Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה של ארצות הברית באמצעות תוכניות מחקר רפואי בהכוונון הקונגרס (CDMRP) תחת חוזה W81XWH-17-1-0085, והמכון הלאומי לבריאות R03 EB025903-1. AV מומן על ידי המכללה להנדסה דיקן מלגות באוניברסיטת נורת'איסטרן.

אישורים באוניברסיטה הושגו לביצוע הניסויים עם רקמות מתות. מפרקים של בקרים הושגו מסחרית מבית מטבחיים.
1. חילוץ הסבר סחוס
<ol><li>באמצעות אזמל (#10), לחתוך ולהסיר שומן, שרירים, רצועות, גידים וכל רקמת חיבור אחרים כדי לחשוף את הסחוס מן גרוב הירך של מפרקים הברך בקר.</li>
	<li>בעזרת אגרופים ע?...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease.">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li><li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+osteoarthritis.">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+articular+cartilage:+Structure,+composition,+and+function.">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee:+A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li><li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+intra-articular+therapy.">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li><li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs.">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage.">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li><li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term.">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery.">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882 (2020).</li><li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention.">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis.">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li><li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן משמעותיים לתחום של אספקת סמים ממוקדת לרקמות טעונות באופן שלילי. בשל הצפיפות הגבוהה של aggrecans טעונים שלילית נוכח ברקמות אלה, נוצר מחסום, ובכך למנוע תרופות מלהגיע לאתרי היעד הסלולרי שלהם אשר נמצאים עמוק בתוך המטריצה. כדי להתמודד עם האתגר הבולט הזה, ניתן לשנות...

משלוח סמים לרקמות טעונות שלילית בגוף נשאר אתגר בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור עמוק לתוך הרקמה כדי להגיע לאתרי היעד תאמטריקס 1. חלק מרקמות אלה כוללות אגרקנים צפופים, טעונים בשלילה אשר יוצרים צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה (FCD)2 בתוך הרקמה ולפעול כמחסום למסירה של רוב מקרומולקולות3,,4. עם זאת, בסיוע של נושאות סמים טעונות חיובית, מחסום רקמות זה טעון שלילית למעשה ניתן להמיר למחסן סמים באמצעות אינטראקציות תשלום אלקטרוסטטי עבור משלוח סמיםממושך 1,,5,,6,7(איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> איור 1: תשלום משלוח מבוסס תוך סחוס של CPCs. הזרקה תוך-מפרקים של CPCs לחלל מפרק הברך. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין CPCs טעונים חיובית וקבוצות aggrecan טעונות שלילית לאפשר חדירה מהירה ועומק מלא באמצעות סחוס. נתון זה שונה מ- Vedadghavami et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
לאחרונה, ספקי פפטיד cationic באורך קצר (CPCs) תוכננו במטרה ליצור תחומים cationic קטנים מסוגל לשאת טיפולים גדולים יותר בגודל למסירה סחוסטעון שלילית 4. עבור משלוח תרופות יעיל לסחוס לטיפולנפוץ 8,9 ומחלותניווניות כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA)10,זה קריטי כי ריכוזים טיפוליים של תרופות לחדור עמוק בתוך הרקמה, שם רוב תאי הסחוס (chondrocytes)לשקר 11. למרות שיש מספר מחלות פוטנציאליות שינוי תרופות זמינות, אף אחד לא קיבל אישור ה-FDA כי אלה אינם מסוגלים למקד ביעילות את הסחוס12,13. לכן, הערכה של מאפייני התחבורה של נושאות סמים היא הכרחית לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה טיפולית. כאן, עיצבנו שלושה ניסויים נפרדים שניתן לנצל להערכת ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs4.
כדי להבטיח כי יש ריכוז תרופתי מספיק בתוך הסחוס שיכול לספק תגובה טיפולית אופטימלית, ניסויי ספיגה תוכננו לכמת שיווי משקל CPC ריכוז בסחוס4. בעיצוב זה, בעקבות שיווי משקל בין הסחוס לבין האמבטיה שמסביבו, ניתן לקבוע את הכמות הכוללת של הבדידות בתוך הסחוס (המאוגד למטריצה או בחינם) באמצעות יחס ספיגה. יחס זה מחושב על ידי נרמול הריכוז של solutes בתוך הסחוס לזה של אמבט שיווי המשקל. באופן עקרוני, solutes נייטרלי, אשר דיפוזיה דרך הסחוס אינו נעזר על ידי אינטראקציות תשלום, יהיה יחס ספיגה של פחות מ 1. לעומת זאת, solutes cationic, אשר תחבורה משופרת באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, להראות יחס ספיגה גדול מ 1. עם זאת, כפי שהראה עם CPCs, שימוש בטען חיובי אופטימלי יכול לגרום ליחס ספיגה גבוה בהרבה (גדול מ- 300)4.
למרות ריכוז גבוה של סמים בתוך הסחוס חשוב להשגת תועלת טיפולית, זה גם קריטי כי תרופות לפזר דרך העובי המלא של הסחוס. לכן, מחקרים המראים את עומק החדירה נדרשים כדי להבטיח כי תרופות להגיע עמוק בתוך הסחוס, כך מטריקס ואתרי היעד הסלולרי ניתן להגיע, ובכך לספק טיפול יעיל יותר. ניסוי זה נועד להעריך את דיפוזיה חד-דרךית של solutes באמצעות סחוס, המדמה דיפוזיה של תרופות לתוך סחוס בעקבות הזרקת תוך-מתוך-פרקים ב vivo. הדמיית פלואורסץ באמצעות מיקרוסקופית confocal מאפשרת הערכה של עומק חדירה לתוך סחוס. טעינת חלקיק נטו ממלאת תפקיד מרכזי במתינות האופן שבו סמים עמוקים יכולים לפזר דרך המטריצה. טעינה נטו אופטימלית המבוססת על FCD רקמה נדרש כדי לאפשר אינטראקציות מחייבות הפיך חלש בין חלקיקים cationic מטריצת רקמות אניון. משמעות הדבר היא כי כל אינטראקציה היא חלשה מספיק, כך חלקיקים יכולים להתנתק מהמטריקס אבל הפיך בטבע, כך שהוא יכול להיקשר לאתר אחר מחייב מטריקס עמוק יותרבתוך הרקמה 4. לעומת זאת, תשלום נטו חיובי מוגזם של חלקיק יכול להיות מזיק כלפי דיפוזיה, כמו איגוד מטריצה חזק מדי מונע ניתוק של חלקיקים מאתר האיגוד הראשוני באזור שטחי של סחוס. כתוצאה מכך תגובה ביולוגית לא מספקת כמו רוב אתרי היעד לשקר עמוק בתוך הרקמה11.
כדי לכמת עוד יותר את הכוח של אינטראקציות מחייבות, ניתוח של שיעורי דיפוזיה סמים באמצעות סחוס הוא יתרון. מחקרי דיפוזיה ללא שיווי משקל מאפשרים השוואה של שיעורי דיפוזיה בזמן אמת בין solutes שונים. כמו סמים מפוזרים דרך שטחי, אמצע ועמוק אזורים של סחוס, הנוכחות של אינטראקציות מחייבות יכול לשנות מאוד את שיעורי דיפוזיה. כאשר קיימות אינטראקציות מחייבות בין תרופות למטריצת הסחוס, היא מוגדרת כדיספוסיביות יעילה (DEFF). במקרה זה, לאחר שכל האתרים המחייבים נכבשו, שיעור דיפוזיה של תרופות נשלט על ידי דיפוזיה מצב יציב (DSS). השוואה בין DEFF של solute שונה קובעת את עוצמת האיגוד היחסי של solutes עם המטריצה. עבור solute נתון, אם DEFF ו- DSS הם באותו סדר גודל, זה מרמז כי יש כריכה מינימלית נוכח בין התרופה למטריצה במהלך דיפוזיה. עם זאת, אם DEFF גדול מ- DSS, קיים איגוד משמעותי של חלקיקים למטריקס.
הניסויים שתוכננו מאפשרים בנפרד אפיון של הובלה סולט באמצעות הסחוס, עם זאת, ניתוח הוליסטי הכולל את כל התוצאות נדרש לעיצוב נשא סמים טעון בצורה אופטימלית. האופי החלש וההפיך של אינטראקציות טעינה שולט בקצב דיפוזיה חלקיקים ומאפשר ספיגת שיווי משקל גבוהה וחדירה מהירה לעומק מלא באמצעות סחוס. באמצעות ניסויי ספיגת שיווי משקל, עלינו לחפש נשאים שמופעי ספיגה גבוהה כתוצאה מאינטראקציות טעינה שניתן לאמת באמצעות מחקרים ללא שיווי משקל קצב דיפוזיה. עם זאת, אינטראקציות מחייבות אלה צריכות להיות חלשות הפיכות בטבע כדי לאפשר חדירה בעובי מלא של הבדידות באמצעות סחוס. מוביל סמים אידיאלי יהיה בעל תשלום אופטימלי המאפשר חזק מספיק מחייב לספיגה וריכוזי סמים תוך סחוס גבוה, אבל לא חזק מדי כדי לסתר דיפוזיהבעובי מלא 4. הניסויים שהוצגו יסייעו במאפייני העיצוב של רקמה מבוססת תשלום המתמקדת בנשאי סמים. פרוטוקולים אלה שימשו לאפיון הובלת CPC באמצעות סחוס4,עם זאת, אלה יכולים להיות מיושמים גם על מגוון רחב של תרופות ונשאים סמים באמצעות סחוס ורקמות טעונות שלילית אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

מספר רקמות טעונות שלילית בגוף, כמו סחוס, להציג מחסום לאספקת סמים ממוקדת בשל הצפיפות הגבוהה שלהם של aggrecans טעונים שלילית, ולכן, דורשים שיטות פילוח משופרות כדי להגדיל את התגובה הטיפולית שלהם. בגלל סחוס יש צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה, תרופות ניתן לשנות עם נשאי סמים טעונים חיובית כדי לנצל אינטראקציות אלקטרוסטטיות, המאפשר תחבורה משופרת תוך סחוס סמים. לימוד ההובלה של נושאות סמים הוא, אם כן, חיוני לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה ביולוגית. אנו מראים את העיצוב של שלושה ניסויים אשר יכול לכמת את ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של נשאי פפטיד cationic בהסברי סחוס. ניסויי ספיגת שיווי משקל מספקים מדד של ריכוז הבדידות בתוך הסחוס בהשוואה לאמבטיה שמסביבה, אשר שימושי לחיזוי הפוטנציאל של נשא סמים בשיפור הריכוז הטיפולי של תרופות בסחוס. עומק מחקרי החדירה באמצעות מיקרוסקופית confocal לאפשר ייצוג חזותי של דיפוזיה 1D solute מן האזור שטחי עד עמוק של סחוס, אשר חשוב להעריך אם solutes להגיע מטריצה שלהם ואתרי היעד הסלולרי. מחקרי שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל באמצעות תא הובלה מותאם אישית מאפשר מדידה של חוזק של אינטראקציות מחייבות עם מטריצת הרקמה על ידי אפיון שיעורי דיפוזיה של solutes פלואורסצנטי על פני הרקמה; זה מועיל לעיצוב נשאים של כוח מחייב אופטימלי עם סחוס. יחד, התוצאות שהתקבלו משלושת ניסויי התחבורה מספקות קו מנחה לעיצוב נושאות תרופות טעונות בצורה אופטימלית המנצלות אינטראקציות טעינה חלשות והפיות עבור יישומים לאספקת תרופות. שיטות ניסיוניות אלה ניתן ליישם גם כדי להעריך את ההובלה של תרופות ותרופות סמים התייחדות. יתר על כן, שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקוד רקמות טעונות שלילית אחרים כגון מניסקוס, קרנית ואת ההומור זגוגית.

לאחר ספיגת שיווי המשקל של CPCs על ידי סחוס, פלואורסצסצנציה אמבטיה פוחתת כאשר solute כבר נכבש על ידי הרקמה. עם זאת, אם ערך הפלואורסצנס של האמבטיה הסופית נשאר דומה להתחלה, הוא מציין כי אין / ספיגת solute מינימלית. אישור נוסף של ספיגת solute הוא אם הרקמה שינתה באופן ניכר צבע לצבע של צבע פלורסנט. הספיגה הכמו...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

פרוטוקול זה קובע ספיגת שיווי משקל, עומק חדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל עבור נשאי פפטיד cationic בסחוס. אפיון של מאפייני תחבורה הוא קריטי להבטחת תגובה ביולוגית יעילה. שיטות אלה ניתן להחיל על עיצוב נושאות סמים טעונות בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית.

אפיון של מאפייני תחבורה תוך סחוס של ספקי פפטיד צ'ציה

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

אפיון תכונות ההובלה של תרפיה והנשאים שלהם הוא קריטי להבטחת תגובות ביולוגיות יעילות. שיטות אלה מסייעות בתכנון נשאי תרופות טעונים בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא היכולת שלהם לחזות טוב יותר יעילות טיפולית vivo באמצעות סדרה של ניסויים במבחנה המאפיינים תחבורה מסיס דרך רקמות.מחלות סחוס, כגון דלקת מפרקים ניוונית, נשארות לא מטופלות בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור למטריצת הסחוס הצפופה, הדורשת מנשאי תרופות לפרולוג יעילות טיפולית. התחל באמצעות ניגוב משימה עדין כדי להסיר בעדינות PBS עודף מן המשטחים של קוטר שלושה מילימטר, אחד מילימטר עבה סחוס explants. השתמש באיזון כדי לתעד במהירות את המשקל הרטוב של כל explant ומיד למקם את המתפוצצים לתוך אמבטיה PBS כדי למנוע התייבשות.לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תווי פפטיד קוטיים טריים, 30 מיקרומולרים בעלי תווית קוטית לכל באר ל הבאר הפנימית של צלחת של 96 בארות, ולהשתמש במתית כדי להוסיף תוסף אחד לכל באר של פתרון. מלאו כל אחת מה בארות שמסביב ב-300 מיקרוליטרים של PBS וכסו את הצלחת במכסה. לאטום את הקצוות של הצלחת עם סרט גמיש כדי למזער את האידוי ולהציב את הצלחת על שייקר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ב 50 מהפכות לדקה, עם מסלול 15 מילימטר.בסוף הדגירה, להעביר את אמבט שיווי המשקל מכל באר לתוך צינורות פוליפרופילן בודדים ולעשות דילול סדרתי מן המניה 30 פתרון פפטיד מיקרומולרי פפטיד כדי ליצור עקומה סטנדרטית. לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל פתרון וסטנדרט לתוך בארות בודדות של צלחת שחורה 96 באר ולקבל קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם וסטנדרט מבוסס על אורך גל העירור והאפלה של התווית פלואורסצנטי. כדי לקבוע את עומק החדירה של נושא פפטיד קטורתי בתוך explant סחוס, להשתמש באזמל לחתוך קוטר שישה מילימטר, אחד מילימטר עבה סחוס explants במחצית לחות חתיכות חצי דיסק וכתוצאה מכך עם מעכב פרוטאוס בתוספת PBS.החל אפוקסי על מרכז באר של תא תחבורה חד מימדי מעוצב בהתאמה אישית ולאבטח explant חצי דיסק אחד בתוך הבאר עם הצד השטחי של explant מול הצד במעלה הזרם של התא. הסר כל דבק עודף מן באר כדי למנוע מגע עם שטח הפנים דיפוזיה של הסחוס ולהוסיף 80 microliters של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS לשני צידי explant. פיפטה הנוזל למעלה ולמטה בצד אחד של explant כדי לבדוק דליפה לצד השני.אם אין דליפה, החלף את מעכב פרוטאז בתוספת PBS מהצד במעלה הזרם עם 80 microliters של 30 פלואורסצנטי מיקרומולרי שכותרתו פתרון נושא פפטיד קטורית בזהירות למקם את תא ההובלה לתוך צלחת תרבות התא. מכסים את בסיס המנה עם PBS כדי למנוע אידוי תותב פפטיד קוטי. יש לדאוג לכך שאין מגע ישיר בין הפתרונות מהזרם במעלה הזרם ובמורד הזרם.מניחים את המנה המוקרה על שייקר כדי להגביל את מסיס החלקיק במשך ארבע או 24 שעות בטמפרטורת החדר ו 50 מהפכות לדקה, עם מסלול 15 מילימטר. בסוף הדגירה, מוציאים את המתפוצצים מהתא וחותכים כ-100 פרוסות בעובי של כ-100 מיקרון ממרכז כל קליפה. מניחים כל פרוסת explant בין שקופית זכוכית להחליק כיסוי לחות את הפרוסות עם מעכב פרוטאז טרי בתוספת PBS.תקן את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל ולקבל ערימת Z של תמונות פלואורסצנטיות דרך העובי המלא של הפרוסה בהגדלה 10X. פתחו את קובץ התמונה והתמונה J, לחצו על 'תמונה' ובחרו 'ערימות' ו'פרוייקט Z' מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, הזן את מספרי הפרוסה מאחד לפרוסה הסופית ותחת סוג הקרנה, בחר בעוצמה ממוצעת ולחץ על אישור.כדי להעריך את קצב פיזור הסחוס של נושא הפפטיד שאינו שיווי משקל, להרכיב כל מחצית של תא ההובלה, לכלול אטם גומי אחד גדול, אחד polymethylmethacrylate הכנס, אטם גומי אחד קטן. למדוד את עובי של explant סחוס, ולאחר מכן למקם את explant בארות של מוסיף פלסטיק עם משטח שטחי מול התא במעלה הזרם כריך שני חצאים יחד כדי להשלים את ההרכבה. השתמש מפתח ברגים כדי לדפוק בחוזקה את החצאים יחד לפני מילוי התא במעלה הזרם עם שני מיליליטר של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS.בדוק את התא במורד הזרם לדליפה מהתא במעלה הזרם. אם לא זוהתה דליפה, מלאו את התא במורד הזרם בשני מיליליטר של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS. מוסיפים מיני בר ערבוב יחיד לתאי ההמשך והמורד ומ מניחים את התא על צלחת ערבוב כשהתא מיושר כך שהלייזר מהספקטרופוטומטר ממוקד לכיוון מרכז התא במורד הזרם.עם חלק מקלט האות של הספקטרופוטומטר מאחורי התא במורד הזרם, לאסוף יציב, בזמן אמת במורד הזרם קריאות פליטת פלואורסצנטיות לפחות חמש דקות. לאחר קבלת קריאה יציבה, הוסיפו נפח מחושב מראש של תווי פפטיד קוטיים בעלי תווית פלואורסצנטית לתא במעלה הזרם לריכוז אמבטיה סופי של שלושה מיקרומולרים, ונטרו את אות הפלואורסצנט במורד הזרם תוך מתן אפשרות להובלה המסיסה להגיע לעלייה מתמדת במדרון. לאחר שהושג מצב יציב, העבר 20 מיקרוליטרים של פתרון מהתא במעלה הזרם לתא במורד הזרם למבחן ספייק ולאסוף את קריאות הפלואורסצנטיות בזמן אמת במורד הזרם.מטען חיובי גבוה מדי יגביל חדירה מסיס לאזור השטחי כמו המוביל נקשר חזק מדי לקבוצות aggrecan טעון שלילית של מטריצת הסחוס. לעומת זאת, נשאים שמצליחים לנצל אינטראקציות מטען חלשות והפיכות חודרים דרך האזור העמוק של הרקמה. נושאת סמים טעונה בצורה אופטימלית, עם זאת, לא רק לחדור את האזורים העמוקים של רקמה, אלא גם להפגין ספיגת פנים-רקמה גבוהה, אשר ניתן לקבוע באמצעות מדידות פלואורסצנטיות של אמבט שיווי המשקל ומשקל רטוב רקמות, כפי שמוצג.ניסויי הובלת דיפוזיה שאינם שיווי משקל גורמים לעקומה שנוצרת על-ידי נתונים עם שיפוע הולך וגדל בהדרגה. החלק הראשוני של העקומה מייצג דיפוזיה מסיס דרך הסחוס כמו אינטראקציות מחייב מטריצה מסיס להתרחש. ברגע שמסיסים מגיעים לתא במורד הזרם, שיפוע העקומה עולה ככל שקריאות הפלואורסצנטיות גדלות עם הזמן.חלק שני זה של העקומה מגיע לאחר מכן למדרון יציב, המייצג דיפוזיה מצב יציב. ה- X-intercept של קו משיק שצויר בחלק המצב היציב של העקומה מציין את הזמן שלוקח להגיע לפזר מצב יציב או השהיה טאו. בעקבות העברת פתרון מן הזרם אל התא במורד הזרם, עלייה חדה פלואורסצנטיות נצפתה, ובנקודה זו את עוצמת הפלואורסצנטיות מיוצבת ניתן להשתמש כדי לתאם את הפלואורסצנטיות לריכוז.לאחר מכן ניתן לחשב את ערכי ההתפזרות היעילים הייצוגיים ואת ערכי פיזור המצב היציב, כפי שצוין. שים לב כי דיפוזיביות מצב יציב הוא שני סדרי גודל גבוה יותר מאשר דיפוזיביות יעילה כתוצאה של כל אתרי איגוד מבוססי תשלום להיות כבוש. לכן, בשלב זה, דיפוזיה מבוססת על גודל ולא טעינה, וכתוצאה מכך ערכי דיפוזיה מצב יציב דומה בקרב CPCs באותו גודל.לשמור על הידרציה של explant ולמזער את אידוי התספורת לאורך כל הניסוי כדי למנוע שינויים במורפולוגיה של הסחוס ובריכוז הפתרון, בהתאמה, ולהבטיח רכישת נתונים מדויקת ותרבה. בעקבות העיצוב של נושאת סמים טעונה בצורה אופטימלית, טכניקות התייחדות שונות ניתן להשתמש כדי לשנות תרופות עבור מיקוד רקמות משופרת כדי להקל על הערכת היעילות הביולוגית שלהם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

מאפיינים התחבורה של איבופרופן הגלום Cyclodextrin Nanosponge הידרוג: מחקר ספקטרוסקופיה Proton HR-MAS NMR

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

עיצוב הסיליקון הנקבובי סרטים כמו נשאים של גורם הגדילה העצבי

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...