia. Passo crítico: Coloque o mouse em uma almofada aquecida. Mantenha o rato aquecido durante e após o procedimento para evitar hipotermia.</li>
	<li>Aplique o curativo de gaze de parafina inerte e o curativo secundário adesivo sobre a ferida enxertado.</li>
	<li>Coloque o rato em uma gaiola individual. Passo crítico: Forneça alguma dieta de purê no chão da gaiola durante as primeiras 72 horas após o procedimento cirúrgico e monitore diariamente.</li>
	<li>Forneça brinquedos e enriqueça o meio ambiente.</li>
</ol>6. Imagem digital e coleta de feridas post-mortem
<ol><li>Fotografar feridas com uma câmera digital colocando uma régua ao lado da ferida(Figura 3).</li>
	<li>No ponto final do experimento, eutanize os animais pela exposição ao dióxido de carbono e à luxação cervical. Passo crítico: A ação excessiva de puxar a pele durante a luxação cervical pode danificar o enxerto.</li>
	<li>Na autópsia, extirem cirurgicamente as queimaduras dorsais na fáscia usando uma tesoura. Feridas de bissecto. Corrija metade em formalina tamponada de 10% e processo para histologia e imunohistoquímica. Congele rapidamente a outra metade em nitrogênio líquido para extração de RNA e quantitação de proteínas e mantenha-se a -80 °C.</li>
</ol>7. Histologia da pele, imunohistoquímica e visualização de colágeno
<ol><li>Incorpore amostras de pele em parafina, corte para seções de 4 μm e coloque em lâminas carregadas positivamente.</li>
	<li>Use slides manchados com hematoxilina e eosina para avaliar a taxa de re-epitelialização (% da ferida original). A área da ferida coberta com neo-epiderme pode ser expressa em percentagem de toda a ferida(Figura 4). Use um aplicativo de microscópio digital e um software ImageJ para realizar a análise microscópica das seções.</li>
	<li>Use seções histológicas (4 μm de espessura) preparadas a partir de tecido fixo e embutido em parafina e submá-los à imunohistoquímica.</li>
	<li>Para avaliar o colágeno I e a expressão da fibronectina nas feridas, aplique anticorpos primários e incubar por 1 h. A detecção pode ser realizada por peroxidase de rabanete específica da espécie (HRP) ou fosfatismo alcalino (AP)-conjugado anticorpos secundários.</li>
	<li>Reacionar seções com: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidina (DAB) ou (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabela de Materiais), que produz uma cor vermelha brilhante(Figura 5). Escaneie as seções usando um instrumento e analise com o aplicativo de microscópio digital e ImageJ.</li>
	<li>Para habilitar a avaliação histológica da deposição de colágeno, realize a coloração tricrática em seções histológicas usando um kit comercial.</li>
	<li>Para visualização de fibra de colágeno, utilize microscopia multifotônica e segunda técnica de geração harmônica(Figura 5). Use um microscópio multifotono para imagens teciduais como descrito anteriormente20. Use um laser Ti:Safira com comprimento de onda central a 810 nm como fonte laser para gerar sinais de fluorescência harmônica e de dois fótons animados (TPEF).</li>
	<li>Use um raio laser equipado com um objetivo de 25x/0,95 W para coletar e excitar a segunda geração harmônica (SHG) e o TPEF. Detecte sinais como descrito anteriormente21 por detectores pmt ndd. Use software para controle de varredura a laser e aquisição de imagens.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shakir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+and+Limitations+of+Bilayer+Wound+Matrix-Based+Lower+Extremity+Reconstruction:+A+Multidisciplinary+Case-Control+Study+of+191+Wounds.">Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).</li><li>Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Burns.">Management of Burns.</a> New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).</li><li>Bosse, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+outcomes+of+reconstruction+or+amputation+after+leg-threatening+injuries.">An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries.</a> New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).</li><li>Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2019).</li><li>Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+atmospheric+plasma+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+signalling+and+enhances+burn+wound+neovascularisation.">Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation.</a> Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).</li><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration:+mechanisms,+signaling,+and+translation.">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).</li><li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Expression+of+Indoleamine+2,3,+Dioxygenase+Prolongs+Allogenic+Skin+Graft+Take+in+a+Mouse+Model.">Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 58-70 (2019).</li><li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+skin+grafting+in+murine+model.">A new method for skin grafting in murine model.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).</li><li>McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+allograft+rejection.">Skin allograft rejection.</a> Current Protocols in Immunology. , (2009).</li><li>Cristobal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Growth+Hormone+Therapy+for+Pressure+Ulcer+Healing+on+a+Human+Skin+Mouse+Model.">Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).</li><li>Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+to+study+bacterial+infections+targeting+the+microvasculature.">Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+maturation+of+Langerhans+cells+in+skin+transplants+and+explants.">Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants.</a> Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).</li><li>Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+composite+allotransplantation:+towards+tolerance+and+the+importance+of+skin-specific+immunobiology.">Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology.</a> Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).</li><li>Stoikes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+evaluation+of+fixation+properties+of+fibrin+glue+for+ventral+incisional+hernia+repair.">Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair.</a> Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).</li><li>Foster, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+a+fibrin+sealant+for+adherence+of+autologous+skin+grafts+to+burn+wounds:+results+of+a+phase+3+clinical+study.">Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study.</a> Journal of Burn Care &amp; Research. 29 (2), 293-303 (2008).</li><li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL/6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters.">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Animal+Models+of+Wound+Healing.">Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li><li>Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+excisional+wound+splinting+model,+including+applications+for+stem+cell+transplantation.">The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation.</a> Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).</li><li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan+PPAR+agonist+IVA337+is+effective+in+prevention+and+treatment+of+experimental+skin+fibrosis.">Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).</li><li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+genetic+background+and+gender+in+a+mouse+model+of+bleomycin-induced+skin+fibrosis.">Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17, 145 (2015).</li><li>Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+Healing+and+Tissue+Engineering.">Wound Healing and Tissue Engineering.</a> Journal of Burn Care &amp; Research. 38 (3), 605-613 (2017).</li><li>Shakespeare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+wound+healing+and+skin+substitutes.">Burn wound healing and skin substitutes.</a> Burns. 27 (5), 517-522 (2001).</li><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds.">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li><li>Miller, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Staphylococcus+aureus+reporter+strain+with+click+beetle+red+luciferase+for+enhanced+in+vivo+imaging+of+experimental+bacteremia+and+mixed+infections.">Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

De acordo com a classificação de espessura da lesão por queimadura23,as queimaduras de espessura total são caracterizadas pelo evidente envolvimento de toda a espessura da pele e determinada porção do tecido subcutâneo. Este tipo de ferida só pode curar por contração ou com enxerto de pele2. Uma limitação inerente ao método descrito neste artigo é que apenas enxertos de espessura total, em oposição aos enxertos de espessura dividida, que são frequentemente utilizados no cenário clínico, foram colhidos da cauda de um camundongo. Isso se deveu à dificuldade técnica, já que a pele do rato é muito fina para obter enxertos de espessura dividida. Deve-se ressaltar que os enxertos de espessura total requerem um leito de ferida bem vascularizado, enquanto os enxertos de pele de espessura dividida são capazes de sobreviver em locais doadores com menor vascularidade24. Estudos anteriores mostraram que uma ferida de queimadura induzida na parte de trás do camundongo estava associada a uma formação robusta de nova vasculatura5. Isso sugere que uma área bem vascularizada, como o dorso do camundongo, poderia ser considerada como o marco anatômico para a indução de queimaduras.
A profundidade da ferida de queimadura é um fator importante a considerar. A profundidade da ferida de queimadura deve ser consistente entre ratos individuais. A reprodutibilidade da profundidade da ferida de queimadura depende da temperatura do modelo de latão, pressão e duração da exposição ao calor. A profundidade da ferida de queimadura deve ser verificada histologicamente. É importante ter em mente que a pressão excessiva ou a exposição prolongada da pele ao modelo de latão pré-aquecido podem ferir o tecido subjacente. O tecido ao redor da coluna vertebral, incluindo os componentes do sistema nervoso central e periférico, são sensíveis ao calor, e se danificados podem resultar em paralisia da perna traseira.
Embora nenhuma mortalidade pós-operatória tenha sido diretamente associada ao procedimento cirúrgico, um pequeno número de camundongos SKH1-Hrhr sem cabelo, que são especialmente sensíveis ao frio, desenvolveram hipotermia e não se recuperaram após a anestesia geral. Portanto, o calor suplementar deve ser fornecido durante todos os eventos estéticos e é necessária vigilância constante enquanto o rato é anestesiado.
O método descrito neste estudo não foi associado à infecção no local cirúrgico. No entanto, a técnica asséptica deve ser utilizada para evitar a transferência de microrganismos para a ferida cirúrgica durante o período perioperatório. A inoculação da ferida com microrganismos bioluminescentes ou fluorescentes pode ser incorporada ao procedimento. Esta técnica pode ser útil no estudo de organismos infecciosos e sua patogênese25. Por exemplo, a adição exógena ou injeção de bactérias bioluminescentes, pode permitir o monitoramento da carga microbiana utilizando a imagem animal in vivo inteira25. Dado que o cabelo de rato é conhecido por interferir com a fluorescência animal in vivo e a imagem de bioluminescência, os camundongos SKH1-Hrhr sem cabelo são os anfitriões ideais para os estudos envolvendo repórteres fluorescentes ou bioluminescentes.
Amostras de tecidos de feridas podem ser coletadas em diferentes pontos de tempo e processadas para análise histológica e imunohistoquímica. Proteína e RNA podem ser isolados da biópsia da pele e técnicas de biologia molecular podem ser usadas para avaliar a expressão de moléculas-chave envolvidas na cicatrização de feridas.
No presente estudo, descrevemos um modelo experimental de cicatrização de feridas queimadas e enxerto aogenético da pele. Este procedimento pode ser modificado e servir como modelo para estudos pré-clínicos.

Debridamento cirúrgico e enxerto de pele são práticas clínicas comuns utilizadas no manejo de feridas crônicas1, queimaduras2e feridas agudas como feridas traumáticas3. O enxerto de pele refere-se ao procedimento cirúrgico, que envolve a remoção da pele saudável de uma parte do corpo e a transferência para outra. Os enxertos de doadores substituem o tecido perdido e fornecem um andaime estrutural para migração e crescimento celular. Após a integração no local do receptor, os enxertos de pele substituem a barreira da pele perdida, proporcionando proteção contra invasão microbiana, efeitos nocivos do ambiente externo e perda excessiva de umidade4. A integração bem sucedida do enxerto de pele depende de vários fatores. Estes incluem respostas imunes adequadas na presença de infecções microbianas e resolução oportuna de inflamação, angiogênese robusta no local da ferida e estabelecimento de anastomoses vasculares entre o leito receptor e o enxerto do doador5. À medida que o enxerto começa a se degradar, as células dérmicas residentes devem ser substituídas por células capazes de produzir uma nova matriz extracelular. Ao mesmo tempo, os queratinócitos epidérmicos devem rastejar sobre a matriz recém-produzida para formar a neo-epiderme e re-epitelializar a ferida. É evidente, portanto, que a migração eficiente das células do leito receptor para o enxerto do doador é outro fator determinante que influencia a incorporação bem sucedida do enxerto. Dado o grande número de fatores envolvidos na cicatrização de feridas6, o que pode ser impossível de controlar nos ensaios em humanos devido a limitações éticas, são necessários modelos de enxerto experimental pré-clínico da pele. O desenvolvimento de modelos pré-clínicos de cicatrização de feridas queimadas e enxerto de pele associado será importante para a compreensão de mecanismos complexos envolvidos na reparação de tecidos cutâneos e essenciais para o teste de novos agentes terapêuticos. Os modelos in vitro de cicatrização de feridas são incapazes de imitar com precisão a complexidade do tecido cutâneo. Os modelos in vivo animal são uma ferramenta investigativa indispensável na compreensão dos mecanismos envolvidos na reparação de tecidos.
Vários métodos de técnica de enxerto de pele foram desenvolvidos em roedores para imitar a excisão cirúrgica e a reconstrução da ferida de queimadura7,,8,9. No entanto, a maioria dos procedimentos descritos anteriormente não induziu uma lesão térmica antes do enxerto de pele. Em vez da ferida queimada, uma ferida excisional de espessura total foi induzida, que foi então reconstruída com uma alusão de pele de espessura total7. Vários marcos anatômicos como a orelha, cauda e costas têm sido utilizados para a colheita da pele do doador em roedores7,8. Foram relatadas diferentes técnicas de fixação e estabilização do enxerto, incluindo uma "técnica de sutura"9,suturas7 e cola cirúrgica10,,11,12.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de uma ferida de queimadura de espessura total que recapitulasse a abordagem padrão-ouro atual no tratamento de queimaduras, que envolve excisão tecidual inviável e enxerto de pele. Uma queimadura térmica foi induzida na superfície dorsum de um rato usando um modelo de latão pré-aquecido. Burn eschar foi extirpado e substituído por um enxerto de espessura total colhido da cauda de um rato doador. Há três vantagens fundamentais para este modelo experimental. Primeiro, mais de uma ferida de queimadura pode ser induzida na parte de trás do rato receptor, e quatro enxertos de pele doadores podem ser colhidos de uma única cauda do rato doador. Isso significa que vários tratamentos experimentais e de controle podem potencialmente ser comparados usando o mesmo receptor e animais doadores. Dependendo da rota desejada de administração, o tratamento de controle pode incluir administração local ou sistêmica do controle do veículo ou placebo (por exemplo, aplicação tópica de pomada, subcutânea, injeção intraperitoneal ou intravenosa de solução). Segundo, o tempo do tratamento e o ponto final do experimento podem ser controlados. Em terceiro lugar, este modelo depende da reconstrução de feridas utilizando enxertos de espessura total colhidos da cauda, que são conhecidos por terem maior probabilidade de incorporação bem sucedida no local do doador em comparação com a pele colhida na parte de trás13. Isso pode ser devido ao menor número de células langerhans epidérmicas, que desempenham um papel fundamental na imunobiologia cutânea, e estão associadas à rejeição do enxerto de pele14.
O modelo proposto de cura de feridas e integração de enxertos pode muito bem ser aplicado a camundongos transgênicos e eliminatórios. O uso de camundongos geneticamente modificados ajudará a elucidar os papéis que certos genes podem desempenhar durante o reparo da ferida. Também pode ser considerada a aplicação exógena de preparações de feridas tópicas ou administração subcutânea de anticorpos terapêuticos no local da lesão.
Devido a dificuldades técnicas, enxertos de pele de espessura dividida constituídas pela epiderme e parte da derme são difíceis de obter em camundongos. Enxertos de pele de espessura total constituídos pela epiderme e derme de espessura total são conhecidos por exigir um leito de ferida bem vascularizado para uma integração bem sucedida. A incapacidade de colher enxertos de pele de espessura dividida em camundongos pode ser considerada como uma limitação deste modelo. A fixação do enxerto de pele no leito da ferida receptora foi obtida através da aplicação da cola adesiva cirúrgica, que está associada a menos trauma e degradação rápida em comparação com outros meios de fixação tecidual15. Estudos anteriores mostraram que a sutura está associada a uma fixação tecidual mais forte do que a cola cirúrgica às 24h após o procedimento cirúrgico15, o que pode ser considerado como desvantagem do procedimento. No entanto, em momentos posteriores, a força biomecânica das feridas tratadas com um adesivo cirúrgico torna-se comparável às suturas15 e melhor do que a fixação do grampo16. Após a fixação tecidual com a cola cirúrgica, as feridas devem ser cobertas com um curativo da ferida. Embora as feridas na superfície dorsal do camundongo sejam difíceis de alcançar o animal, o curativo da ferida, por outro lado, é fácil para o animal manipular e remover. Alterações frequentes de curativos podem ser justificadas.
Hipotermia induzida pela anestesia em pequenos roedores é um fenômeno bem documentado17. A hipotermia é um efeito colateral desse procedimento, que causa complicações, e potencialmente compromete a saúde animal e a qualidade dos dados. Portanto, este método garante a implementação de estratégias de gestão de temperatura, especialmente se forem utilizadas skh1-hrhr sem cabelo.
A limitação mais significativa do uso de camundongos para imitar o fechamento de feridas humanas é a diferença entre a anatomia da pele e a fisiologia. As feridas do rato curam principalmente por contração, enquanto as feridas humanas cicatrizam através da formação de tecido de granulação e re-epitelialização18. Para explicar essa discrepância, o modelo atual pode ser modificado e usado em combinação com um anel de tala firmemente aderido ao redor da ferida para evitar a contração da pele19. Dadas algumas vantagens e desvantagens desse protocolo in vivo, esse modelo poderia servir como uma ferramenta para estudar certos processos envolvidos na cicatrização de feridas que são impossíveis de estudar in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringue</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS + 01T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>NN-2613R</td>
			<td>1/2&#39;&#39; - 0,45 X 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96X21 mm Petri Dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing scale</td>
			<td>Kern</td>
			<td>EMB 5.2K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mouse</td>
			<td>Janvier labs</td>
			<td>BALB/cAnNRj</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M476-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond polymer Refine Red</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass block</td>
			<td>BVG</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Circular 10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (BUPRECARE)</td>
			<td>Axience</td>
			<td>FR/V/6328396 3/2011</td>
			<td>administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burning apparatus Kausistar 400</td>
			<td>Tra&#231;aMatrix</td>
			<td>34010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaseViewer</td>
			<td>3DHISTECH Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>3Dhistech, Budapest, Hungary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Recommanded concentration 1:50; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)- glucose (Dextrose)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-8769-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>D3400</td>
			<td>objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpels</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P04-36300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23750</td>
			<td>Recommanded dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22um</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Petelevage</td>
			<td>120070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Piramal healthcare</td>
			<td>FR/V/03248850/2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Imalgene</td>
			<td>FR/V/0167433 4/1992</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringers solution</td>
			<td>Flee-Flex</td>
			<td>1506443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamina multilabel slide scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>version 2.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Bond III</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>1757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukosilk dressing</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>72669-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>N01BB02</td>
			<td>local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 &#956;g/ g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Kern</td>
			<td>HDB-5K5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson Trichrome Staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromesh Biopsy cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DM500</td>
			<td>Scanner 8000Hz NDD PMT detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non adhering dressing Adaptic</td>
			<td>Systagenix</td>
			<td>A6222</td>
			<td>12.7cm X 22.9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocrygel</td>
			<td>Tvm France</td>
			<td>###</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paracetamol 300mg</td>
			<td>Dolliprane</td>
			<td>Liquiz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde 4%</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>1169945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>MEDA pharma</td>
			<td>D08AG02</td>
			<td>diluted to 1:2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKH1-Hrhr mouse</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>686SKH1-HR</td>
			<td>6-weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>AGAA000080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical adhesive</td>
			<td>BSN medical</td>
			<td>9927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>418545/9</td>
			<td>10 X 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Versylene Fresenius</td>
			<td>B230521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>2775161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ChameleonUltra</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>DS 16-02-16 F</td>
			<td>690-1040 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal imaging Camera</td>
			<td>Testo</td>
			<td>Testo 868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompum 2%)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>FR/V/ 8146715 2/1980</td>
			<td>surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of a burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft

Feridas superficiais triviais curam sem complicações por intenção primária. Feridas profundas, como queimaduras de espessura total, cicatrizam por intenção secundária e requerem desbridamento cirúrgico e enxerto de pele. A integração bem sucedida do enxerto de doador em um leito de ferida do receptor depende do recrutamento oportuno de células imunes, resposta angiogênica robusta e nova formação de matriz extracelular. O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, que visam alguns processos-chave envolvidos na cicatrização de feridas, são dificultados pela falta de modelos pré-clínicos confiáveis com avaliação objetiva otimizada do fechamento da ferida. Aqui, descrevemos um modelo barato e reprodutível de ferida experimental de queimadura de espessura total reconstruída com um enxerto de pele aogenérica. A ferida é induzida na superfície dorsum de camundongos do tipo selvagem de raça anesthetizada dos fundos BALB/C e SKH1-Hrhr. A queimadura é produzida usando um modelo de latão medindo 10 mm de diâmetro, que é pré-aquecido a 80 °C e entregue a uma pressão constante para 20 s. Burn eschar é extirpado 24 horas após a lesão e substituído por um enxerto de espessura total colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante. Não é necessário equipamento especializado para o procedimento e as técnicas cirúrgicas são simples de seguir. O método pode ser implementado sem esforço e reproduzido na maioria dos ambientes de pesquisa. Certas limitações estão associadas ao modelo. Devido a dificuldades técnicas, a colheita de enxertos de pele de espessura dividida mais fina não é possível. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a reconstrução de feridas de queimadura usando enxertos de pele de espessura total. Pode ser usado para realizar testes terapêuticos pré-clínicos.

Os resultados demonstram que o protocolo desenvolvido é um método simples, que permite a indução de uma ferida de queimadura de espessura total em camundongos. Queimaduras são induzidas usando um modelo de latão pré-aquecido(Figura 1A-C). A área queimada aparece como uma ferida circular com um eschar branco e uma zona hiperêmica. O tamanho da ferida queimada é ligeiramente maior às 24 horas após a lesão da queimadura como resultado do fenômeno bem descrito conhecido como progressão da lesão por queimadura, que possivelmente é devido à inflamação aguda22. Após a excisão, as feridas de queimadura são reconstruídas por meio de enxerto de pele aogenérica(Figura 3). No dia 7, após a lesão da queimadura, as feridas passam a ser vascularizadas5, o que é uma indicação de enxerto bem sucedido. Os queratinócitos epidérmicos migram da pele receptora adjacente no esforço de fechar a ferida e fazer a ponte entre as duas bordas das feridas. A análise microscópica das feridas manchadas de H e E revelou que o comprimento da neo-epiderme torna-se significativamente maior no dia 7 após lesão por queimadura em comparação com o dia 3 após lesão por queimadura(Figura 4B). Antes de realizar um grande estudo, é altamente recomendável que os pesquisadores completem um estudo piloto, que possibilite a exploração de uma nova intervenção, avaliação de viabilidade, identificação de modificações no método para garantir a reprodutibilidade. Efeitos estatisticamente significativos são difíceis de detectar em amostras menores, enquanto o aumento do tamanho da amostra é uma maneira de aumentar o poder estatístico de um teste. Por exemplo, para detectar uma diferença estatisticamente significante (p < 0,05) na taxa de re-epitelialização da ferida(Figura 4) entre os grupos, o tamanho da amostra deve ser entre seis e oito camundongos por grupo. Todos os experimentos devem ser repetidos pelo menos duas vezes. À medida que as células produtoras de matriz, como os fibroblastos, migram do tecido receptor para o enxerto, componentes-chave da matriz extracelular, incluindo colágeno I e fibronectina tornam-se altamente expressos na matriz recém-formada(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg"> Figura 1: Configuração do dispositivo em chamas. (A) Colocação e configuração do dispositivo de queima. O dispositivo de queima é conectado ao controlador de temperatura e é anexado ao monômetro digital para permitir o monitoramento da pressão. O dispositivo de queima é suspenso acima de um estágio ajustável – superfície plana sobre a qual os ratos são colocados para a indução de queimadura. (B-C) Uma imagem de perto do modelo de latão usado para induzir queimaduras de ferida. (C) O diâmetro do modelo de latão é de 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração esquemática das diferentes etapas necessárias para reproduzir o modelo experimental descrito neste artigo. Existem três etapas principais para o procedimento: (i) indução da ferida de queimadura usando um modelo de latão pré-aquecido; (ii) excisão cirúrgica do tecido necrosado não viável às 24 horas após a lesão da queimadura; (iii) reconstrução da ferida cirúrgica utilizando um enxerto de pele aogenógena de espessura total colhido de um rato doador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg"> Figura 3: A visão macroscópica das feridas de queimaduras reconstruídas do rato. Imagens digitais representativas de queimaduras reconstruídas com enxertos de pele aogenógenos nos dias 0, 1, 3 e 7 após queimaduras. A régua nas imagens está em milímetros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg"> Figura 4: Aparecimento microscópico de feridas aos 3 e 7 dias após lesão por queimadura. Seções manchadas de H&E de feridas 3 e 7 dias após ferimentos de queimadura. O comprimento da neo-epiderme (linha pontilhada) é significativamente aumentado em (A) dia 3 feridas em comparação com(B) dia 7 feridas. Em (A) e (B), a barra de escala é de 100 μm. (C) Representação gráfica da porcentagem de re-epitelialização da ferida. Este foi avaliado medindo o comprimento da neo-epiderme nos dias 3 e 7 lesões pós-queimadura e expressas como uma porcentagem de todo o comprimento da ferida. Os resultados representam média ± S.E.M. (n = 6 camundongos no grupo dia 3; n = 6 camundongos no grupo do dia 7, *p < 0,05; Teste t do aluno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg"> Figura 5: Avaliação da matriz extracelular e visualização do colágeno I. Imagens representativas da análise imunohistoquímica no dia 7 feridas de camundongos manchadas para (A) colágeno e (B) fibronectina. Note uma mancha vermelha intensa em células de colágeno em forma de fuso alongado. Note manchas marrons em células fibronectina-positivas na derme do dia 7 feridas. Barra de escala = 50 μm em todas as imagens. Em (A) e (B), e denota epiderme e d denota derme. (C) Visualização de fibras de colágeno e avaliação histológica da deposição de colágeno. (D) Imagem representativa do colágeno TPEF/SHG das feridas do rato do dia 7. A aquisição simultânea de TPEF/SHG utilizando polarização circular e sinais SHG foram seletivamente processados para obter uma distribuição binária de SHG após a aplicação de um limiar. As imagens TPEF (verde) e SHG (branca) eram pseudocoloridas e sobrepostas. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de cicatrização de feridas queimadas. Uma queimadura térmica foi induzida na pele dorsal de camundongos usando um modelo de latão pré-aquecido. Tecido queimado foi desbridado e sobreposto com um enxerto de pele colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo de murina reprodutível de ferida de queimadura de espessura total reconstruída com um enxerto de pele alérgica. A pele é dividida em dois componentes, a epiderme e a derme. Abaixo da dermis está a gordura subcutânea, que cobre osso, tendão ou fáscia.A classificação de espessura da lesão por queimadura é frequentemente usada para definir a extensão da profundidade da lesão por queimadura. Queimaduras superficiais envolvem apenas epiderme, queimaduras de espessura parcial superficial envolvem epiderme e apenas pelourinho ou derme superior. Queimaduras de espessura parcial dérmica profunda envolvem epiderme e derme, a derme reticular contendo vasos sanguíneos, folículos capilares, óleo e glândulas sudoríparas.Queimaduras de espessura total são caracterizadas pelo evidente envolvimento de toda a espessura da pele e possivelmente tecido subcutâneo. Este tipo de ferida só pode curar por contração ou com enxerto de pele. O objetivo geral deste procedimento foi criar uma ferida de queimadura de espessura total e reconstruída com um enxerto de pele de espessura total.Isso foi conseguido colocando um bloco de latão circular pré-aquecido a 80 graus Celsius e aplicado na pele da boca durante a duração de 20 segundos. O tecido necrosado foi cirurgicamente extirpado 24 horas após a lesão da queimadura. Enxertos de pele de espessura total colhidos da cauda de um rato doador foram colocados sobre as queimaduras excisadas.Os enxertos serão então protegidos com um adesivo cirúrgico. Tanto os animais doadores quanto os receptores vêm da mesma variedade de camundongos. Camundongos biópsia são usados durante o estudo.No entanto, também pode ser usada uma variedade de camundongos. Isso inclui camundongos imunocompetuntes sem pelos, que são particularmente úteis em estudos de cicatrização de feridas. Como depilação e inflamação associada, um mendigo fez e o recrescimento capilar não interfere na análise digital da imagem, quando as medidas da área e outros tipos de avaliação de feridas microscópicas.Isso é especialmente verdade em modelos de infecção, onde nossa suspensão de biorganismo e bactérias é aplicada a este seu rosto da ferida e sinal de biorganismo é medido para indicar a taxa de crescimento bacteriano. O dispositivo de lesão térmica consiste em um bloco de latão circular feito sob medida medindo 10 milímetros de diâmetro pré-aquecido a 80 graus Celsius. A temperatura do bloco de latão é verificada usando uma câmera de imagem térmica infravermelha.Para criar uma ferida de queimadura de espessura total, o bloco de latão é aplicado por 20 segundos usando uma pressão constante de 0,15 Newtons que é monitorada por manômetro digital. A analgesia multimodal é a melhor prática para o manejo da dor em procedimentos invasivos de pesquisa animal. O regime de administração ideal da analgesia inclui administração analgésica preventiva ou preventiva.O paracetamol a três miligramas por refeição foi adicionado à água potável e fornecido 12 horas antes e por 72 horas após o procedimento. Buprenorfina a 0,05 microgramas por grama foi administrada subcutâneamente 30 minutos antes do procedimento e a cada seis horas para as primeiras 72 horas após o procedimento. A lidocaína a cinco miligramas por quilograma foi administrada subcutâneamente ao redor do dormente de cada rato 15 minutos antes do procedimento, um volume total de 200 microliters da Solução de Ringers Lactated a 5%dextrose foi injetado subcutâneamente antes do procedimento, e seis horas após o procedimento para evitar a desidratação.Os camundongos eram nisertida usando uma injeção intraperitoneal de Xylazine a 10 miligramas por quilograma, e cetamina a 100 miligramas por quilograma. A profundidade anestésico pode ser avaliada através de uma pitada de dedo do dedo do sol. A anestesia aboli o reflexo pisca-pisca, impedindo o refresco da película lacrimal necessária para a manutenção da hidratação córnea e o olho continuamente exposto ao ar rapidamente fica desidratado, um lubrificante foi aplicado nos olhos para manter a hidratação da córnea.O dorso de cada rato é cortado e creme de depilação é aplicado por um minuto para remover o cabelo. O animal nisertídeo é posicionado propenso a uma mesa plana e a queimadura térmica é criada aplicando um bloco de latão circular pré-aquecido a 80 graus Celsius durante a duração de 20 segundos. O rato é colocado de volta na almofada de aquecimento para mantê-lo aquecido e prevenir hipotermia, um efeito colateral frequente dos agentes anestésicos.Uma vez recuperado da anestesia, o rato pode ser colocado em uma gaiola individual. 24 horas após a indução da queimadura. Tecido necrosado é cirurgicamente excita.Quatro enxertos de pele doentes são colhidos da cauda do rato doador de eutanásia. Embora outro lado, então há sob cauda também pode estar usando o modelo do mouse. Assim, o grau de resposta humana pode variar dependendo da origem do enxerto de pele do doador.Por exemplo, a pele do ouvido e das costas não têm mais em vendas em comparação com a pele da cauda e provocam uma resposta humana mais robusta, o que pode levar à rejeição do enxerto. A espessura dos enxertos de pele também pode ser levada em conta, pois pode desempenhar um fator determinante no enxerto bem sucedido da tomada de enxerto de pele. Pele segura como a da parte de trás tem maior probabilidade de falha devido às maiores demandas metabólicas do tecido.Consequentemente, o sucesso relatado do enxerto de enxerto de enxerto de pele alergênica para a pele traseira é menor do que o sucesso relatado para o enxerto de pele da cauda. A anestesia foi induzida pela inalação de 5% isoflurane em 100% oxigênio a uma vazão de quatro litros por minuto, seguida pela manutenção da anestesia utilizando 2% Isoflurane a dois litros por minuto para a manutenção durante a cirurgia. A buprenorfina foi administrada no início do procedimento para fornecer analgesia pós-operatória.As queimaduras foram preparadas com povidone-iodo, seguidas por 70% de álcool. Queimadura necrosada é extirpada com tesoura para remover o defeito circular de espessura total da pele, a camada panniculus carnosus da hipoderme é removida para criar um leito receptor de enxerto de pele estável alguns autores sugerem preservar a camada panniculus carnosus da hipoderme, pois acredita-se ser necessário para a revascularização do enxerto. No entanto, neste caso, a mobilidade dessa camada e as forças potenciais resultantes de tesoura entre o enxerto e o leito receptor podem se tornar problemáticas.A remoção da camada panniculus carnosus não impactou negativamente o sucesso do procedimento de enxerto. Enxertos de espessura total são colhidos da cauda do rato doador eutanizado. A cauda é incisada longitudinalmente, permitindo que a pele seja separada do tecido mole subjacente.A pele da cauda é então espalhada em uma placa de Petri cheia de salina estéril e normal e cortada em manchas circulares usando uma régua. Os enxertos são então transferidos para uma placa de Petri com uma gaze estéril encharcada em soro fisiológico normal e mantiveram os quatro graus até estarem prontos para serem enxertados. Os enxertos são então fixados no leito receptor com cola cirúrgica.As lacunas entre enxerto de pele doador e cama de ferida receptora são suavemente pressionadas para alinhar as bordas da pele. As feridas estão vestidas dentro de gaze de parafina inerte e curativo secundário adesivo. Fotografias digitais, de feridas enxertadas foram tiradas em um, três e sete dias após ferimentos de queimadura.Na autópsia, as queimaduras dorsais foram cirurgicamente excisadas à fáscia, as feridas foram bisseccionadas com metade fixada em formalina 10% tamponada, e processadas para histologia e imunismquímica. Enxertos de pele fornecem um sistema de andaimes para migração celular. A integração bem-sucedida do enxerto depende de fibroblastos eficientes e migração de queratinócitos da oferta de receptor para o enxerto doador que é lentamente degradado e substituído por células capazes de produzir a matriz extracelular.A seção histológica das feridas em massa foi submetida à hematoxilina e à coloração de eosina. Imagens representativas de hematoxilina e eosina manchadas de feridas, mostraram que o comprimento da epiderme próxima destacada em amarelo é significativamente aumentado no sétimo dia, em comparação com o terceiro dia após a lesão por queimadura. Para estimar a taxa de re-epitelização, a área da ferida coberta com epiderme próxima foi expressa em percentagem de toda a ferida.A matriz extracelular é o componente não celular da pele, que fornece andaimes para os componentes celulares. A matriz extracelular é composta de proteínas fibrosas, como colágeno e fibronectina. Essas moléculas aumentam a maturidade das feridas e mantêm a integridade estrutural da imunohistoquímica semiquantitativa da pele para o tipo um de colágeno, e manchas histológicas como o tricromo de Mason podem ser usadas para auxiliar a integridade da matriz extracelular a partir do micrografo fotográfico.Métodos mais sofisticados, como a microscopia de segunda geração harmônica, surgiram como uma poderosa ferramenta para análise quantitativa da estrutura do colágeno. O enxerto de pele de Murine fornece um excelente modelo pré-clínico potencial para investigar a integração de gráficos no lado receptor. Este estudo demonstra um método confiável para realizar com sucesso enxertos de pele em um modelo de camundongo, bem como a avaliação histológica das feridas curativas.

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