Name: characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Detta arbete finansierades av United States Department of Defense genom Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) enligt kontrakt W81XWH-17-1-0085, och National Institute of Health R03 EB025903-1. AV finansierades av College of Engineering Dean's Fellowship vid Northeastern University.

Universitetsgodkännanden erhölls för att utföra experimenten med döda vävnader. Fogar för nötkreatur erhölls kommersiellt från ett slakteri.
1. Utsug av explant av brosk
<ol><li>Med hjälp av en skalpell (#10 blad), klippa och ta bort fett, muskler, ligament, senor och alla andra bindväv för att exponera brosket från femoropatellar spåret av nötkreatur knäleder.</li>
	<li>Använd 3 mm och 6 mm dermal stansar, gör vinkelräta stansar i brosket för att extrahera cylindriska p...

<ol>
	<li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-targeting+drug+delivery:+can+electrostatic+interactions+help.">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li><li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+solutes+through+cartilage:+permeability+to+large+molecules.">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).</li><li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis.">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li><li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues.">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li><li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., &#214;nnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+(IL-1Ra)+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture.">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 21 (1), 238 (2019).</li><li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers:+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins.">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898 (2020).</li><li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectricity+for+Drug+Delivery:+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics.">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li><li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+of+the+knee.">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li><li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease.">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li><li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+osteoarthritis.">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+articular+cartilage:+Structure,+composition,+and+function.">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee:+A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li><li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind+study+of+AMG+108+(a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1)+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee.">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).</li><li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+intra-articular+therapy.">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li><li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs.">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage.">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li><li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term.">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery.">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882 (2020).</li><li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention.">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li><li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis.">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li><li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage.">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li><li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media.">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage:+Application+of+multi-zone+finite-bath+model.">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li><li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage.">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li><li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate.">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li><li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration,+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints.">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li><li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis.">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 341-364 (2017).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Men+and+Elephants:+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass.">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).</li><li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee.">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li></ol>

De metoder och protokoll som beskrivs här är betydande för området riktade drug delivery till negativt laddade vävnader. På grund av den höga tätheten av negativt laddade aggrecans som finns i dessa vävnader, skapas en barriär, vilket förhindrar droger från att nå sina cellulära målplatser som ligger djupt inom matrisen. För att ta itu med denna enastående utmaning, läkemedel kan ändras för att införliva positivt laddade narkotikabärare som kan förbättra transporthastigheten, upptag och bindning a...

Drug-leverans till negativt laddade vävnader i kroppen är fortfarande en utmaning på grund av oförmåga läkemedel att tränga djupt in i vävnaden för att nå cell och matris mål platser1. Flera av dessa vävnader består av tätt packade, negativt laddade aggrecans som skapar en hög negativ fast laddningstäthet (FCD)2 inom vävnaden och fungerar som en barriär för leverans av de flesta makromolekyler3,4. Men med hjälp av positivt laddade läkemedelsbärare kan denna negativt laddade vävnadsbarriär faktiskt omvandlas till en läkemedelsdepå via elektrostatiska laddningsinteraktioner för ihållandeläkemedelsleverans 1,5,6,7( Figur1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Bild 1: Avgiftsbaserad intrabroskleverans av CPC. Intra-artikulära injektion av CPCs i knäleden utrymme. Elektrostatiska interaktioner mellan positivt laddade CPCs och negativt laddade aggrecan grupper möjliggör snabb och full djup penetration genom brosk. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Nyligen, kort längd katjoniska peptid bärare (CPCs) utformades med målet att skapa små katjonska domäner som kan bära större storlek therapeutics för leverans till negativt laddade brosk4. För effektiv läkemedelstillförsel till brosket för behandling av förhärskande8,9 och degenerativa sjukdomar som artros (OA)10, är det kritiskt att terapeutiska koncentrationer av läkemedel tränger djupt inne i vävnaden, där en majoritet av broskcellerna (chondrocytes) ligger11. Även om det finns flera potentiella sjukdom modifiera läkemedel tillgängliga, ingen har fått FDA godkännande eftersom dessa inte kan effektivt rikta brosk12,13. Därför är utvärdering av läkemedelsbärares transportegenskaper nödvändig för att förutsäga effektiviteten av läkemedel för att inducera ett terapeutiskt svar. Här har vi utformat tre separata experiment som kan utnyttjas för bedömning av jämviktsupptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastigheten av CPCs4.
För att säkerställa att det finns en tillräcklig läkemedelskoncentration inom brosket som kan ge ett optimalt terapeutiskt svar, var upptagsexperiment utformade för att kvantifiera jämvikt CPC-koncentration i brosk4. I denna utformning, efter en jämvikt mellan brosket och dess omgivande bad, kan den totala mängden solute inuti brosket (antingen bunden till matrisen eller gratis) bestämmas med hjälp av ett upptagsförhållande. Detta förhållande beräknas genom att normalisera koncentrationen av solutes inuti brosket till det i jämviktsbadet. I princip skulle neutrala solutes, vars diffusion genom brosket inte bistås av laddningsinteraktioner, ha ett upptagsförhållande på mindre än 1. Omvänt visar katjoniska solutes, vars transport förstärks via elektrostatiska interaktioner, ett upptagsförhållande som är större än 1. Som visas med CPCs kan dock användning av en optimal positiv laddning resultera i mycket högre upptagskvoter (större än 300)4.
Även om hög läkemedelskoncentration inom brosket är viktigt för att uppnå terapeutisk nytta, är det också kritiskt att läkemedel diffusa genom full tjocklek av brosket. Därför krävs studier som visar inträngningsdjupet för att säkerställa att läkemedel når djupt inom brosket så att matrisen och cellulära målställen kan nås, och därigenom ge en mer effektiv terapi. Detta experiment var utformad för att bedöma enkelriktad diffusion av solutes genom brosk, simulera diffusion av läkemedel i brosk efter intra-artikulära injektion in vivo. Fluorescens imaging med hjälp av confocal mikroskopi möjliggör utvärdering av djup av penetration i brosk. Nettopartikelladdning spelar en nyckelroll i moderering hur djupa droger kan sprida sig genom matrisen. En optimal nettoladdning baserad på en vävnad FCD krävs för att möjliggöra svag-reversibla bindande interaktioner mellan katjonpartiklar och den anjoniska vävnadsmatrisen. Detta innebär att all interaktion är tillräckligt svag så att partiklar kan ta avstånd från matrisen men reversibla i naturen så att den kan binda till en annan matrisbindningsplats djupare inomvävnaden 4. Omvänt kan överdriven positiv nettoladdning av en partikel vara skadlig mot diffusion, eftersom för stark matrisbindning förhindrar avlossning av partiklar från det initiala bindningsstället i broskens ytliga zon. Detta skulle resultera i en otillräcklig biologisk reaktion eftersom en majoritet av målplatserna ligger djupt inne i vävnaden11.
För att ytterligare kvantifiera styrkan i de bindande interaktionerna är analys av läkemedelsdiffusionshastigheter genom brosk fördelaktig. Icke-jämviktsdiffusionsstudier möjliggör jämförelse av spridningshastigheter i realtid mellan olika solutes. Som läkemedel diffusa genom de ytliga, mellersta och djupa zoner av brosk, kan förekomsten av bindande interaktioner kraftigt förändra diffusion priser. När bindningsinteraktioner förekommer mellan läkemedel och broskmatrisen definieras den som den effektiva diffusiviteten (DEFF). I detta fall, när alla bindningsställen har ockuperats, styrs diffusionshastigheten av droger av den stadiga-statliga diffusionen (DSS). Jämförelse mellan DEFF av olika solute bestämmer den relativa bindningsstyrkan för solutes med matrisen. För en given solute, om DEFF och DSS är inom samma storleksordning, innebär det att det finns minimal bindning närvarande mellan läkemedlet och matrisen under diffusion. Men om DEFF är större än DSS, betydande bindning av partiklar till matris finns.
De utformade experimenten möjliggör individuellt karakterisering av solute transport genom brosket, men en holistisk analys inklusive alla resultat krävs för att utforma en optimalt laddad drogbärare. Den svaga och reversibla karaktären av laddningsinteraktioner styr partikeldifningshastigheten och möjliggör hög jämviktsupptag och snabb fulldjupspenetration genom brosk. Genom jämviktsupptagsexperiment bör vi leta efter bärare som visar högt upptag som ett resultat av laddningsinteraktioner som kan verifieras med hjälp av icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier. Dessa bindande interaktioner bör dock vara svaga och reversibla i naturen för att möjliggöra full-tjocklek penetration av solute genom brosk. En idealisk läkemedelsbärare skulle ha en optimal laddning som möjliggör tillräckligt stark bindning för upptag och höga intrabrosk läkemedelskoncentrationer, men inte för stark för att hindra full-tjocklek diffusion4. De presenterade experimenten kommer att bistå i konstruktionsegenskaperna för laddningsbaserad vävnad som riktar sig mot läkemedelsbärare. Dessa protokoll användes för att karakterisera CPC transport genom brosk4, men dessa kan också tillämpas på en mängd olika läkemedel och bärare läkemedel genom brosk och andra negativt laddade vävnader.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>316 Stainless Steel SAE Washer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91950A044</td>
			<td>For number 5 screw size, 0.14&#34; ID, 0.312&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polystyrene Plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12566620</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Thick Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cartilage</td>
			<td>Research 87</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2-3 weeks old, femoropatellar groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP671-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+14</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1524</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+20</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1525</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC+8</td>
			<td>LifeTein</td>
			<td>LT1523</td>
			<td>Custom designed peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Punch</td>
			<td>MedBlades</td>
			<td>MB5-1</td>
			<td>3, 4 and 6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12550A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td>Clear, 96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Seal Cover Glass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6378701</td>
			<td># 1.5, 18x18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A15</td>
			<td>1/2&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer-Driven Hole Punch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3427A19</td>
			<td>3/4&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>AT480/30m</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Strength Steel Hex Nut</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90480A007</td>
			<td>6-32 Thread size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Bel-Art Spinbar</td>
			<td>F37119-0007</td>
			<td>7x2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Neoprene Rubber Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1370N12</td>
			<td>1/32&#34; Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Fat Dried Bovine Milk</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CGN1802145</td>
			<td>150 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CMR</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet</td>
			<td>Reynolds Polymer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black transport chamber inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTV Silicone</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234323</td>
			<td>Epoxy, Non-corrosive, clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>549-3</td>
			<td>#10, #11 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Receiver</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET515lp</td>
			<td>Spectrophotometer Laser Signal Receiver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>13508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A153</td>
			<td>6-32 Thread size, 1&#34; Long</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of intra-cartilage transport properties of cationic peptide carriers

Flera negativt laddade vävnader i kroppen, som brosk, utgör ett hinder för den riktade läkemedelsleveransen på grund av deras höga densitet av negativt laddade aggrecans och kräver därför förbättrade inriktningsmetoder för att öka deras terapeutiska svar. Eftersom brosk har en hög negativ fast laddningstäthet, läkemedel kan modifieras med positivt laddade läkemedelsbärare att dra nytta av elektrostatiska interaktioner, vilket möjliggör förbättrad intra-brosk läkemedelstransport. Att studera transport av läkemedelsbärare är därför avgörande för att förutsäga effekten av läkemedel för att inducera ett biologiskt svar. Vi visar utformningen av tre experiment som kan kvantifiera jämvikt upptag, djup penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet av katjonska peptid bärare i brosk explants. Jämviktsupptag experiment ger ett mått på den solute koncentrationen inom brosket jämfört med dess omgivande bad, vilket är användbart för att förutsäga potentialen hos en läkemedelsbärare för att förbättra terapeutisk koncentration av läkemedel i brosk. Djup av penetrationsstudier med hjälp av konfokalmikroskopi möjliggör visuell representation av 1D-solute diffusion från den ytliga till djupa zonen av brosk, vilket är viktigt för att bedöma om solutes når sin matris och cellulära mål platser. Icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier med användning av en specialdesignad transportkammare möjliggör mätning av styrkan i bindningsinteraktioner med vävnadsmatrisen genom att karakterisera diffusionshastigheterna för fluorescerande märkta solutes över vävnaden; detta är fördelaktigt för att utforma bärare av optimal bindningsstyrka med brosk. Tillsammans ger de resultat som erhållits från de tre transportexperimenten en riktlinje för att utforma optimalt laddade läkemedelsbärare som utnyttjar svaga och reversibla laddningsinteraktioner för läkemedelsleveransapplikationer. Dessa experimentella metoder kan också tillämpas för att utvärdera transport av narkotika och drug-drug carrier konjugater. Vidare kan dessa metoder anpassas för användning i inriktning andra negativt laddade vävnader såsom menisk, hornhinnan och glasaktig humor.

Efter jämvikt absorption av CPCs genom brosk, badet fluorescens minskar när solute har tagits upp av vävnaden. Om det slutliga badet fluorescensvärde förblir likt initialen, tyder det dock på att det inte finns något/minimalt upptag av utskänk. En annan bekräftelse på solute upptag är om vävnaden har synligt bytt färg till färgen på fluorescerande färgämnet. Det kvantitativa upptaget av solutes i brosk bestämdes med hjälp av upptagningsförhållandet (RU) efter att fluorescensvärdena omvand...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers at JoVE.com

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Detta protokoll bestämmer jämvikt upptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet för katjoniska peptid bärare i brosk. Karakterisering av transportegenskaper är avgörande för att säkerställa en effektiv biologisk respons. Dessa metoder kan tillämpas för att utforma en optimalt laddade läkemedelsbärare för inriktning negativt laddade vävnader.

Karakterisering av Intra-Brosk Transport Egenskaper av Cationic Peptid Bärare

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Att karakterisera transportegenskaperna hos therapeutics och deras bärare är avgörande för att säkerställa effektiva biologiska reaktioner. Dessa metoder stöd för att utforma optimalt laddade läkemedelsbärare för inriktning negativt laddade vävnader. Den största fördelen med dessa tekniker är deras förmåga att bättre förutsäga in vivo terapeutiska effekt genom en serie av in vitro-experiment som kännetecknar solute transport genom vävnad.Brosksjukdomar, såsom artros, förblir obehandlade på grund av oförmåga av läkemedel att penetrera den täta avaskulära broskmatrisen, som kräver läkemedelsbärare till prolog terapeutisk effekt. Börja med att använda en känslig uppgift torka för att försiktigt ta bort överskott PBS från ytorna av tre millimeter diameter, en millimeter tjock brosk explants. Använd en balans för att snabbt registrera den våta vikten av varje explant och omedelbart placera explants i ett PBS-bad för att förhindra uttorkning.Därefter lägger du till 300 mikroliter av nyberedda, 30 mikromolar fluorescerande märkt katjonkedpbärare lösning per brunn till de inre brunnarna i en 96-brunnsplatta och använd en spatel för att lägga till en explant till varje brunn av lösning. Fyll var och en av de omgivande brunnarna med 300 mikroliter PBS och täck plattan med lock. Täta kanterna på plattan med flexibel film för att minimera avdunstning och placera plattan på en shaker i en 37 grader Celsius inkubator i 24 timmar på 50 varv per minut, med en 15 millimeters bana.Vid slutet av inkubationen, överför jämviktsbadet från varje brunn in i enskilda polypropylenrör och gör serieutspädningar från beståndet 30 mikromolärjonisk peptidbärarlösning för att generera en standardkurva. Därefter överför du 200 mikroliter av varje lösning och standard i enskilda brunnar av en svart 96-brunnsplatta och erhåll fluorescensavläsningar av varje prov och standard baserat på glödnings- och emissionsvåglängderna på lysetiketten. För att bestämma djupet av katjoner peptid bärare penetration inom en brosk explant, använd en skalpell för att skära sex millimeter diameter, en millimeter tjock brosk explants i hälften och hydrat den resulterande halv-skiva bitar med proteus hämmare kompletteras PBS.Applicera epoxi till mitten av en brunn av en specialdesignad endimensionell transportkammare och säkra en halv-disk explant inom brunnen med den ytliga sidan av explanten som vetter mot uppströms sidan av kammaren. Avlägsna eventuellt överskott av lim från brunnen för att förhindra kontakt med broskens diffusionsyta och tillsätt 80 mikroliter av proteashämmare kompletterad PBS till båda sidor av explanten. Pipettera vätskan upp och ner på ena sidan av explanten för att kontrollera om läckage till den andra sidan.Om inget läckage finns, byt ut proteashämmare kompletterat PBS från uppströmssidan med 80 mikroliter av 30 mikromolarfluorescens märkt katjonisk peptidbärarlösning och försiktigt placera transportkammaren i en cellkulturskål. Täck basen av skålen med PBS för att undvika katjonisk peptidbärarlösning avdunstning. Var försiktig så att det inte finns någon direkt kontakt mellan lösningarna från kamrarna uppströms och nedströms.Placera den täckta skålen på en skakseder för att begränsa partikelsedimentering i fyra eller 24 timmar vid rumstemperatur och 50 varv per minut, med en 15 millimeters omloppsbana. I slutet av inkubationen, ta bort explants från kammaren och skär cirka 100 mikron tjocka skivor från mitten av varje explant. Placera varje skiva explant mellan en glasrutschkana och en täckglidning och återfukta skivorna med färsk proteashämmare kompletterad PBS.Fixera bilden på scenen i ett konfokalmikroskop och få en Z-stapel av fluorescerande bilder genom hela tjockleken på skivan vid 10X förstoring. Öppna bildfilen och bilden J, klicka på Bild och välj Stackar och Z Project på dropdown-menyn. Sedan matar du in segmentnumren från ett till det sista segmentet och under Projektionstyp, väljer du genomsnittlig intensitet och klickar på Okej.För att bedöma icke-jämviktsjonium catione bärare brosk diffusion hastighet, montera varje halva av transportkammaren, att inkludera en stor gummipackning, en polymetylmetakrylat infoga, och en liten gummipackning. Mät tjockleken på en brosk explant, sedan placera explant i brunnarna i plastinsatsen med den ytliga ytan som vetter mot uppströms kammaren och smörgås de två halvorna tillsammans för att slutföra monteringen. Använd en skiftnyckel för att tätt skruva ihop halvorna innan du fyller uppströms kammaren med två milliliter proteashämmare kompletteras PBS.Kontrollera nedströmskammaren för läckage från kammaren uppströms. Om inget läckage upptäcks, fyll nedströmskammaren med två milliliter proteashämmare kompletterad PBS. Lägg till en enda mini stir bar till både upp och nedströms kamrarna och placera kammaren på en omrörning platta med kammaren i linje så att lasern från spektrofotometern är inriktad mot mitten av nedströms kammaren.Med signalmottagaren del av spektrofotometern bakom nedströms kammaren, samla stabil, realtime nedströms fluorescens utsläpp avläsningar i minst fem minuter. Efter att ha erhållit en stabil avläsning, tillsätt en förberäknad volym fluorescerande märkt katjonkedp carrier stamlösning till uppströms kammaren till en slutlig badkoncentration av tre mikromolar, och övervaka nedströms fluorescerande signal samtidigt som den solute transport att nå en stadig ökning av lutningen. När ett stabilt tillstånd har uppnåtts, överför 20 mikroliter lösning från uppströms kammaren till nedströms kammaren för en spik test och samla in realtid nedströms fluorescens avläsningar.För hög en positiv laddning kommer att begränsa solute penetration till den ytliga zonen som transportören binder alltför starkt till negativt laddade aggrecan grupper av broskmatrisen. Omvänt, bärare som har möjlighet att dra nytta av svaga och reversibla laddning interaktioner tränga igenom den djupa zonen av vävnad. En optimalt laddad läkemedelsbärare skulle dock inte bara penetrera de djupa zonerna av vävnad, men skulle också visa en hög intra-vävnad upptag, som kan bestämmas med hjälp av fluorescens mätningar av jämvikt bad och vävnad våtvikt, som visas.Icke-jämviktsdiffusionstransportexperiment resulterar i en datagenererad kurva med en gradvis ökande lutning. Den inledande delen av kurvan representerar solute diffusion genom brosket som solute matris bindande interaktioner förekommer. När solutes når nedströms kammaren, lutningen av kurvan ökar som fluorescens avläsningar ökar med tiden.Denna andra del av kurvan når sedan en stadig lutning, som representerar steady state diffusion. X-intercept av en tangentiell linje dras vid steady state delen av kurvan visar den tid det tar att nå steady state diffusion eller tau lag. Efter lösningsöverföring från uppströms till nedströmskammaren observeras en topp i fluorescens, vid vilken tidpunkt den stabiliserade fluorescensintensiteten kan användas för att korrelera fluorescensen till koncentrationen.De representativa effektiva diffusiviteten och steady state diffusionvärdena kan sedan beräknas, som angivelser. Observera att steady state diffusivity är två storleksordningar högre än den effektiva diffusivity som ett resultat av alla de laddningsbaserade bindningsställen som ockuperas. Således, på denna punkt, är diffusion baserad på storlek och inte avgift, vilket resulterar i liknande steady state diffusion värden bland CPCs av samma storlek.Bibehåll explant hydrering och minimera lösningsförångning under hela experimentet för att förhindra förändringar i broskmorfologin respektive lösningskoncentrationen och för att säkerställa korrekt och reproducerbar datainsamling. Efter utformningen av en optimalt laddade läkemedel bärare, olika konjugering tekniker kan utnyttjas för att modifiera läkemedel för förbättrad vävnad inriktning och för att underlätta utvärdering av deras biologiska effekt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In situ Kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos Biofilmer av Partikel-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

Transportegenskaper Ibuprofen inkapslad i cyklodextrin Nanosponge Hydrogeler: en proton HR-MAS NMR-spektroskopi Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Syntesen av monocyt-targeting peptid Amphiphile miceller för avbildning av ateroskleros

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation av katjoniska Nanoliposomes för effektiv leverans av In Vitro transkriberas budbärar-RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Utforma porösa Silicon filmer som bärare av nervtillväxtfaktor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...