Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Эта работа финансировалась Министерством обороны США в рамках программ медицинских исследований Конгресса (CDMRP) по контракту W81XWH-17-1-0085 и Национального института здравоохранения R03 EB025903-1. AV финансировался стипендией инженерного декана в Северо-Восточном университете.

Университет получил разрешение на проведение экспериментов с мертвыми тканями. Бычьи суставы были получены на коммерческой основе с скотобойни.
1. Извлечение хряща explant
<ol><li>Использование скальпеля (#10 лезвия), вырезать и удалить жир, мышцы, связки, сухожилия и все другие ...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease.">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li><li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+osteoarthritis.">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+articular+cartilage:+Structure,+composition,+and+function.">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee:+A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li><li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+intra-articular+therapy.">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li><li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs.">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage.">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li><li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term.">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery.">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882 (2020).</li><li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention.">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis.">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li><li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

Описанные здесь методы и протоколы имеют важное значение для области целевой доставки лекарств в отрицательно заряженные ткани. Из-за высокой плотности отрицательно заряженных аггреканов, присутствующих в этих тканях, создается барьер, тем самым предотвращая наркотики от достижения ...

Доставка лекарств в отрицательно заряженные ткани в организме остается проблемой из-за неспособности препаратов проникать глубоко в ткани, чтобы достичь клеток и матрицы целевыхучастков 1. Некоторые из этих тканей состоят из плотно упакованных, отрицательно заряженных аггреканов, которые создают высокую отрицательную плотность фиксированного заряда (FCD)2 в тканях и выступают в качестве барьера для доставки большинства макромолекул3,4. Однако, с помощью положительно заряженных носителей наркотиков, этот отрицательно заряженный барьер ткани действительно может быть преобразован в депо наркотиков через электростатические взаимодействия заряда для устойчивойдоставки наркотиков 1,5,6,7(Рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Рисунок 1: Зарядка на основе внутри хрящевой доставки КПК. Внутрисумаскулярная инъекция КПК в пространство коленного сустава. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженными КЦК и отрицательно заряженными аггреканическими группами обеспечивает быстрое и полное проникновение через хрящ. Эта цифра была изменена из Vedadghavami идр. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Недавно, короткой длины катиотических носителей пептида (CPCs) были разработаны с целью создания небольших катиотических доменов, способных нести больших размеров терапии для доставки в отрицательно заряженныйхрящ 4. Для эффективной доставки препарата в хрящ длялечения распространенных 8,9 и дегенеративных заболеваний, таких как остеоартрит (ОА)10, очень важно, чтобы терапевтические концентрации наркотиков проникают глубоко в ткани, где большинство клеток хряща (хондроциты)лежат 11. Хотя Есть несколько потенциальных заболеваний изменения лекарств, ни один из них получили одобрение FDA, потому что они не в состоянии эффективноцелевой хрящ 12,13. Поэтому оценка транспортных свойств носителей наркотиков необходима для прогнозирования эффективности препаратов при индуцировании терапевтического ответа. Здесь мы разработали три отдельных эксперимента, которые могут быть использованы для оценки равновесного поглощения, глубины проникновения и не равновесной скорости диффузииКПК 4.
Для обеспечения достаточной концентрации препарата в хряще, который может обеспечить оптимальный терапевтический ответ, эксперименты поглощения были разработаны для количественной оценки равновесной концентрации КТК вхряще 4. В этой конструкции, следуя равновесию между хрящом и окружающей его ванной, общее количество раствора внутри хряща (либо привязанного к матрице, либо свободного) может быть определено с помощью коэффициента поглощения. Это соотношение рассчитывается путем нормализации концентрации растворим внутри хряща к концентрации равновесия в ванне. В принципе, нейтральные растворы, диффузии которых через хрящ не помогает заряда взаимодействия, будет иметь коэффициент поглощения менее 1. И наоборот, катиотические растворы, транспортировка которых усиливается с помощью электростатических взаимодействий, показывают коэффициент поглощения, более 1. Однако, как показано с CPCs, использование оптимального положительного заряда может привести к гораздо более высоким коэффициентам поглощения (больше, чем 300)4.
Хотя высокая концентрация наркотиков в хряще имеет важное значение для достижения терапевтической пользы, также важно, чтобы препараты рассеиваются через полную толщину хряща. Таким образом, исследования, показывающие глубину проникновения необходимы для обеспечения того, чтобы наркотики достигают глубоко внутри хряща, так что матрицы и клеточных целевых сайтов могут быть достигнуты, тем самым обеспечивая более эффективную терапию. Этот эксперимент был разработан для оценки одной из способов диффузии растворим через хрящ, имитируя диффузию наркотиков в хрящ после внутрисумочковой инъекции in vivo. Флуоресценция изображения с помощью конфокальные микроскопии позволяет для оценки глубины проникновения в хрящ. Чистый заряд частиц играет ключевую роль в модерации, как глубокие наркотики могут распространяться через матрицу. Оптимальный чистый заряд, основанный на ткани FCD, необходим для того, чтобы обеспечить слабо обратимое связывающее взаимодействие между катическими частицами и матрицей анионых тканей. Это означает, что любое взаимодействие достаточно слабо, так что частицы могут отмежеваться от матрицы, но обратимы в природе, так что он может связываться с другой матрицы связывания сайта глубже вткани 4. И наоборот, чрезмерный положительный чистый заряд частицы может быть пагубным по отношению к диффузии, так как слишком сильная матричная привязка предотвращает отслоение частиц от первоначального места связывания в поверхностной зоне хряща. Это приведет к недостаточной биологической реакции, как большинство целевых участков лежат глубоко в ткани11.
Для дальнейшей количественной оценки прочности связывающих взаимодействий, анализ наркотиков диффузии ставки через хрящ является выгодным. Не равновесные исследования диффузии позволяют сравнивать показатели диффузии в режиме реального времени между различными растворами. Поскольку препараты рассеиваются через поверхностные, средние и глубокие зоны хряща, наличие связывающих взаимодействий может значительно изменить скорость диффузии. При взаимодействии между препаратами и матрицей хряща, он определяется как эффективная диффузивность (DEFF). В этом случае, как только все связывающие сайты были заняты, уровень диффузии наркотиков регулируется устойчивым состоянием диффузии (DSS). Сравнение DEFF различных растворов определяет относительную связывающую прочность растворов с матрицей. Для данного раствора,если D EFF и DSS находятся в пределах одного порядка величины, это означает, что существует минимальное связывание настоящее время между препаратом и матрицы во время диффузии. Однако,если D EFF больше, чем DSS, существенное связывание частиц с матрицей существует.
Разработанные эксперименты индивидуально позволяют характеристику растворимого транспорта через хрящ, однако, целостный анализ с включением всех результатов требуется для разработки оптимально заряженных наркотиков перевозчика. Слабый и обратимый характер взаимодействия заряда контролирует скорость диффузии частиц и обеспечивает высокое равновесное поглощение и быстрое полное проникновение глубины через хрящ. Через эксперименты по равновесному поглощению, мы должны искать носителей, которые показывают высокое поглощение в результате взаимодействия заряда, которые могут быть проверены с помощью не равновесных исследований скорости диффузии. Тем не менее, эти связывающие взаимодействия должны быть слабыми и обратимыми по своему характеру, чтобы обеспечить полно толщину проникновения раствора через хрящ. Идеальный препарат перевозчик будет обладать оптимальным зарядом, который позволяет достаточно сильным связывания для поглощения и высокой концентрации внутри хряща наркотиков, но не слишком сильны, чтобы препятствовать полной толщиныдиффузии 4. Представленные эксперименты помогут в разработке характеристик для на основе заряда ткани ориентации носителей наркотиков. Эти протоколы были использованы для характеристики транспортировки КПКчерез хрящ 4, однако, они также могут быть применены к различным препаратам и носителей наркотиков через хрящ и другие отрицательно заряженные ткани.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

Несколько отрицательно заряженных тканей в организме, как хрящ, представляют вроде барьера для целевой доставки лекарств из-за их высокой плотности отрицательно заряженных аггреканов и, следовательно, требуют усовершенствованных методов таргетинга для увеличения их терапевтической реакции. Поскольку хрящ имеет высокую отрицательную плотность фиксированного заряда, препараты могут быть изменены с положительно заряженных носителей наркотиков, чтобы воспользоваться электростатических взаимодействий, что позволяет для повышения внутри хряща наркотиков транспорта. Поэтому изучение транспортировки носителей наркотиков имеет решающее значение для прогнозирования эффективности лекарственных средств для индуцирования биологической реакции. Мы показываем дизайн трех экспериментов, которые могут количественно равновесного поглощения, глубины проникновения и не равновесной скорости диффузии катионных пептидных носителей в хряще explants. Эксперименты по поглощению равновесия обеспечивают меру концентрации раствора в хряще по сравнению с окружающей его ванной, что полезно для прогнозирования потенциала носителя препарата в повышении терапевтической концентрации наркотиков в хрящевой ткани. Глубина исследования проникновения с использованием конфокальные микроскопии позволяют визуальное представление 1D растворимой диффузии от поверхностной до глубокой зоны хряща, что важно для оценки того, растворы достигают их матрицы и клеточных целевых участков. Не равновесные исследования скорости диффузии с использованием специально разработанной транспортной камеры позволяет измерять прочность связывающих взаимодействий с матрицей тканей, характеризовав скорость диффузии флуоресцентно помеченных растворов по всей ткани; это полезно для проектирования носителей оптимальной прочности связывания с хрящом. В совокупности результаты трех транспортных экспериментов дают руководство по разработке оптимально заряженных носителей наркотиков, которые используют слабые и обратимые взаимодействия с зарядами для применения лекарственных средств. Эти экспериментальные методы также могут быть применены для оценки транспортировки наркотиков и спряжения носителей наркотиков. Кроме того, эти методы могут быть адаптированы для использования в ориентации других отрицательно заряженных тканей, таких как мениск, роговица и стекловидного юмора.

После равновесного поглощения КФУ хрящом, флуоресценция ванны уменьшается, когда раствор был поглощен тканью. Однако, если значение флуоресценции конечной ванны остается похожим на начальное, это указывает на отсутствие/минимального раствора поглощения. Еще одним подтверждением solute ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Этот протокол определяет равновесное поглощение, глубину проникновения и не равновесную скорость диффузии для катионных носителей пептида в хряще. Характеристика транспортных свойств имеет решающее значение для обеспечения эффективного биологического реагирования. Эти методы могут быть применены для разработки оптимально заряженных носителей наркотиков для ориентации отрицательно заряженных тканей.

Характеристика внутри хрящевых транспортных свойств катиоических пептидных носителей

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Характеристика транспортных свойств терапевтических средств и их носителей имеет решающее значение для обеспечения эффективных биологических реакций. Эти методы помогают в разработке оптимально заряженных носителей наркотиков для ориентации отрицательно заряженных тканей. Основным преимуществом этих методов является их способность лучше прогнозировать виво терапевтических эффективностей через серию экспериментов in vitro, которые характеризуют растворимый транспорт через ткани.Хрящевых заболеваний, таких как остеоартрит, остаются необработанными из-за неспособности препаратов проникать в плотную асосудикулярную матрицу хряща, требуя носителей наркотиков пролог терапевтической эффективности. Начните с помощью деликатной задачи протрите, чтобы аккуратно удалить избыток PBS с поверхностей диаметром три миллиметра, один миллиметр толщиной хряща explants. Используйте баланс, чтобы быстро записать мокрый вес каждого explant и немедленно поместить explants в ванну PBS для предотвращения обезвоживания.Далее добавьте 300 микролитров свежеприготовленных, 30 микромолейных флуоресцентно помеченных катионные пептидные несущего раствора на скважину к внутренним колодцам пластины 96 скважин и используйте шпатель, чтобы добавить по одному экспланту к каждому колодцу раствора. Заполните каждую из окружающих скважин 300 микролитров PBS и накройте пластину крышкой. Печать края пластины с гибкой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение и поместить пластину на шейкер в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 24 часов при 50 оборотов в минуту, с 15-миллиметровой орбиты.В конце инкубации перенесите равновесную ванну из каждой хорошо в отдельные полипропиленые трубки и сделайте серийные разбавления из запаса 30 микромоляных катиочных пептидных переносчиков для создания стандартной кривой. Затем перенесите 200 микролитров каждого раствора и стандарта в отдельные скважины черной пластины 96 скважин и получите показания флуоресценции каждого образца и стандартные на основе возбуждения и выбросов длин волн флуоресцентной этикетки. Чтобы определить глубину проникновения катионные пептид перевозчика в хрящ эксплантации, использовать скальпель сократить шесть миллиметров диаметром, один миллиметр толщиной хряща explants в два раза и гидрат в результате половины диска штук с ингибитором протея дополнен PBS.Нанесите эпоксидную смолу на центр колодеца специально разработанной одномерной транспортной камеры и закрепните половину диска в колодец с поверхностной стороной экспланта, обращенной к восходящей стороне камеры. Удалите излишки клея из колодец, чтобы предотвратить контакт с областью поверхности диффузии хряща и добавьте 80 микролитров ингибитора протеазы, дополнив PBS с обеих сторон экспланта. Pipette жидкости вверх и вниз на одной стороне explant, чтобы проверить на утечку на другую сторону.Если утечки нет, замените ингибитор протеазы, дополненный PBS с восходящей стороны, 80 микролитров 30 микромолярной флуоресценции, помеченной катическим пептидным раствором, и аккуратно поместите транспортную камеру в блюдо клеточной культуры. Обложка базы блюдо с PBS, чтобы избежать катионных пептида несущего раствора испарения. Забота о том, что нет прямого контакта между решениями из камер вверх по течению и вниз по течению.Поместите покрытое блюдо на шейкер, чтобы ограничить осаждение частиц в течение четырех или 24 часов при комнатной температуре и 50 оборотов в минуту, с 15-миллиметровой орбитой. В конце инкубации, удалить explants из камеры и вырезать около 100 микрон толщиной ломтиками из центра каждого explant. Поместите каждый кусочек explant между стеклянной слайд и крышка скольжения и гидрат ломтики со свежим ингибитором протеазы дополнен PBS.Зафиксировать слайд на стадии конфокального микроскопа и получить стек флуоресцентных изображений через полную толщину ломтика при увеличении 10X. Откройте файл изображения и изображение J, нажмите изображение, а также выберите стеки и проект из меню высадки. Затем ввемите номера среза от одного до последнего среза и под типом проекции выберите среднюю интенсивность и нажмите Кнопку Хорошо.Для оценки не равновесной катионической скорости диффузии хряща пептидного носителя, соберите каждую половину транспортной камеры, чтобы включить одну большую резиновую прокладку, одну вставку полиметилметакрилата и одну небольшую резиновую прокладку. Измерьте толщину explant хряща, после этого поместите explant в колодцах пластичной вставки с поверхностной поверхностью смотря на камеру вверх по течению и зажатие 2 половинки совместно для того чтобы завершить агрегат. Используйте гаечный ключ, чтобы плотно винт половинки вместе перед заполнением вверх по течению камеры с двумя миллилитров ингибитора протеазы дополнены PBS.Проверьте камеру вниз по течению на наличие утечки из камеры вверх по течению. Если утечка не обнаружена, заполните камеру вниз по течению двумя миллилитров ингибитора протеазы, дополненного PBS. Добавьте одну мини-бар для перемешивания как в камеры вверх, так и вниз по течению и поместите камеру на пластину перемешивания с выровненной камерой таким образом, чтобы лазер из спектрофотометра был направлен к центру камеры ниже по течению.С частью приемника сигнала спектрофотометра за камерой вниз по течению, собирать стабильные, в режиме реального времени вниз по течению флуоресценции показания выбросов, по крайней мере пять минут. После получения стабильного чтения, добавить предварительно рассчитанный объем флуоресцентно помечены катионом пептид перевозчика стокового раствора в вверх по течению камеры к окончательной концентрации ванны три микромолара, и контролировать вниз по течению флуоресцентный сигнал, позволяя растворить транспорта для достижения устойчивого увеличения склона. Как только устойчивое состояние будет достигнуто, перенесите 20 микролитров раствора из камеры вверх по течению в камеру вниз по течению для проверки всплеска и соберите показания флуоресценции в режиме реального времени вниз по течению.Слишком высокий положительный заряд ограничит проникновение раствора в поверхностную зону, так как носитель слишком сильно связывается с отрицательно заряженными аггреканские группы матрицы хряща. И наоборот, носители, способные воспользоваться слабыми и обратимыми взаимодействиями заряда, проникают через глубокую зону ткани. Оптимально заряженный препарат перевозчик, однако, будет не только проникать в глубокие зоны ткани, но и продемонстрировать высокий внутриматочное поглощение, которое может быть определено с помощью измерений флуоресценции равновесной ванны и влажного веса тканей, как показано на примере.Не равновесные транспортные эксперименты по диффузии приводят к кривой, генерируемой данными, с постепенно увеличивающейся наклоном. Начальная часть кривой представляет собой растворимое диффузию через хрящ по мере возникновения соляных матричных связывающих взаимодействий. Как только растворы достигают камеры вниз по течению, наклон кривой увеличивается по мере увеличения показаний флуоресценции с течением времени.Эта вторая часть кривой достигает устойчивого наклона, что представляет собой устойчивую диффузию состояния. X-перехват касательной линии, нарисованной в устойчивой части кривой, указывает время, необходимое для достижения стабильной диффузии состояния или тау-лага. После переноса раствора из восходящего потока в камеру ниже по течению наблюдается всплеск флуоресценции, после чего стабилизированная интенсивность флуоресценции может быть использована для корреляции флуоресценции с концентрацией.Репрезентативная эффективная диффузивность и устойчивые значения диффузии состояния могут быть рассчитаны, как указано. Обратите внимание, что устойчивая диффуктивность состояния на два порядка выше, чем эффективная диффуктивность в результате того, что все сайты связывания, основанные на заряде, заняты. Таким образом, на данный момент диффузия основана на размере, а не заряда, в результате чего аналогичные устойчивые значения диффузии состояния среди CPCs того же размера.Поддержание гидратации explant и минимизация испарения раствора на протяжении всего эксперимента, чтобы предотвратить изменения в морфологии хряща и концентрации раствора, соответственно, и обеспечить точное и воспроизводимое получение данных. После разработки оптимально заряженных носителей наркотиков, различные методы спряжения могут быть использованы для модификации препаратов для повышения ориентации тканей и для облегчения оценки их биологической эффективности.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

В Ситу отображение механических свойств биопленок частицей отслеживания микрореология

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

Транспортные свойства ибупрофена инкапсулируется в циклодекстрин Nanosponge гидрогелей: Протон HR-MAS ЯМР-спектроскопия Исследование

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Доставки терапевтических миРНК в ЦНС с использованием катионных и анионных липосом

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Синтез ориентации Моноцит пептидные Амфифильность мицелл для визуализации атеросклероза

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Культивирование клеток млекопитающих в трехмерной пептид подмости

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Поколение катионного Nanoliposomes для эффективной доставки в Vitro транскрипции РНК

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Проектирование пористого кремния фильмы как носители фактора роста нервов

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...