Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Defensie door middel van de Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) onder contract W81XWH-17-1-0085, en het National Institute of Health R03 EB025903-1. AV werd gefinancierd door het College of Engineering Dean's Fellowship aan de Northeastern University.

Universitaire goedkeuringen werden verkregen voor het uitvoeren van de experimenten met dode weefsels. Runderverbindingen werden commercieel verkregen uit een slachthuis.
1. Kraakbeenexplant extractie
<ol><li>Met behulp van een scalpel (#10 blad), knippen en verwijderen van vet, spieren, ligamenten, pezen en alle andere bindweefsel om het kraakbeen bloot te stellen van de femoropatellar groef van runderkniegewrichten.</li>
	<li>Met behulp van 3 mm en 6 mm huidstoten, maak loodrecht stoten in...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease.">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li><li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+osteoarthritis.">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+articular+cartilage:+Structure,+composition,+and+function.">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee:+A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li><li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+intra-articular+therapy.">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li><li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs.">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage.">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li><li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term.">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery.">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882 (2020).</li><li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention.">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis.">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li><li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

De methoden en protocollen die hier worden beschreven zijn belangrijk voor het gebied van gerichte levering van geneesmiddelen aan negatief geladen weefsels. Vanwege de hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans aanwezig in deze weefsels, wordt een barrière gecreëerd, waardoor drugs hun cellulaire doelsites die diep in de matrix liggen, niet bereiken. Om deze nog opmerkelijke uitdaging het land aan te pakken, kunnen geneesmiddelen worden aangepast om positief geladen drugsdragers op te nemen die het vervoerspercenta...

Drug-levering aan negatief geladen weefsels in het lichaam blijft een uitdaging als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om diep door te dringen in het weefsel om cel en matrix doelsites1te bereiken. Een aantal van deze weefsels bestaat uit dicht verpakte, negatief geladen aggrecans die een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid (FCD)2 in het weefsel creëren en fungeren als een barrière voor de levering van de meeste macromoleculen3,4. Echter, met de hulp van positief geladen drugsdragers, kan deze negatief geladen weefselbarrière daadwerkelijk worden omgezet in een medicijndepot via elektrostatische ladingsinteracties voor aanhoudende levering van geneesmiddelen1,5,6,7( figuur1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Figuur 1: Op kosten gebaseerde intrakraakbeenlevering van CPC's. Intra-articulaire injectie van CPC's in de kniegewrichtruimte. Elektrostatische interacties tussen positief geladen CPC's en negatief geladen aggrecangroepen maken een snelle en volledige dieptepenetratie door kraakbeen mogelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Onlangs, korte lengte cationic peptide dragers (CPC's) werden ontworpen met het doel van het creëren van kleine kationische domeinen in staat het dragen van grotere grootte therapeutica voor de levering aan de negatief geladen kraakbeen4. Voor effectieve levering van geneesmiddelen aan het kraakbeen voor de behandeling van heersende8,,9 en degeneratieve ziekten zoals artrose (OA)10, is het van cruciaal belang dat therapeutische concentraties van geneesmiddelen diep in het weefsel doordringen, waar een meerderheid van de kraakbeencellen (chondrocyten)11liggen. Hoewel er verschillende potentiële ziekte wijzigen van geneesmiddelen beschikbaar zijn, geen hebben opgedaan FDA goedkeuring, omdat deze niet in staat zijn om effectief te richten op hetkraakbeen 12,13. Daarom is evaluatie van de transporteigenschappen van drugsdragers noodzakelijk om de effectiviteit van geneesmiddelen te voorspellen die een therapeutische respons opwekken. Hier hebben we drie afzonderlijke experimenten ontworpen die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en de verspreidingsgraad van CPC's4zonder evenwicht.
Om ervoor te zorgen dat er een voldoende medicijnconcentratie in het kraakbeen is die een optimale therapeutische respons kan bieden, werden opname-experimenten ontworpen om de CPC-concentratie in kraakbeen4te kwantificeren. In dit ontwerp, na een evenwicht tussen het kraakbeen en het omringende bad, kan de totale hoeveelheid oplosmiddel in het kraakbeen (gebonden aan de matrix of vrij) worden bepaald met behulp van een opnameverhouding. Deze verhouding wordt berekend door de concentratie van oplosmiddel in het kraakbeen te normaliseren tot die van het evenwichtsbad. In principe zou neutrale oplosmiddel, waarvan de verspreiding door het kraakbeen niet wordt bijgestaan door ladingsinteracties, een opnameverhouding van minder dan 1 hebben. Omgekeerd vertonen kationische oplosmiddelen, waarvan het transport wordt verbeterd via elektrostatische interacties, een opnameverhouding van meer dan 1. Zoals blijkt uit CPC's kan het gebruik van een optimale positieve lading echter leiden tot een veel hogere opnameratio (groter dan 300)4.
Hoewel een hoge medicijnconcentratie in het kraakbeen belangrijk is voor het bereiken van therapeutisch voordeel, is het ook van cruciaal belang dat geneesmiddelen zich verspreiden door de volledige dikte van het kraakbeen. Daarom zijn studies die de diepte van penetratie laten zien nodig om ervoor te zorgen dat geneesmiddelen diep in het kraakbeen reiken, zodat de matrix- en cellulaire doellocaties kunnen worden bereikt, waardoor een effectievere therapie wordt geboden. Dit experiment was ontworpen om de eenrichtingspreiding van oplosmiddelen door kraakbeen te beoordelen, waarbij de verspreiding van geneesmiddelen in kraakbeen na intra-articulaire injectie in vivo werd gesimuleerd. Fluorescentie beeldvorming met behulp van confocale microscopie zorgt voor de evaluatie van de diepte van penetratie in kraakbeen. Netto deeltjeslading speelt een belangrijke rol bij het matigen van hoe diepe geneesmiddelen zich door de matrix kunnen verspreiden. Een optimale nettolading op basis van een weefsel FCD is vereist om zwakke-omkeerbare binding interacties tussen kationische deeltjes en de anionische weefselmatrix mogelijk te maken. Dit houdt in dat elke interactie zwak genoeg is, zodat deeltjes zich kunnen loskoppelen van de matrix, maar omkeerbaar van aard, zodat het kan binden aan een andere matrix binding site dieper in het weefsel4. Omgekeerd kan een overmatige positieve nettolading van een deeltje schadelijk zijn voor diffusie, omdat een te sterke matrixbinding het losmaken van deeltjes van de oorspronkelijke bindingsplaats in de oppervlakkige zone van kraakbeen verhindert. Dit zou resulteren in een onvoldoende biologische respons, aangezien een meerderheid van de doellocaties diep in het weefsel ligt11.
Om de sterkte van de bindende interacties verder te kwantificeren, is analyse van de verspreidingssnelheden van geneesmiddelen via kraakbeen voordelig. Niet-evenwichtsdiffusiestudies maken het mogelijk om real-time diffusiepercentages tussen verschillende oplospercentages te vergelijken. Als geneesmiddelen verspreiden door de oppervlakkige, middelste en diepe zones van kraakbeen, de aanwezigheid van bindende interacties kan sterk veranderen diffusie tarieven. Wanneer bindende interacties aanwezig zijn tussen geneesmiddelen en de kraakbeenmatrix, wordt deze gedefinieerd als de effectieve diffusiviteit (DEFF). In dit geval, zodra alle bindende plaatsen zijn bezet, wordt het verspreidingspercentage van drugs beheerst door de steady-state diffusie (DSS). Vergelijking tussen de DEFF van verschillende oplosmiddel bepaalt de relatieve bindende sterkte van de oplosmiddel met de matrix. Voor een bepaalde oplosmiddel, als de DEFF en DSS binnen dezelfde orde van grootte zijn, impliceert dit dat er minimale binding aanwezig is tussen het medicijn en de matrix tijdens diffusie. Als DEFF echter groter is dan DSS,bestaat er een aanzienlijke binding van deeltjes aan matrix.
De ontworpen experimenten individueel zorgen voor de karakterisering van het vervoer oplosbaar door het kraakbeen, echter, een holistische analyse inclusief alle resultaten is vereist voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug drager. De zwakke en omkeerbare aard van lading interacties regelt deeltjes diffusie en zorgt voor een hoge evenwichtsopname en snelle volledige diepte penetratie door kraakbeen. Door middel van experimenten met evenwichtsopnames moeten we zoeken naar dragers die een hoge opname vertonen als gevolg van ladingsinteracties die kunnen worden geverifieerd met behulp van niet-evenwichtsdiffusieratiostudies. Deze bindende interacties moeten echter zwak en omkeerbaar van aard zijn om volledige diktepenetratie van het oplosmiddel door kraakbeen mogelijk te maken. Een ideale drug drager zou beschikken over een optimale lading die het mogelijk maakt sterk genoeg binding voor opname en hoge intra-kraakbeen drug concentraties, maar niet te sterk om volledige dikte diffusie4belemmeren. De gepresenteerde experimenten zullen helpen bij de ontwerpkenmerken voor op lading gebaseerd weefsel gericht op geneesmiddelendragers. Deze protocollen werden gebruikt voor het karakteriseren van CPC-transport viakraakbeen 4,maar deze kunnen ook worden toegepast op een verscheidenheid van geneesmiddelen en drugsdragers via kraakbeen en andere negatief geladen weefsels.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

Verschillende negatief geladen weefsels in het lichaam, zoals kraakbeen, vormen een barrière voor de gerichte levering van geneesmiddelen vanwege hun hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans en vereisen daarom verbeterde targetingmethoden om hun therapeutische respons te verhogen. Omdat kraakbeen een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid heeft, kunnen geneesmiddelen worden gewijzigd met positief geladen geneesmiddelendragers om te profiteren van elektrostatische interacties, waardoor een verbeterd intrakraakbeentransport mogelijk is. Het bestuderen van het vervoer van drugsdragers is daarom van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen te voorspellen die een biologische respons opwekken. We tonen het ontwerp van drie experimenten die de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en niet-evenwichtsdiffusiesnelheid van kationische peptidedragers in kraakbeenexplants kunnen kwantificeren. Evenwichtsopname-experimenten bieden een maat voor de oplosconcentratie in het kraakbeen in vergelijking met het omringende bad, wat handig is voor het voorspellen van het potentieel van een geneesmiddelendrager bij het verbeteren van de therapeutische concentratie van geneesmiddelen in kraakbeen. Diepte van penetratiestudies met behulp van confocale microscopie zorgen voor de visuele weergave van 1D-oplosmiddeldiffusie van de oppervlakkige tot diepe zone van kraakbeen, wat belangrijk is om te beoordelen of solutes hun matrix- en cellulaire doelsites bereiken. Niet-evenwichtsdiffusiegraadstudies met behulp van een op maat ontworpen transportkamer maakt het mogelijk de sterkte van bindingsinteracties met de weefselmatrix te meten door de diffusiesnelheden van fluorescerende gelabelde solutes over het weefsel te karakteriseren; dit is gunstig voor het ontwerpen van dragers van optimale bindingssterkte met kraakbeen. Samen vormen de resultaten van de drie vervoersexperimenten een richtlijn voor het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers die profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen. Deze experimentele methoden kunnen ook worden toegepast om het vervoer van drugs en drug-drug carrier conjugaats te evalueren. Verder kunnen deze methoden worden aangepast voor het gebruik bij het richten van andere negatief geladen weefsels zoals meniscus, hoornvlies en de glasachtige humor.

Na evenwichtsabsorptie van CPC's door kraakbeen neemt de badfluorescentie af wanneer het oplosmiddel door het weefsel is opgenomen. Echter, als de fluorescentie waarde van het uiteindelijke bad blijft vergelijkbaar met de eerste, het geeft aan dat er geen / minimale oplosmiddel opname. Een andere bevestiging van de opname van solute is als het weefsel zichtbaar van kleur is veranderd in de kleur van de fluorescerende kleurstof. De kwantitatieve opname van oplosmiddel in kraakbeen werd bepaald aan de hand van de opnamever...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Dit protocol bepaalt evenwichtsopname, penetratiediepte en niet-evenwichtsdiffusiepercentage voor kationische peptidedragers in kraakbeen. Karakterisering van transporteigenschappen is van cruciaal belang voor een effectieve biologische respons. Deze methoden kunnen worden toegepast voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug dragers voor het richten van negatief geladen weefsels.

Karakterisering van intrakraakbeen transport eigenschappen van Cationic Peptide Carriers

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Het karakteriseren van de transporteigenschappen van therapieën en hun dragers is van cruciaal belang voor het waarborgen van effectieve biologische reacties. Deze methoden helpen bij het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers voor het richten van negatief geladen weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is hun vermogen om in vivo therapeutische werkzaamheid beter te voorspellen door middel van een reeks in vitro experimenten die solute transport door weefsel karakteriseren.Kraakbeenziekten, zoals artrose, blijven onbehandeld als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om de dichte avasculaire kraakbeen matrix, die geneesmiddelendragers proloog therapeutische werkzaamheid proloog. Begin met het gebruik van een delicate taak af te vegen om voorzichtig te verwijderen overtollige PBS van de oppervlakken van drie millimeter diameter, een millimeter dik kraakbeen explants. Gebruik een balans om snel het natte gewicht van elke explant vast te leggen en plaats onmiddellijk de explants in een PBS-bad om uitdroging te voorkomen.Voeg vervolgens 300 microliters vers bereide, 30 micromolar fluorescerend gelabelde kationische peptide carrier oplossing per put toe aan de binnenste putten van een 96-put plaat en gebruik een spatel om een explant toe te voegen aan elke bron van oplossing. Vul elk van de omliggende putten met 300 microliter PBS en bedek de plaat met een deksel. Verzegel de randen van de plaat met flexibele folie om verdamping te minimaliseren en plaats de plaat op een shaker in een 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur bij 50 omwentelingen per minuut, met een 15 millimeter baan.Breng aan het einde van de incubatie het evenwichtsbad van elke put over naar afzonderlijke polypropyleenbuizen en maak seriële verdunningen uit de voorraad 30 micromolar cationic peptide carrier oplossing om een standaardcurve te genereren. Breng vervolgens 200 microliter van elke oplossing en standaard over in individuele putten van een zwarte 96-putplaat en verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster en standaard op basis van de excitatie- en emissiegolflengten van het fluorescerende label. Om de diepte van kationische peptide drager penetratie in een kraakbeen explant te bepalen, gebruik een scalpel te snijden zes millimeter diameter, een millimeter dik kraakbeen explants in de helft en hydrateren de resulterende half-disc stukken met proteus remmer aangevuld PBS.Breng epoxy aan op het midden van een put van een op maat ontworpen eendimensionale transportkamer en beveilig een halfschijf explant binnen de put met de oppervlakkige kant van de explant naar de stroomopwaartse kant van de kamer. Verwijder overtollige lijm uit de put om contact met het diffusieoppervlak van het kraakbeen te voorkomen en voeg 80 microliter proteaseremmer aan beide zijden van de explant toe. Pipette de vloeistof op en neer aan de ene kant van de explant om te controleren op lekkage aan de andere kant.Als er geen lekkage aanwezig is, vervang dan de proteaseremmer aangevuld PBS van de upstream kant met 80 microliter van 30 micromolar fluorescentie gelabeld kationische peptide drager oplossing en zorgvuldig plaats de transportkamer in een cel cultuur schotel. Bedek de basis van de schotel met PBS om kationische peptide carrier oplossing verdamping te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen de oplossingen van de upstream- en downstreamkamers.Plaats de overdekte schotel op een shaker om deeltjessedimentatie gedurende vier of 24 uur te beperken bij kamertemperatuur en 50 omwentelingen per minuut, met een baan van 15 millimeter. Verwijder aan het einde van de incubatie de explants uit de kamer en snijd ongeveer 100 micron dikke plakjes uit het midden van elke explant. Plaats elk plakje explant tussen een glazen schuif en een afdekslip en hydrateer de plakjes met verse proteaseremmer aangevuld PBS.Bevestig de dia op het podium van een confocale microscoop en verkrijg een Z-stack van fluorescerende beelden door de volledige dikte van het segment bij vergroting van 10x. Open het afbeeldingsbestand en afbeelding J, klik op Afbeelding en selecteer Stapels en Z-project in het vervolgkeuzemenu. Voer vervolgens de segmentnummers in van één naar het laatste segment en selecteer onder Projectietype de gemiddelde intensiteit en klik op Oke.Om de niet-evenwichtsmiddel cationic peptide drager kraakbeen diffusie tarief te beoordelen, assembleren elke helft van de transportkamer, om een grote rubberen pakking, een polymethylmethacrylaat insert, en een kleine rubberen pakking. Meet de dikte van een kraakbeen explant, plaats dan de explant in de putten van de plastic insert met het oppervlakkige oppervlak tegenover de stroomopwaartse kamer en sandwich de twee helften samen om de montage te voltooien. Gebruik een moersleutel om de helften stevig aan elkaar te schroeven voordat u de upstreamkamer vult met twee milliliter proteaseremmer aangevuld PBS.Controleer de stroomafwaartse kamer op lekkage uit de stroomopwaartse kamer. Als er geen lekkage wordt gedetecteerd, vul de downstream kamer met twee milliliter proteaseremmer aangevuld PBS. Voeg een enkele mini roerbalk toe aan zowel de boven- als de stroomafwaartse kamers en plaats de kamer op een roerplaat met de kamer zodanig uitgelijnd dat de laser van de spectrofotometer is gericht op het midden van de stroomafwaartse kamer.Met het signaalontvangergedeelte van de spectrofotometer achter de stroomafwaartse kamer, verzamel je gedurende ten minste vijf minuten stabiele, realtime stroomafwaartse fluorescentie-emissiemetingen. Na het verkrijgen van een stabiele meting, voeg een vooraf berekend volume van fluorescerend gelabeld cationic peptide carrier stock oplossing aan de upstream kamer aan een uiteindelijke badconcentratie van drie micromolar, en controleer de downstream tl-signaal, terwijl het mogelijk maken van de solute transport tot een gestage toename van de helling te bereiken. Zodra een stabiele toestand is bereikt, breng 20 microliter oplossing van de upstream kamer naar de downstream kamer voor een spike test en het verzamelen van de real-time downstream fluorescentie lezingen.Een te hoge heffing beperkt de oplospending tot de oppervlakkige zone omdat de drager te sterk bindt aan de negatief geladen aggrecan-groepen van de kraakbeenmatrix. Omgekeerd dringen dragers die in staat zijn om te profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties door de diepe zone van weefsel. Een optimaal geladen drug drager, echter, zou niet alleen doordringen in de diepe zones van weefsel, maar zou ook aantonen een hoge intra-weefsel opname, die kan worden bepaald met behulp van de fluorescentie metingen van het evenwicht bad en weefsel nat gewicht, zoals aangetoond.Niet-evenwichtsdiffusietransportexperimenten resulteren in een gegevensgegenereerde curve met een geleidelijk toenemende helling. Het eerste deel van de curve vertegenwoordigt oplossing door het kraakbeen als oplosmiddel matrix bindende interacties optreden. Zodra de oplosbare kamer bereikt, neemt de helling van de curve toe naarmate de fluorescentiewaarden in de loop van de tijd toenemen.Dit tweede deel van de curve bereikt dan een gestage helling, wat de verspreiding van de steady state vertegenwoordigt. De X-intercept van een tangentiale lijn getrokken op de steady state gedeelte van de curve geeft de tijd die nodig is om steady state diffusie of tau lag te bereiken. Na de overdracht van de oplossing van de stroomopwaartse naar de stroomafwaartse kamer wordt een piek in fluorescentie waargenomen, waarna de gestabiliseerde fluorescentieintensiteit kan worden gebruikt om de fluorescentie te correleren met de concentratie.De representatieve effectieve diffusiviteit en steady state diffusie waarden kunnen vervolgens worden berekend, zoals aangegeven. Merk op dat de steady state diffusiviteit is twee ordes van grootte hoger dan de effectieve diffusiviteit als gevolg van alle van de lading op basis van bindende sites bezet. Dus, op dit punt, diffusie is gebaseerd op grootte en niet opladen, wat resulteert in vergelijkbare steady state diffusie waarden onder CPC's van dezelfde grootte.Houd hydratatie uit en minimaliseer de verdamping van oplossingen tijdens het hele experiment om veranderingen in de kraakbeenmorfologie en de concentratie van de oplossing te voorkomen en om nauwkeurige en reproduceerbare gegevensverwerving te garanderen. Na het ontwerp van een optimaal geladen drugdrager, kunnen verschillende vervoegingstechnieken worden gebruikt om geneesmiddelen voor verbeterde weefseltargeting te wijzigen en om de evaluatie van hun biologische werkzaamheid te vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

Transport eigenschappen van Ibuprofen ingekapseld in Cyclodextrine Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR-spectroscopie Studie

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Synthese van monocyt-targeting Peptide Amfifiel micellen voor beeldvorming van atherosclerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...