Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af det amerikanske forsvarsministerium gennem Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) under kontrakt W81XWH-17-1-0085, og National Institute of Health R03 EB025903-1. AV blev finansieret af College of Engineering Dean's Fellowship på Northeastern University.

Der blev opnået universitetsgodkendelser for at udføre forsøgene med døde væv. Kvægled blev erhvervet kommercielt fra et slagteri.
1. Brusk explant udvinding
<ol><li>Ved hjælp af en skalpel (#10 klinge), skære og fjerne fedt, muskler, ledbånd, sener og alle andre bindevæv til at udsætte brusk fra femoropatellar rille af kvæg knæled.</li>
	<li>Brug 3 mm og 6 mm dermale slag, gøre vinkelrette slag i brusk til at udtrække cylindriske stik. Stik i individuelle brønde på en 48-br...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease.">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li><li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+osteoarthritis.">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+articular+cartilage:+Structure,+composition,+and+function.">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee:+A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li><li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+intra-articular+therapy.">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li><li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs.">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage.">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li><li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term.">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery.">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882 (2020).</li><li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention.">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis.">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li><li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

De metoder og protokoller, der er beskrevet her, er vigtige for området målrettet lægemiddellevering til negativt ladede væv. På grund af den høje tæthed af negativt ladede aggrecans til stede i disse væv, en barriere er skabt, hvilket forhindrer lægemidler i at nå deres cellulære mål websteder, der ligger dybt inde i matrix. For at løse denne udestående udfordring kan narkotika ændres til at omfatte positivt ladede narkotikabærere, som kan øge transportraten, optagelsen og bindingen af lægemidler i<sup...

Drug-levering til negativt ladede væv i kroppen er fortsat en udfordring på grund af den manglende evne til lægemidler til at trænge dybt ind i vævet for at nå celle og matrix mål steder1. Flere af disse væv består af tætpakkede, negativt ladede aggrecaner, som skaber en høj negativ fast ladningstæthed (FCD)2 i vævet og fungerer som en barriere for levering af de fleste makromolekyler3,4. Men med bistand fra positivt ladede stof luftfartsselskaber, denne negativt ladede væv barriere kan faktisk omdannes til et lægemiddel depot via elektrostatiske afgift interaktioner for vedvarende lægemiddellevering1,,5,6,7( Figur1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Figur 1: Opladningsbaseret intrabrusklevering af CPC'er. Intra-led injektion af CPC'er i knæleddet rummet. Elektrostatiske interaktioner mellem positivt ladede CPC'er og negativt ladede aggrecangrupper muliggør hurtig og fuld dybdeindtrængning gennem brusk. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For nylig, kort længde kationiske peptid luftfartsselskaber (CPC) blev designet med det formål at skabe små kationiske domæner i stand til at bære større størrelse terapeutiske til levering til negativt ladede brusk4. For effektiv lægemiddellevering til brusk til behandling afudbredte 8,9 og degenerative sygdomme som slidgigt (OA) 10 , er detafgørende,at terapeutiske koncentrationer af lægemidler trænge dybt ind i vævet, hvor størstedelen af bruskceller (chondrocytter) ligger11. Selv om der er flere potentielle sygdom ændre lægemidler til rådighed, ingen har fået FDA godkendelse, fordi disse ikke er i stand til effektivt at målrette brusk12,,13. Derfor er det nødvendigt at evaluere transportegenskaberne for narkotikabærere for at forudsige lægemidlers effektivitet ved at fremkalde et terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter, der kan udnyttes til at vurdere ligevægtsoptagelsen, penetrationsdybden og ikke-ligevægtsdiffusionshastigheden for CPC4.
For at sikre, at der er en tilstrækkelig lægemiddelkoncentration i brusken, som kan give et optimalt terapeutisk respons, blev optagelsesforsøg designet til at kvantificere ligevægts-CPC-koncentrationen i brusk4. I dette design, efter en ligevægt mellem brusk og dens omgivende bad, kan den samlede mængde af opløst inde i brusk (enten bundet til matrix eller gratis) bestemmes ved hjælp af en optagelse forhold. Dette forhold beregnes ved at normalisere koncentrationen af opløselighed inde i brusk til ligevægtsbadet. I princippet ville neutrale opløste stoffer, hvis diffusion gennem brusk ikke understøttes af afgiftsinteraktioner, have et optagelsesforhold på mindre end 1. Omvendt viser kationiske opløseligheder, hvis transport forstærkes via elektrostatiske interaktioner, et optagelsesforhold, der er større end 1. Som vist med CPC'er kan brugen af en optimal positiv ladning imidlertid resultere i meget højere optagelsesforhold (større end 300)4.
Selv om høj lægemiddelkoncentration i brusk er vigtigt for at opnå terapeutisk fordel, Er det også afgørende, at lægemidler diffuse gennem den fulde tykkelse af brusk. Derfor, undersøgelser, der viser dybden af penetration er nødvendig for at sikre, at narkotika nå dybt inde i brusk, således at matrix og cellulære mål websteder kan nås, hvilket giver en mere effektiv behandling. Dette eksperiment var designet til at vurdere envejsdiffusion af opløseligheder gennem brusk, der simulerer spredning af narkotika i brusk efter intra-artikulær injektion i vivo. Fluorescens billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for evaluering af dybden af indtrængning i brusk. Net partikel afgift spiller en central rolle i modererende hvordan dybe lægemidler kan diffuse gennem matrix. En optimal nettoladning baseret på et væv FCD er nødvendig for at give mulighed for svag reversibel bindende interaktioner mellem kationiske partikler og anioniske væv matrix. Dette indebærer, at enhver interaktion er svag nok, så partikler kan adskille sig fra matrixen, men vendbar i naturen, så den kan binde sig til et andet matrixbindingssted dybere inde i vævet4. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning af en partikel være skadelig over for diffusion, da for stærk matrixbinding forhindrer løsrivelse af partikler fra det oprindelige bindingssted i den overfladiske bruskzone. Dette ville resultere i en utilstrækkelig biologisk respons , da de fleste af målpladserne ligger dybt inde i vævet11.
For yderligere at kvantificere styrken af de bindende interaktioner, analyse af narkotika diffusion satser gennem brusk er fordelagtig. Ikke-ligevægtsdiffusionsundersøgelser giver mulighed for at sammenligne diffusionsrater i realtid mellem forskellige opløste stoffer. Som narkotika diffuse gennem de overfladiske, midterste og dybe zoner af brusk, tilstedeværelsen af bindende interaktioner kan i høj grad ændre diffusion satser. Når der er bindende interaktioner mellem lægemidler og bruskmatrixen, defineres det som den effektive diffusivitet (DEFF). I dette tilfælde, når alle bindingssteder er blevet besat, er udbredelsen af narkotika styret af steady-state diffusion (DSS). Sammenligning mellem DEFF af forskellige opløste bestemmer den relative bindende styrke af opløselige stoffer med matrix. For en given opløst, hvis DEFF og DSS er inden for samme størrelsesorden, indebærer det, at der er minimal binding til stede mellem lægemidlet og matrix under diffusion. Men hvis DEFF er større end DSS, findes der en betydelig binding af partikler til matrix.
De designede eksperimenter individuelt giver mulighed for karakterisering af opløst transport gennem brusk, men en holistisk analyse inklusive alle resultater er nødvendig for at designe en optimalt ladet stof luftfartsselskab. Den svage og reversibel karakter af ladning interaktioner styrer partikel diffusion sats og giver mulighed for høj ligevægt optagelse og hurtig fuld dybde penetration gennem brusk. Gennem ligevægt optagelse eksperimenter, bør vi kigge efter bærere, der viser høj optagelse som følge af afgift interaktioner, som kan verificeres ved hjælp af ikke-ligevægt diffusion sats undersøgelser. Disse bindende interaktioner bør dog være svage og reversible for at give mulighed for fuld tykkelsesindtrængning af opløstet gennem brusk. En ideel stof luftfartsselskab ville have en optimal ladning, som gør det muligt stærk nok bindende for optagelse og høj intra-brusk stof koncentrationer, men ikke for stærk til at hindre fuld tykkelse diffusion4. De præsenterede forsøg vil hjælpe med design karakteristika for charge-baserede væv rettet mod narkotika bærere. Disse protokoller blev brugt til at karakterisere CPC transport gennem brusk4, men disse kan også anvendes på en række lægemidler og narkotika luftfartsselskaber gennem brusk og andre negativt ladede væv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

Flere negativt ladede væv i kroppen, ligesom brusk, udgør en barriere for den målrettede lægemiddellevering på grund af deres høje tæthed af negativt ladede aggrecaner og kræver derfor forbedrede målretningsmetoder for at øge deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høj negativ fast opladning tæthed, narkotika kan ændres med positivt ladede stof luftfartsselskaber til at drage fordel af elektrostatiske interaktioner, giver mulighed for øget intra-brusk narkotika transport. Undersøgelse af transport af narkotika bærere er derfor afgørende for at forudsige effekten af narkotika i at fremkalde en biologisk reaktion. Vi viser udformningen af tre eksperimenter, som kan kvantificere ligevægt optagelse, dybde penetration og ikke-ligevægt diffusion sats af kationiske peptid luftfartsselskaber i brusk explants. Ligevægt optagelse eksperimenter giver et mål for den opløste koncentration i brusk i forhold til dens omgivende bad, som er nyttigt for at forudsige potentialet i et lægemiddel luftfartsselskab i at øge terapeutisk koncentration af lægemidler i brusk. Dybden af penetrationsundersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for visuel repræsentation af 1D-opløst diffusion fra den overfladiske til dybe zone af brusk, hvilket er vigtigt for vurderingen af, om opløselser når deres matrix og cellulære målsteder. Ikke-ligevægtsspiffusionsrate undersøgelser ved hjælp af et specialdesignet transportkammer gør det muligt at måle styrken af bindende interaktioner med vævsmatrixen ved at karakterisere diffusionsraterne for fluorescerende mærkede opløste stoffer på tværs af vævet; dette er gavnligt for at designe bærere af optimal bindingsstyrke med brusk. Tilsammen giver resultaterne fra de tre transporteksperimenter en retningslinje for design af optimalt ladede lægemiddelbærere, som udnytter svage og reversible afgiftsinteraktioner for anvendelser af lægemiddellevering. Disse eksperimentelle metoder kan også anvendes til at evaluere transport af narkotika og narkotika-narkotika luftfartsselskab konjugates. Yderligere, disse metoder kan tilpasses til brug i målretning andre negativt ladede væv såsom menisk, hornhinden og glasagtig humor.

Efter ligevægtabsorption af CPC'er ved brusk falder badets fluorescens, når opløsten er blevet taget af vævet. Men hvis fluorescensværdien af det endelige bad forbliver magen til den oprindelige, indikerer det, at der ikke er nogen / minimal opløst optagelse. En anden bekræftelse af opløst optagelse er, hvis vævet synligt har ændret farve til farven på fluorescerende farvestof. Den kvantitative optagelse af opløseligheder i brusk blev bestemt ved hjælp af optagelsesforholdet (RU), efter at fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Denne protokol bestemmer ligevægtsoptagelse, indtrængningsdybde og ikke-ligevægtsdiffusionshastighed for kationiske peptidbærere i brusk. Karakterisering af transportegenskaber er afgørende for at sikre en effektiv biologisk reaktion. Disse metoder kan anvendes til at designe en optimalt ladet stof bærere til målretning negativt ladede væv.

Karakterisering af intra-brusk Transport Egenskaber kationiske peptid luftfartsselskaber

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Det er afgørende at karakterisere terapeutiske transportformers og transportørers transportegenskaber for at sikre effektive biologiske reaktioner. Disse metoder støtte i udformningen optimalt ladede stof luftfartsselskaber til målretning negativt ladede væv. Den største fordel ved disse teknikker er deres evne til bedre at forudsige in vivo terapeutiske effektivitet gennem en række in vitro eksperimenter, der karakteriserer opløst transport gennem væv.Brusk sygdomme, såsom slidgigt, forbliver ubehandlet på grund af manglende evne til narkotika til at trænge ind i den tætte avaskulær brusk matrix, der kræver narkotika bærere til prolog terapeutisk effekt. Begynd med at bruge en delikat opgave tørre til forsigtigt at fjerne overskydende PBS fra overfladerne på tre millimeter diameter, en millimeter tyk brusk explants. Brug en balance til hurtigt at registrere den våde vægt af hver explant og straks placere explants i en PBS bad for at forhindre dehydrering.Dernæst tilsættes 300 mikroliter frisklavet, 30 mikromolar fluorescerende mærket kationiske peptid luftfartsselskab løsning pr brønd til de indre brønde i en 96-brønd plade og bruge en spatel til at tilføje en explant til hver brønd af opløsning. Fyld hver af de omkringliggende brønde med 300 mikroliter AF PBS og dæk pladen med et låg. Luk pladens kanter med fleksibel film for at minimere fordampning og læg pladen på en shaker i en 37 grader Celsius inkubator i 24 timer ved 50 omdrejninger i minuttet med en 15 millimeter bane.Ved inkubationens afslutning overføres ligevægtsbadet fra hvert brøndsål til individuelle polypropylenrør, og der foretages serielle fortyndinger fra lageret 30 mikromolar kationiske peptidbæreropløsning for at generere en standardkurve. Overfør derefter 200 mikroliter af hver opløsning og standard til individuelle brønde af en sort 96-brøndplade, og der opnås lysstofaflæsninger af hver prøve og standard baseret på ekscitations- og emissionsbølgelængderne på fluorescerende etiketten. For at bestemme dybden af kationiske peptid luftfartsselskab penetration inden for en brusk explant, bruge en skalpel til at skære seks millimeter diameter, en millimeter tyk brusk explants i halve og fugte den resulterende halv-disc stykker med proteus hæmmer suppleret PBS.Påfør epoxy til midten af en brønd af en specialdesignet endimensional transport kammer og sikre en halv-disk explant i brønden med den overfladiske side af explant vender opstrøms side af kammeret. Fjern eventuel overskydende lim fra brønden for at forhindre kontakt med bruskens diffusionsoverfladeareal og tilsæt 80 mikroliter proteasehæmmer suppleret PBS på begge sider af explanten. Pipette væsken op og ned på den ene side af explant at kontrollere for lækage til den anden side.Hvis der ikke er nogen lækage, skal proteasehæmmeren udskiftes fra upstreamsiden med 80 mikroliter af 30 mikromolarfluorescensmærket kationisk peptidbæreropløsning, og transportkammeret skal forsigtigt sættes i en cellekulturskål. Dæk bunden af skålen med PBS for at undgå kationisk peptid luftfartsselskab løsning fordampning. Pas på, at der ikke er nogen direkte kontakt mellem løsningerne fra opstrøms- og nedstrømskamrene.Placer den overdækkede skål på en shaker for at begrænse partikelsedimentation i fire eller 24 timer ved stuetemperatur og 50 omdrejninger i minuttet med en 15 millimeter bane. I slutningen af inkubationen, fjerne explants fra kammeret og skære ca 100 mikron tykke skiver fra midten af hver explant. Placer hver skive explant mellem et glas dias og et dæksel slip og fugte skiver med frisk protease hæmmer suppleret PBS.Fastgør diaset på scenen af et konfokalt mikroskop, og få en Z-stak lysstofrør gennem skivens fulde tykkelse ved 10X forstørrelse. Åbn billedfilen og billedet J, klik på Billede, og vælg Stakke og Z Project i rullemenuen. Indtast derefter udsnitstallene fra et til det sidste udsnit, og vælg gennemsnitlig intensitet under Projektionstype, og klik på Okay.For at vurdere den ikke-ligevægt kationiske peptid luftfartsselskab brusk diffusion sats, samle hver halvdel af transportkammeret, til at omfatte en stor gummipakning, en polymethylmethacrylat indsætte, og en lille gummipakning. Mål tykkelsen af en brusk explant, derefter placere explant i brønde af plast indsats med den overfladiske overflade vender opstrøms kammer og sandwich de to halvdele sammen for at fuldføre samlingen. Brug en skruenøgle til stramt skrue halvdele sammen, før du fylder opstrøms kammer med to milliliter protease hæmmer suppleret PBS.Kontroller nedstrømskammeret for lækage fra opstrømskammeret. Hvis der ikke opdages lækage, fyldes nedstrømskammeret med to milliliter proteasehæmmer suppleret PBS. Tilføj en enkelt mini røre bar til både op og nedstrøms kamre og placere kammeret på en røre plade med kammeret justeret således, at laseren fra spektrofotometeret er fokuseret mod midten af nedstrøms kammer.Med signalmodtageren del af spektrofotometeret bag nedstrøms kammer, indsamle stabile, realtime downstream fluorescens emissionsaflæsninger i mindst fem minutter. Efter at have fået en stabil aflæsning, tilsættes en forudberegnet volumen af fluorescerende mærket kationiske peptid luftfartsselskab løsning til opstrøms kammer til en endelig bad koncentration af tre mikromolar, og overvåge downstream fluorescerende signal, samtidig med at den opløste transport til at nå en støt stigning i hældningen. Når en stabil tilstand er nået, overføres 20 mikroliter opløsning fra opstrømskammeret til nedstrømskammeret for at få en spiketest, og realtidsinstreaminfluorescensaflæsningerne indsamles.For høj en positiv ladning vil begrænse opløst penetration til den overfladiske zone, da luftfartsselskabet binder for kraftigt til de negativt ladede aggrecan grupper af brusk matrix. Omvendt, luftfartsselskaber, der er i stand til at drage fordel af svage og reversibel afgift interaktioner trænge gennem den dybe zone af væv. En optimalt ladet lægemiddelbærer ville imidlertid ikke kun trænge ind i de dybe zoner af væv, men ville også demonstrere en høj intra-væv optagelse, som kan bestemmes ved hjælp af fluorescens målinger af ligevægt bad og væv våd vægt, som vist.Ikke-ligevægtstransporttransportforsøg resulterer i en datagenereret kurve med en gradvis stigende hældning. Den indledende del af kurven repræsenterer opløst diffusion gennem brusk som opløst matrix bindende interaktioner forekomme. Når opløselige kamre når nedstrømskammeret, øges kurvens hældning, efterhånden som fluorescensaflæsningerne øges over tid.Denne anden del af kurven når derefter en stabil hældning, der repræsenterer steady state diffusion. X-skæringspunktet af en tangential linje trukket på steady state del af kurven angiver den tid, det tager at nå steady state diffusion eller tau lag. Efter opløsning overførsel fra opstrøms til nedstrøms kammer, en stigning i fluorescens er observeret, på hvilket tidspunkt den stabiliserede fluorescens intensitet kan bruges til at korrelere fluorescens til koncentrationen.De repræsentative effektive diffusivitets- og steady state diffusionsværdier kan derefter beregnes som angivet. Bemærk, at steady state diffusivity er to størrelsesordener højere end den effektive diffusivitet som følge af alle de afgiftsbaserede bindingsanlæg, der er besat. På dette tidspunkt er diffusion således baseret på størrelse og ikke opladning, hvilket resulterer i lignende steady state diffusionsværdier blandt CPC'er af samme størrelse.Vedligehold explant hydrering og minimer opløsningsfordampning under hele forsøget for at forhindre ændringer i henholdsvis bruskmorfologien og opløsningskoncentrationen og for at sikre nøjagtig og reproducerbar dataindsamling. Efter udformningen af en optimalt ladet stof luftfartsselskab, forskellige bøjning teknikker kan anvendes til at ændre lægemidler til øget væv målretning og lette evalueringen af deres biologiske effektivitet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantificering af mekaniske egenskaber af de Endothelial glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic force mikroskopi Based Biopanning til isolering af Morfologi Specifikke reagenser mod TDP-43 varianter i amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Kortlægning af de mekaniske egenskaber af biofilm fra Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

Transport Egenskaber Ibuprofen indkapslet i Cyclodextrin Nanosponge Hydrogeler: En Proton HR-MAS NMR spektroskopi Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering af terapeutisk siRNA til CNS Brug kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Syntese af monocyt-targeting peptid Amphiphile Micelles til billeddannelse af åreforkalkning

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrkning pattedyrsceller i tre-dimensionelle peptid stilladser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation af kationiske Nanoliposomes til effektiv levering af In Vitro transskriberet Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Designe porøs silicium film som bærere af Nerve vækst faktor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...