Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso (CDMRP) sob o contrato W81XWH-17-1-0085, e o Instituto Nacional de Saúde R03 EB025903-1. A AV foi financiada pela Faculdade de Engenharia da Universidade do Nordeste.

Foram obtidas aprovações universitárias para a realização dos experimentos com tecidos mortos. As juntas bovinas foram obtidas comercialmente a partir de um matadouro.
1. Extração de explante de cartilagem
<ol><li>Utilizando um bisturi (#10 lâmina), corte e remova gordura, músculos, ligamentos, tendões e todos os outros tecidos conjuntivos para expor a cartilagem do sulco femoropatelar das articulações do joelho bovino.</li>
	<li>Usando socos dérmicos de 3 mm e 6 mm, faça socos...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. 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S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

Os métodos e protocolos descritos aqui são significativos para o campo da entrega de medicamentos direcionados para tecidos carregados negativamente. Devido à alta densidade de aggrecans carregados negativamente presentes nesses tecidos, cria-se uma barreira, impedindo assim que as drogas atinjam seus locais de destino celular que estão no fundo da matriz. Para enfrentar este desafio pendente, os medicamentos podem ser modificados para incorporar portadores de medicamentos carregados positivamente que podem aumentar ...

A entrega de drogas para tecidos carregados negativamente no corpo continua sendo um desafio devido à incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido para alcançar os locais-alvo das células e matrizes1. Vários desses tecidos são compostos por aggrecans densamente embalados e carregados negativamente que criam uma alta densidade de carga fixa negativa (FCD)2 dentro do tecido e agem como uma barreira para a entrega da maioria das macromoléculas3,,4. No entanto, com a ajuda de portadores de medicamentos carregados positivamente, essa barreira tecidual carregada negativamente pode ser convertida em um depósito de drogas através de interações de carga eletrostática para entrega sustentada de medicamentos1,,5,,6,7(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Figura 1: Entrega intra cartilagem baseada em carga de CPCs. Injeção intra-articular de CPCs no espaço articular do joelho. Interações eletrostáticas entre CPCs carregados positivamente e grupos aggrecanos carregados negativamente permitem penetração rápida e completa de profundidade através da cartilagem. Este número foi modificado de Vedadghavami et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Recentemente, os portadores de peptídeos cáticos de curto comprimento (CPCs) foram projetados com o objetivo de criar pequenos domínios cônicos capazes de realizar terapêuticas de tamanho maior para entrega à cartilagem4carregada negativamente . Para o fornecimento eficaz de medicamentos à cartilagem para o tratamento de doenças prevalentes8,,9 e degenerativas como a osteoartrite (OA)10, é fundamental que as concentrações terapêuticas de drogas penetrem profundamente dentro do tecido, onde a maioria das células de cartilagem (condrócitos)residem 11. Embora existam vários medicamentos potenciais modificados por doenças disponíveis, nenhum deles obteve a aprovação da FDA porque estes são incapazes de atingir efetivamente a cartilagem12,13. Portanto, a avaliação das propriedades de transporte dos transportadores de drogas é necessária para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta terapêutica. Aqui, projetamos três experimentos separados que podem ser utilizados para avaliar a captação de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio dos CPCs4.
Para garantir que haja uma concentração suficiente de medicamentos dentro da cartilagem que possa fornecer uma resposta terapêutica ideal, os experimentos de absorção foram projetados para quantificar a concentração de CPC de equilíbrio na cartilagem4. Neste desenho, seguindo um equilíbrio entre a cartilagem e seu banho circundante, a quantidade total de soluto dentro da cartilagem (vinculada à matriz ou livre) pode ser determinada usando uma razão de absorção. Essa razão é calculada pela normalização da concentração de solutos dentro da cartilagem ao do banho de equilíbrio. Em princípio, solutos neutros, cuja difusão através da cartilagem não é assistida por interações de carga, teriam uma razão de absorção inferior a 1. Por outro lado, solutos cáticos, cujo transporte é aprimorado através de interações eletrostáticas, mostram uma razão de absorção maior que 1. No entanto, como mostrado com os CPCs, o uso de uma carga positiva ideal pode resultar em taxas de absorção muito maiores (superiores a 300)4.
Embora a alta concentração de medicamentos dentro da cartilagem seja importante para alcançar o benefício terapêutico, também é fundamental que as drogas difundam através da espessura total da cartilagem. Portanto, estudos mostrando a profundidade da penetração são necessários para garantir que os medicamentos cheguem fundo dentro da cartilagem para que os locais de matriz e destino celular possam ser alcançados, proporcionando assim uma terapia mais eficaz. Este experimento foi projetado para avaliar a difusão unidirecional de solutos através da cartilagem, simulando a difusão de drogas em cartilagem após injeção intra-articular in vivo. A imagem de fluorescência usando microscopia confocal permite a avaliação da profundidade de penetração na cartilagem. A carga de partículas líquidas desempenha um papel fundamental na moderação de como drogas profundas podem difundir através da matriz. Uma carga líquida ideal baseada em um tecido FCD é necessária para permitir interações de ligação fraca-reversíveis entre partículas cônicas e a matriz tecidual. Isso implica que qualquer interação é fraca o suficiente para que as partículas possam se desassociar da matriz, mas reversível na natureza para que possa se ligar a outro local de ligação de matriz mais profunda dentro do tecido4. Por outro lado, a carga líquida positiva excessiva de uma partícula pode ser prejudicial para a difusão, uma vez que a ligação matricial muito forte impede o descolamento de partículas do local de ligação inicial na zona superficial da cartilagem. Isso resultaria em uma resposta biológica insuficiente, pois a maioria dos locais alvos está profundamente dentro do tecido11.
Para quantificar ainda mais a força das interações de ligação, a análise das taxas de difusão de medicamentos através da cartilagem é vantajosa. Estudos de difusão de não equilíbrio permitem a comparação das taxas de difusão em tempo real entre diferentes solutos. À medida que as drogas se difundem através das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem, a presença de interações de ligação pode alterar muito as taxas de difusão. Quando as interações de ligação estão presentes entre as drogas e a matriz da cartilagem, ela é definida como a difusividade efetiva(D EFF). Neste caso, uma vez ocupados todos os locais vinculantes, a taxa de difusão de medicamentos é regida pela difusão de estado estável(SS). A comparação entre oEFF D de solute diferente determina a força relativa de ligação dos solutos com a matriz. Para um determinado soluto, se o DEFF e dSS estão dentro da mesma ordem de magnitude, implica que há uma ligação mínima presente entre a droga e a matriz durante a difusão. No entanto, seo D EFF for maior que o DSS,existe uma ligação substancial de partículas à matriz.
Os experimentos projetados individualmente permitem a caracterização do transporte soluto através da cartilagem, no entanto, uma análise holística inclusiva de todos os resultados é necessária para projetar um portador de medicamentos com carga ideal. A natureza fraca e reversível das interações de carga controla a taxa de difusão de partículas e permite uma alta absorção de equilíbrio e rápida penetração de profundidade total através da cartilagem. Através de experimentos de captação de equilíbrio, devemos procurar portadores que apresentem alta absorção como resultado de interações de carga que podem ser verificadas por meio de estudos de taxa de difusão de não equilíbrio. No entanto, essas interações de ligação devem ser fracas e reversíveis na natureza para permitir a penetração da espessura total do soluto através da cartilagem. Um portador de drogas ideal possui uma carga ideal que permite uma ligação forte o suficiente para absorção e altas concentrações de drogas intra-cartilagem, mas não muito forte a ponto de impedir a difusão de espessura total4. Os experimentos apresentados auxiliarão nas características de design para os portadores de medicamentos baseados em carga. Esses protocolos foram utilizados para caracterizar o transporte de CPC através da cartilagem4,porém, estes também podem ser aplicados a uma variedade de medicamentos e portadores de drogas através de cartilagem e outros tecidos carregados negativamente.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

Vários tecidos carregados negativamente no corpo, como a cartilagem, apresentam uma barreira para o fornecimento de medicamentos direcionados devido à sua alta densidade de aggrecans carregados negativamente e, portanto, requerem métodos de mira melhorados para aumentar sua resposta terapêutica. Como a cartilagem tem uma alta densidade de carga fixa negativa, as drogas podem ser modificadas com portadores de drogas positivamente carregados para tirar proveito das interações eletrostáticas, permitindo um maior transporte de drogas intra-cartilagem. Estudar o transporte de transportadores de drogas é, portanto, crucial para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta biológica. Mostramos o desenho de três experimentos que podem quantificar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio de portadores de peptídeos cationicos em explantas de cartilagem. Os experimentos de absorção de equilíbrio fornecem uma medida da concentração de soluto dentro da cartilagem em comparação com seu banho circundante, o que é útil para prever o potencial de um portador de drogas no aumento da concentração terapêutica de drogas na cartilagem. Estudos de profundidade de penetração utilizando microscopia confocal permitem a representação visual da difusão soluto 1D da zona superficial para profunda da cartilagem, o que é importante para avaliar se os solutos atingem seus locais de destino matriz e celular. Estudos de taxa de difusão não-equilíbrio utilizando uma câmara de transporte personalizada permitem medir a força das interações de ligação com a matriz tecidual caracterizando as taxas de difusão de solutos fluorescentes rotulados através do tecido; isso é benéfico para projetar portadores de força de ligação ideal com cartilagem. Juntos, os resultados obtidos a partir dos três experimentos de transporte fornecem uma diretriz para projetar portadores de medicamentos com carga ideal que se aproveitam de interações de carga fracas e reversíveis para aplicações de entrega de medicamentos. Estes métodos experimentais também podem ser aplicados para avaliar o transporte de drogas e conjugados portadores de drogas. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para uso na segmentação de outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo.

Após a absorção de equilíbrio de CPCs por cartilagem, a fluorescência do banho diminui quando o soluto é tomado pelo tecido. No entanto, se o valor da fluorescência do banho final permanecer semelhante ao inicial, indica que não há absorção soluto mínima/mínima. Outra confirmação da absorção de soluto é se o tecido mudou visivelmente de cor para a cor do corante fluorescente. A absorção quantitativa de solutos na cartilagem foi determinada utilizando-se a razão de absorção (RU) após os ...

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Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.

Caracterização das Propriedades de Transporte Intra-Cartilagem dos Transportadores de Peptídeos Cationic

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Caracterizar as propriedades de transporte da terapêutica e de seus portadores é fundamental para garantir respostas biológicas eficazes. Esses métodos auxiliam na concepção de portadores de medicamentos com a carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente. A principal vantagem dessas técnicas é sua capacidade de prever melhor as eficácias terapêuticas in vivo através de uma série de experimentos in vitro que caracterizam o transporte de soluto através do tecido.As doenças da cartilagem, como a osteoartrite, permanecem não tratadas devido à incapacidade de as drogas penetrarem na densa matriz de cartilagem avascular, exigindo que os portadores de drogas prólogos sejam eficazes terapêuticas. Comece usando uma limpeza de tarefa delicada para remover suavemente o excesso de PBS das superfícies de três milímetros de diâmetro, umaima de espessura explantes de cartilagem. Use um equilíbrio para registrar rapidamente o peso úmido de cada explanta e coloque imediatamente as explantas em um banho pbs para evitar a desidratação.Em seguida, adicione 300 microliters de recém-preparado, 30 micromolar fluorescente rotulado solução portadora de peptídeo cationic por poços bem para os poços internos de uma placa de 96 poços e use uma espátula para adicionar uma explanta a cada poço de solução. Encha cada um dos poços circundantes com 300 microliters de PBS e cubra a placa com uma tampa. Sele as bordas da placa com filme flexível para minimizar a evaporação e coloque a placa em um agitador em uma incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas a 50 revoluções por minuto, com uma órbita de 15 milímetros.Ao final da incubação, transfira o banho de equilíbrio de cada poço para tubos individuais de polipropileno e faça diluições seriais a partir do estoque 30 soluções portadoras de peptídeos cationic micromolar para gerar uma curva padrão. Em seguida, transfira 200 microliters de cada solução e padrão em poços individuais de uma placa preta de 96 poços e obtenha leituras de fluorescência de cada amostra e padrão com base nos comprimentos de onda de excitação e emissão do rótulo fluorescente. Para determinar a profundidade da penetração do portador de peptídeo cationic dentro de uma explanta de cartilagem, use um bisturi para cortar o diâmetro de seis milímetros, uma cartilagem milimétrica de espessura explanta ao meio e hidratar as peças de meio disco resultantes com inibidor de proteus complementado PBS.Aplique epóxi no centro de um poço de uma câmara de transporte unidimensional projetada sob medida e proteja uma explanta de meio disco dentro do poço com o lado superficial da explant voltada para o lado upstream da câmara. Remova qualquer excesso de cola do poço para evitar o contato com a superfície de difusão da cartilagem e adicione 80 microliters de inibidor de protease complementado PBS a ambos os lados da explanta. Pipetar o líquido para cima e para baixo em um lado da explanta para verificar se há vazamento para o outro lado.Se não houver vazamento, substitua o inibidor de protease complementado PBS do lado upstream por 80 microliters de 30 micromolars rotulados solução portadora de peptídeo cônico e coloque cuidadosamente a câmara de transporte em um prato de cultura celular. Cubra a base do prato com PBS para evitar a evaporação da solução de peptídeo cationic. Tomando cuidado para que não haja contato direto entre as soluções das câmaras upstream e downstream.Coloque o prato coberto em um agitador para limitar a sedimentação de partículas por quatro ou 24 horas à temperatura ambiente e 50 revoluções por minuto, com uma órbita de 15 milímetros. No final da incubação, remova as explantas da câmara e corte aproximadamente 100 mícrons de espessura do centro de cada explanta. Coloque cada fatia de explante entre um escorregador de vidro e um deslizamento de cobertura e hidrate as fatias com inibidor de protease fresco complementado PBS.Fixar o slide no estágio de um microscópio confocal e obter uma pilha de imagens fluorescentes Z através da espessura total da fatia na ampliação de 10X. Abra o arquivo de imagem e a imagem J, clique em Imagem e selecione Stacks e Z Project no menu suspenso. Em seguida, insira os números de fatias de uma para a fatia final e em Tipo de Projeção, selecione a intensidade média e clique em Ok.Para avaliar a taxa de difusão da cartilagem do portador de peptídeo cationic não-equilíbrio, monte cada metade da câmara de transporte, para incluir uma junta de borracha grande, uma inserção de polimetilmetato e uma pequena junta de borracha. Meça a espessura de uma explanta de cartilagem e coloque a explanta nos poços da inserção plástica com a superfície superficial voltada para a câmara upstream e sanduiche as duas metades juntas para completar a montagem. Use uma chave inglesa para aparafusar firmemente as metades antes de encher a câmara a montante com dois mililitros de inibidor de protease complementado PBS.Verifique a câmara a jusante para vazamento da câmara rio acima. Se não for detectado vazamento, encha a câmara a jusante com dois mililitros de inibidor de protease complementado PBS. Adicione uma única mini barra de mexiça nas câmaras para cima e para baixo e coloque a câmara em uma placa de agitação com a câmara alinhada de tal forma que o laser do espectrofotômetro esteja focado no centro da câmara a jusante.Com a porção do receptor de sinal do espectrofotômetro atrás da câmara a jusante, colete leituras estáveis e em tempo real de emissão de fluorescência a jusante por pelo menos cinco minutos. Após obter uma leitura estável, adicione um volume pré-calculado de solução de estoque de peptídeos cationic rotulados fluorescentemente à câmara upstream para uma concentração final de banho de três micromolares, e monitore o sinal fluorescente a jusante, permitindo que o transporte soluto atinja um aumento constante na inclinação. Uma vez alcançado um estado estável, transfira 20 microliters de solução da câmara upstream para a câmara a jusante para um teste de espigão e colete as leituras de fluorescência a jusante em tempo real.Uma carga positiva muito alta limitará a penetração de soluto à zona superficial à medida que o portador se liga muito fortemente aos grupos aggrecanos carregados negativamente da matriz de cartilagem. Por outro lado, os portadores que são capazes de tirar proveito de interações de carga fracas e reversíveis penetram através da zona profunda do tecido. Um portador de medicamentos com a carga ideal, no entanto, não só penetraria nas zonas profundas do tecido, mas também demonstraria uma alta absorção intra-tecidual, que pode ser determinada usando as medidas de fluorescência do banho de equilíbrio e do peso molhado do tecido, como mostrado.Experimentos de transporte de difusão de não equilíbrio resultam em uma curva gerada por dados com uma inclinação gradualmente crescente. A parte inicial da curva representa a difusão soluto através da cartilagem à medida que ocorrem interações de ligação matriz soluto. Uma vez que os solutos atingem a câmara a jusante, a inclinação da curva aumenta à medida que as leituras de fluorescência aumentam com o tempo.Esta segunda parte da curva então atinge uma inclinação constante, representando difusão de estado estável. A interceptação X de uma linha tangencial desenhada na porção de estado estável da curva indica o tempo necessário para alcançar a difusão de estado estável ou tau lag. Após a transferência da solução do rio para a câmara a jusante, observa-se um pico de fluorescência, momento em que a intensidade estabilizada da fluorescência pode ser usada para correlacionar a fluorescência à concentração.O representante efetivo de difusividade e valores de difusão estatal constante pode então ser calculado, conforme indicado. Observe que a difusividade estatal constante é duas ordens de magnitude superior à difusividade efetiva como resultado de todos os locais de vinculação baseados em cargas sendo ocupados. Assim, neste ponto, a difusão é baseada no tamanho e não na carga, resultando em valores de difusão de estado estável semelhantes entre os CPCs do mesmo tamanho.Manter a hidratação explant e minimizar a evaporação da solução durante todo o experimento para evitar alterações na morfologia da cartilagem e na concentração da solução, respectivamente, e para garantir a aquisição precisa e reprodutível de dados. Seguindo o projeto de um portador de drogas com a carga ideal, várias técnicas de conjugação podem ser utilizadas para modificar medicamentos para melhor direcionamento tecidual e facilitar a avaliação de sua eficácia biológica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Bioengenharia

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

Propriedades de transporte de Ibuprofeno encapsulados em ciclodextrina nanoesponja hidrogéis: A Proton HR-MAS NMR Estudo Spectroscopy

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...