Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

يعترف المؤلفان بأموال بدء العمل في جامعة فاندربيلت وجائزة المعاهد القومية للصحة (R01GM117191) لـ RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

cPILOT هي استراتيجية متعددة متعددة المحسنة التي يمكن أن تحليل ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة. تعتمد القدرة المتعددة على عدد مجموعات العلامات النظائرية وال Isobaric المتاحة. إدخال TMTpro7، التي هي قادرة على وضع علامات 16 عينات في تجربة واحدة ، يمكن أن تدفع حدود cPILOT إلى 32-plex. يتكون cPILOT من خطوات متعددة من الأنابيب ويتطلب رعاية واسعة ومهارات المستخدم لأداء إعداد العينة. حتى مع وجود مستخدم خبير ، فإن الأخطاء اليدوية أمر لا مفر منه ، مما يدعو إلى استخدام الأنظمة الأساسية الروبوتية لمعالجة العينات في استراتيجية cPILOT. منذ CPILOT يستخدم علامات pH تعتمد على الببتيدات، يجب الحفاظ على مادة PH للضوء ومجموعة من العينات dimethylated الثقيلة. يمكن أن يؤدي الأسي الحمضية الخفيفة إلى تينيثيليشن لكل من بقايا N-termini والليسين. ميزة من cPILOT هو أنه يتطلب سوى نصف علامات isobaric منذ الببتيد N-termini مشغولة مع مجموعات ثنائي الفينيل. وهذا يتيح لعدد أكبر من العينات أن تحمل علامات نصف التكلفة. يتطلب التعامل مع أعداد العينات الأكبر أن تكون أوقات التعرض للكاشف متشابهة للعينة الأولى والأخيرة في دفعة. يمكن الحصول على موزع ماصة يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 32 عينة بالتوازي مع استخدام أجهزة معالجة السائل الروبوتية.
من أجل معالجة عينات متعددة من قبل cPILOT ، تم تعديل سير العمل اليدوي لدمج التشغيل الآلي. معالج السائل الروبوتية المستخدمة في هذه الدراسة اثنين من القرون مع 96 قناة و 8 قنوات الأنابيب القدرات، مع القابض لوضع لوحات في المواقع المتاحة سطح السفينة 28. يتم دمج معالج السائل مع جهاز الضغط الإيجابي، شاكر المدارية، وجهاز لتسخين / تبريد العينات في لوحة 96 جيدا. ويساعد جهاز الضغط الإيجابي في إجراء عمليات التبادل العازلة في لوحات SPE أثناء التنظيف، بينما يساعد الشاكر المداري على الدوامة/خلط العينات. تمت برمجة المنصة الروبوتية لتسفط وصرف المخازن المؤقتة والعينات إلى 96 بئرًا، واحتضان، وعينات دوامة، ولوحات نقل. السوائل ذات اللزوجة المختلفة، مثل الأسيتونيتريل والماء، تتطلب اعتبارات محددة الأنابيب التي يمكن أيضا أن تكون مبرمجة في الطريقة.
وقد تم تنفيذ سير عمل cPILOT ، بدءا من القياس الكمي للبروتين من قبل BCA إلى وضع العلامات الببتيدات مع علامات الايسوباريك (أي TMT) على نظام معالج السائل. تم تحجيم البروتوكول الكامل لاستخدام 96 لوحات بئر عميق يمكن أن تعقد 2 مل في البئر. وقد أعدت المخازن المؤقتة قبل بدء التجربة وأضيفت إلى لوحة البئر 96 بحيث تسمح بمعالجة العينات المتوازية. في هذه الدراسة، 22 تكرار سير العمل من التجانس الكبد الماوس تمت إضافتها إلى لوحات البئر العميق واتخذت من خلال بروتوكول cPILOT. وأخيرا، تم حقن عينة واحدة تتكون من الكبد 22-plex ماوس ثنائي الببتيدات الموسومة في مطياف الكتلة. أظهرت كثافة أيونات المراسل المقابلة لوفرات الببتيد في العينات أن العينات المعالجة مع معالج السائل لديها السير الذاتية أقل من البروتوكول اليدوي(البيانات غير مبينة). كما حسنت المنصة الروبوتية إلى حد كبير إمكانية إعادة إنتاج معالجة العينات. إن قابلية التكاثر والمتانة عاملان هامان للغاية أثناء معالجة أعداد كبيرة من العينات. يمكن أن تؤدي أخطاء الأنابيب إلى تفسير خاطئ كامل للبيانات وهنا وفرت منصة الروبوتية تباينًا منخفضًا بين العينات. كما أن استخدام النظام الأساسي الروبوتي لـ cPILOT قلل من الوقت اللازم لإعداد العينات. على سبيل المثال، بعد تطوير الطريقة الآلية، تطلب الأمر 2.5 ساعة لمعالجة 22 عينة مقارنة بـ 7.5 ساعة لـ cPILOT اليدوي. التجارب مستمرة في مختبرنا لإجراء مزيد من التقييم مقارنات سير العمل اليدوي والآلي cPILOT. استنادا إلى التقارير السابقة من مختبرنا، والسيرة الذاتية٪، من البروتين مراسل كثافة الأيونات في cPILOT اليدوي كانت في المتوسط 20٪ مع بعض القيم المتطرفة تتجاوز هذه القيمة12.
cPILOT هي استراتيجية اشتقاق كيميائية على مستوى الببتيد، يمكن استخدامها لأي نوع من العينات مثل الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم. cPILOT يقدم متعددة العينة المحسنة ومع دمج الأتمتة يمكن أن يسهل multixing عينة عالية الإنتاجية في proteomics. هذا الإنتاج ضروري للمضي قدما في المرض والفهم البيولوجي واكتشاف العلامات البيولوجية.

إن البروتيومات التي تعتمد على قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة بحثية لا غنى عنها في تحديد المؤشرات الحيوية الخاصة بأمراض معينة، وفهم تطور المرض، وخلق خيوط للتنمية العلاجية. ويمكن تحقيق ذلك من مجموعة من العينات السريرية المرتبطة بالأمراض مثل مصل الدم / البلازما ، والسوائل القريبة ، والأنسجة1،2. وقد اكتسبت مؤخرا اكتشاف العلامات الحيوية للبروتيوميات والتحقق من أهمية نظرا كبيرا نظرا لقوة استراتيجيات تعدد العينات3،4. تعدد الأساليب هو تقنية تمكن من المقارنة في وقت واحد وتكميم اثنين أو أكثر من حالات العينة داخل حقن MS واحد5،6. يتم تحقيق تعدد العينات عن طريق التكويد الببتيدات أو البروتينات من عينات متعددة مع العلامات الكيميائية أو الأنزيمية أو الأيضية والحصول على معلومات التصلب المتعدد من جميع العينات في تجربة MS /MS/MS واحدة. من بين العلامات isobaric المتاحة هي الكواشف الاليوبات (iTRAQ) ، والعلامات كتلة جنبا إلى جنب التجارية (TMT) ، وفي المنزل توليفها isobaric N ، N - dimethyl leucine (DiLeu) الكواشف مع قدرات تصل إلى 16 - plex7 و 21 - plex8، على التوالي.
السلائف الملصقات النظائرية ووضع علامات الايسوباريك (cPILOT) هو نموذج المحسنة تكنولوجيا تعدد. يجمع cPILOT بين وضع العلامات النظيرية للببتيد N-termini مع الضوء [−(CH3)2] والثقيلة [−(13C2H3)2] نظائر في درجة حَوية منخفضة (∼2.5)، والتي تحافظ على بقايا الليسين المتاحة للعلامة الهيدروجينية العالية اللاحقة (8.5) الوئيب باستخدام TMT، DiLeu، أو iTRAQ وضع العلامات3،9،10،11،12،13،14. ويصور مخطط وضع العلامات المزدوجة لاستراتيجية cPILOT في الشكل التكميلي 1 مع عينتين باستخدام الببتيد كمثال. يمكن أن تكون دقة ودقة القياس الكمي TMT على مستوى MS2 عرضة للخطر بسبب وجود أيونات مُنْعزلة ومُتَقَدَّدة مُنْثَلِية تُـعَدُّ تأثير التداخل15. ويمكن التغلب على هذا القيد في نسب أيونات المراسل غير الدقيقة بمساعدة مطياف الكتلة ثلاثية الزفير أوربيراب. على سبيل المثال، يمكن التغلب على تأثير التداخل عن طريق عزل الذروة في زوج من ثنائي الديمثيلات عند مستوى MS1 في مطياف الكتلة، مع إخضاع الذروة الخفيفة أو الثقيلة لتجزئة MS2 في فخ أيون الخطي ثم إخضاع الجزء MS2 الأكثر كثافة للحصول على معلومات كمية. من أجل زيادة فرص اختيار الببتيدات دون أمينات ليسين المتاحة لتوليد الأيونات مراسل، واقتناء انتقائي MS3 على أساس y-1 جزء يمكن أيضا أن تستخدم وهو النهج الذي يمكن أن يؤدي إلى نسبة أعلى من الببتيدات قابلة للقياس الكمي مع cPILOT9. مزيج من الضوء والثقيلة وضع العلامات يزيد من قدرات تعدد العينات من قبل عامل من 2x إلى أن يتحقق مع العلامات isobaric الفردية. لقد استخدمنا مؤخرا cPILOT للجمع بين ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة مع الكواشف DiLeu16. بالإضافة إلى ذلك وقد استخدمت cPILOT لدراسة الأكسدة بعد التعديلات الانتقالية14 بما في ذلك nitration البروتين17, proteomes العالمية الأخرى9, وقد أظهرت تطبيقات عبر عينات أنسجة متعددة في نموذج فأر مرض الزهايمر11.
إعداد العينة القوية هي خطوة حاسمة في تجربة cPILOT ويمكن أن تستغرق وقتًا طويلاً وشاقاً وواسع النطاق. يتطلب تعدد العيّنات المُحسّن أن يكون مُعدّلًا واسع النطاق من العاملين في المختبرات ذوي المهارات العالية، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قابلية إعادة إنتاج التجربة. على سبيل المثال، من الضروري التعامل بعناية مع العينات لضمان أوقات رد فعل مماثلة لجميع العينات وللحفاظ على درجة الH الاحتياطية المناسبة للعينات الخفيفة والثقيلة الباهتة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إعداد عشرات إلى مئات العينات يدوياً إلى حدوث خطأ تجريبي مرتفع. ولذلك ، للحد من إعداد عينة من التباين ، وتحسين الدقة الكمية ، وزيادة الإنتاجية التجريبية ، وضعنا سير العمل cPILOT الآلي. يتحقق الأتمتة باستخدام جهاز معالجة سائلة آلية يمكن أن تكمل العديد من جوانب سير العمل (الشكل 1). تم إعداد العينة من القياس الكمي للبروتين إلى وضع العلامات الببتيد على معالج سائل آلي. يتم دمج معالج السائل الآلي مع جهاز الضغط الإيجابي (PPA) لتبادل العازلة بين الطور الصلب استخراج لوحات (SPE)، شاكر المدارية، وجهاز التدفئة / التبريد. تحتوي المنصة الروبوتية على 28 موقعًا للتخزين لاستيعاب اللوحات والمخازن المؤقتة. هناك نوعان من القرون مع القابض لنقل لوحات داخل مواقع سطح السفينة: 96 قناة رئيس الأنابيب ذات حجم ثابت (5-1100 ميكرولتر) و 8 مسابير حجم متغير قناة (1-1000 μL). يتم التحكم في النظام الأساسي الروبوتي باستخدام برنامج. يحتاج المستخدم إلى تدريب مهني قبل استخدام معالج السائل الروبوتي. تركز هذه الدراسة على أتمتة سير العمل اليدوي cPILOT ، والذي يمكن أن يكون كثيف العمالة لمعالجة أكثر من 12 عينة في دفعة واحدة. من أجل زيادة إنتاجية نهج cPILOT11، قمنا بنقل بروتوكول cPILOT إلى معالج سائل روبوتي لمعالجة أكثر من 10 عينات بالتوازي. كما تسمح الأتمتة بتفاعلات مماثلة لكل عينة بالتوازي أثناء خطوات مختلفة من عملية إعداد العينة ، والتي تتطلب مستخدمين مدربين تدريباً عالياً لتحقيقها أثناء CPILOT اليدوي. ويركز هذا البروتوكول على تنفيذ جهاز معالجة السوائل الآلي لتنفيذ cPILOT. وتصف هذه الدراسة بروتوكول استخدام هذا النظام الآلي وتوضح أدائه باستخدام تحليل "إثبات المفهوم" من نوع 22-plex لتجانسات كبد الماوس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

لقد قدمنا عالية الإنتاجية الكمية proteomics سير العمل ، والجمع بين السلائف النظائر النظائرية ووضع علامات isobaric (cPILOT) قادرة على تعدد ما يصل إلى 22 أو 24 عينات مع علامات كتلة جنبا إلى جنب أو isobaric N ، N - dimethyl ليوتريك العلامات isobaric ، على التوالي ، في تجربة واحدة. هذه العينة المعززة multixing يقلل إلى حد كبير من حجم الاكتساب الطيفي الشامل ويزيد من فائدة الكواشف التجارية باهظة الثمن. ومع ذلك، يمكن أن تكون العملية اليدوية لمعالجة العينات وخطوات الأنابيب في الاستراتيجية كثيفة العمالة، تستغرق وقتاً طويلاً، وتُدخل فقدان العينة والخطأ الكمي. ويمكن التغلب على هذه القيود من خلال إدراج الأتمتة. هنا نقلنا بروتوكول cPILOT اليدوي إلى جهاز معالجة سائل آلي يمكنه إعداد أرقام عينة كبيرة (أي 96 عينة) بالتوازي. بشكل عام ، تزيد الأتمتة من جدوى و قابلية إنتاج cPILOT وتسمح بالاستخدام الواسع من قبل باحثين آخرين مع أجهزة أتمتة مماثلة.

ويبين الشكل 2 بيانات MS التمثيلية لببتيد تم تحديدها في جميع القنوات الأيونية المراسلة الـ 22 من تجربة cPILOT 22-plex، بما في ذلك تكرار سير العمل. الشكل 2 (أعلى) يصور زوج ذروة مشحونة بشكل مضاعف مفصولة بتباعد 4 Da m/z يشير إلى مجموعة من الديميثيل مدمجة في الببتيد. تم عزل أزواج الذروة الباهتة الخفيفة والثقيلة المجزأة وجزئت بشكل مستقل لتسفر عن تسلسل الببتيد. تسلسل الببتيد هو G (dimethyl) AAELMQQK (TMT-11plex) ويتوافق مع البروتين Betaine-homocysteine S-methyl transferase. تم عزل الأيونات المجزأة الأكثر كثافة لكل من القمم الباهتة الخفيفة والثقيلة(غير المعروضة)لتفتيت MS3 وتظهر الأيونات المراسلة(m/z 126-131) في الشكل 2 (أسفل). المراسل كثافة الأيونات هي متناسبة مباشرة مع وفرة الببتيد في العينة. وفرة الببتيد من العينات يعني قدرة الأنابيب من منصة الروبوتية موحدة إلى حد ما عبر العينات 22. وعموما، أدت هذه التجربة 22-plex cPILOT إلى 1326 (1209-light/1181-heavy) تحديد البروتينات الناتجة عن 3098 (6137-light/5872-heavy) الببتيدات(الجدول 4). ويبين الشكل 3 قطعة مربع من وفرة log10 مقابل مجموع كثافة أيون المراسل عبر جميع القنوات 22 التي تظهر أقل بين البئر / بين العينات المتغيرة. تم تقييم الأتمتة الإجمالية من خلال دراسة الخطأ في وفرة أيون المراسلين عبر كل بروتين في العينات الـ 22. ويبين الشكل 4 أن معالجة العينة مع النظام الأساسي الروبوتي أدى إلى قيم السيرة الذاتية منخفضة جداً. على وجه التحديد، عبر الببتيدات 3098 حددت متوسط السيرة الذاتية في وفرة أيون مراسل كان 12.36٪ و 15.03٪ للببتيدات الباهتة الخفيفة والثقيلة، على التوالي. من بين هذه الببتيدات 2032 من هذه الببتيدات كان مراسل إشارة أيون فوق الحد الأدنى عتبة واعتبرت قابلة للقياس الكمي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> الشكل 1- الـ 1 سير العمل التجريبي لمعالجة 22 عينة بالتوازي مع بروتوكول cPILOT الآلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 القياس الكمي للببتيدات عبر 22 عينة. مثال MS (أعلى) و MS3 (أسفل) أطياف من الببتيد G (dimethyl) AAELMQQK (TMT-11plex) كميا في 22-PLEX الآلي cPILOT التجربة للضوء dimethylated (أسفل اليسار) والثقيلة dimethylated (أسفل اليمين) قمم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> الشكل 3- الانبعاثات 100-11 مربع مؤامرة من مجموع المراسل أيونات الشدة مقابل log10 وفرة من 22 عينات باستخدام مكتشف البروتيوم 2.3. تم البحث في الملف الخام مرتين عن الببتيدات الخفيفة والثقيلة ، معرفات البروتينات بشكل منفصل مع TMT كتعديلات ديناميكية ، الضوء (+28.031 Da) وثقيل (+36.076 & +35.069 Da) ثنائي الفينيل في الببتيد N -termini كتعديلات ثابتة. تم تشغيل بحث مشترك مع جميع التعديلات المذكورة أعلاه باستخدام Proteome Discover 2.3 للحصول على سجل 10 وفرة من شدة الببتيد عبر جميع القنوات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> الشكل 4- الانبعاثات 100 100 كمان المؤامرات من كفاءة المشاركة في الاختلاف من وفرة الببتيد من ملخص أيونات مراسل كثافة عبر القنوات 126-131 م / ض. تم تحديد الببتيد كمياً بمتوسط قيمة السيرة الذاتية 12.36 و15.03 للضوء (2373) والثقيلة (2533) الببتيدات القابلة للقياس الكمي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1. رسم توضيحي لـ cPILOT مع ببتيد واحد. إظهار النظائر وضع العلامات من عينتين مختلفة وsciobaric وضع العلامات مع TMT126، تم حقن الخليط الناتج إلى MS لLC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>اسم المتغير</td>
			<td>قيمه</td>
			<td>وصف</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>وحدة التخزين التي ستستخدم للخطوة desalt 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>حجم لاستخدامها في الخطوة desalt 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>حجم لاستخدامها في الخطوة desalt 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>كاذبه</td>
			<td>سوف كاذبة خفض أوقات الحضانة إلى 30sec- صحيح سيتبع توقيت الحضانة في البروتوكول.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>حجم DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>لوحة تصفية</td>
			<td>Targa</td>
			<td>لوحة تستخدم لتحلية</td>
		</tr>
<tr>
<td>تصفية بلافول</td>
			<td>600</td>
			<td>حجم إزالة السيلت</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>كاذبه</td>
			<td>عدد من يغسل المياه على لوحة SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>حجم iodoacetamide</td>
		</tr>
<tr>
<td>الببتيدTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>حجم الببتيد لوضع العلامات TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>الضغط</td>
			<td>100</td>
			<td>ضغط mbar في PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>تغير في درجة الحرارة</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>وحدة تخزين علامات Isobaric التي سيتم إضافتها</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>حجم لتخفيف العينة قبل الهضم</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريبسينفول</td>
			<td>2</td>
			<td>حجم التربسين</td>
		</tr>
<tr>
<td>UsePopTimer</td>
			<td>صحيح</td>
			<td>يعرض True خيارات لتطبيق الضغط على اللوحة إذا لزم الأمر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1- الانبعاثات 1000 قائمة بالمتغيرات المستخدمة في بروتوكول cPILOT الآلي.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>ديلسورس</td>
			<td>ديلويل</td>
			<td>Dest</td>
			<td>ديست ويل</td>
			<td>ديلفولومي</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>ستوكويل</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>معرف العينات</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>باء٥</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>عينات</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2- حجم الماوس التجانس الكبد و 8 م اليوريا.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>سورس ويل</td>
			<td>مصدر ويل2</td>
			<td>مراسل ايون</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>حجم</td>
			<td>معرف العينات</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>جيم 1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>جيم 3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>هاء2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>جيم 5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>جيم 7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>هاء -4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>جيم 9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>مد 2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>دال4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>مد ٦</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>دال 8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3- الانبعاثات 100 من 10 العدد الإجمالي للبتيدات والبروتينات والتطابقات الطيفية الببتيدية (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">cPILOT الآلي</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ضوء</td>
			<td>الثقيله</td>
		</tr>
<tr>
<td>البروتينات</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>الببتيدات</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSMs</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4 - 100 100 دولار باركودينغ العلامات isobaric مع عينات خفيفة وثقيلة وصفت.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

الجمع بين وضع العلامات النظائرية السلائف وseobaric وضع العلامات (cPILOT) هو نموذج معزز استراتيجية تعدد قادرة على زيادة عدد العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع العلامات isobaric المتاحة. وقد أدى دمج منصة الروبوتية إلى زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية، وقابلية التكاثر، والدقة الكمية.

التلقائية عينة تعدد المكونات المتعددة باستخدام الجمع بين السلائف النظائر وسمات Isobaric (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

بروتوكول cPILOT الآلي يجعل من السهل على الباحثين تحليل العينات بطريقة عالية الإنتاجية. وهذا أمر مهم لأنه يسمح لنا للوصول إلى المعلومات البيولوجية حول الأمراض أو الظروف المختلفة أسرع بكثير. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على معالجة عينات متعددة في نفس الوقت، وبالتالي تقليل الأخطاء القابلة للتنفيذ أثناء استخدام عينات عالية الإنتاجية.مختبرنا مهتم في التطبيقات المتعلقة بالشيخوخة ومرض الزهايمر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة أي مرض أو تحد حيث هناك الأنسجة البيولوجية المعنية. تبدأ من خلال تشغيل جهاز الضغط الإيجابي، وجهاز التدفئة والتبريد، ومضخات التفريغ.قم بتوصيل جميع الملحقات بالمعالج السائل، والذي سيظهر الضوء الأزرق بمجرد توصيله بالكمبيوتر وجاهز للعمل. Aliquot 300 ميكرولترات من تجانس الكبد في أنبوب 500 ميكرولتر ووضعها على لوحة بئر عميق اثنين ملليلتر. تخزين العينة عند أربع درجات مئوية حتى بداية البروتوكول.فتح الأسلوب في البرنامج ووضع النصائح المطلوبة و labware في مواقعها. ثم الاختيار المتقاطع مع تخطيط سطح السفينة النهائي وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول. تحميل 230 نصائح ميكرولتر وpirate 90 ميكرولترات من ثمانية المولى اليوريا من الخزان.ثم الاستغناء عنه لصف واحد من الأسود اثنين ملليلتر لوحة جيدا عميق. افرغوا نصائح TL1 وكرروا هذه الخطوة حتى تتم إضافة اليوريا إلى جميع الآبار. بعد إضافة العازلة denaturation، استخدم 90 نصائح ميكرولتر لنقل 10 ميكرولترات من التجانس الكبد الماوس إلى لوحة بئر عميق.تفريغ النصائح، ثم تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate ثلاثة ميكرولترات من DTT من لوحة الكاشف واحد. الاستغناء DTT إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة بئر عميق. ختم لوحة العينة مع رقائق الألومنيوم واحتضان ذلك في 37 درجة مئوية لمدة 600 ثانية في حين تدور في 300 دورة في الدقيقة.بعد الحضانة، تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكروليتر، ويتبخر ستة ميكرولترات من IAM من لوحة الكاشف واحد في الصف الثالث، والاستغناء عنه إلى صف واحد من لوحة عينة. ختم لوحة العينة واحتضانها في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران في 300 دورة في الدقيقة على جهاز التبريد. ثم فك الميكن لوحة العينة وتحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر.سبيرت خمسة ميكرولترات من السيستين من لوحة الكاشف واحد في الصف الثاني والاستغناء عنه إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة العينة. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، قم بإجراء هزة موقوتة من 1800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.ثم إضافة 800 ميكرولتردات من 20 ملليمتر تريس العازلة مع كلوريد الكالسيوم 10 ملليمولار إلى كل بئر على لوحة العينة لتخفيف تركيز اليوريا إلى اثنين من الضرس. إضافة 20 ميكرولترات من التربسين إلى الصف الأول من لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في موقع محدد على سطح السفينة. بعد إضافة التربسين إلى لوحة العينة، وختمه واحتضانه لمدة 15 ساعة في 37 درجة مئوية و 600 دورة في الدقيقة على جهاز التدفئة والتبريد.وقف الهضم عن طريق التعرق 150 ميكرولترات من حمض 5٪ من حمض فليك من الصف الثالث من لوحة حمض الفورميك وصرفه إلى لوحة العينة في الصفوف واحد واثنين. المضي قدما إلى عدم التشبع الببتيدات. استخدام 1070 نصائح ميكرولتر لpirate 600 ميكرولترات من الأسيتونتريل.ثم الاستغناء عنه في الصفوف واحد واثنين من استخراج المرحلة الصلبة، أو لوحة SPE، لتنشيط C-18. بعد ذلك، قم بتحميل العينة المهضمة إلى لوحة SPE في تمريرتين. تحميل صفين من النصائح، وpirate 534 ميكرولترات من العينات هضمها، وصرف لهم إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة SPE.تطبيق الضغط على لوحة وتكرار هذه الخطوة حتى يتم تحميل جميع العينات. تنظيف الببتيدات عن طريق غسل بالماء وتخفيف الببتيدات مع 60-40 الأسيتونيتريل في 0.1٪ حمض فريلك. ثم ضع لوحة على رأس لوحة جمع ل elute الببتيدات باستخدام جهاز الضغط الإيجابي.ارسم التدفق من خلال إعداد النصائح المطلوبة و labware في البرنامج ، وتقاطع مع تخطيط سطح السفينة ، وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول ل dimethylation. إعادة تكوين الببتيدات في حمض الخليك 1٪. لأداء وضع العلامات على ثنائي التحلل، قم بتحميل 90 نصيحة ميكروليتر و16 ميكرولترات من 60 ملليمولار ضوء الفورمالديهايد من الصف الثاني من لوحة الكاشف اثنين.الاستغناء عن صف واحد من لوحة عينة، ثم تفريغ النصائح. تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 16 ميكرولترات من 60 ملليمولار الفورمالديهايد الثقيلة من الصف الثالث من لوحة الكاشف اثنين. الاستغناء عن صف اثنين من لوحة عينة وتفريغ النصائح.تحميل صفين من 90 نصائح microliter وpirate 16 microliters من 24 ميليمولار الصوديوم سيانوبوروهيدريد و 24 ملليمولار الصوديوم cyanoborodeuteride من الصفوف واحد واثنين من لوحة الكاشف ثلاثة، ثم الاستغناء عن الكواشف إلى الصفوف واحد واثنين من لوحة عينة لبدء تفاعل ثنائي الفينيل. افرغ النصائح واستخدم الشاكر المداري لإجراء هزة موقوتة لمدة 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة. ثم تحميل صفين من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 32 ميكرولترات من 1٪ الأمونيا من الصفوف ثلاثة وأربعة من لوحة الكاشف ثلاثة.الاستغناء عنه في الصفوف واحد واثنين من لوحة عينة اثنين لوقف رد الفعل. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من الببتيدات الباهتة الفاتحة والثقيلة في لوحة جديدة اثنين ملليلتر عميق جيدا لساللتينغ. بعد إزالة التشبع بالضوء والببتيدات الثقيلة ، جفف الببتيدات وأدي وضع علامات الهزوباريك.إعادة تشكيل الببتيدات مع 100 ميكرولترات من 100 ميليمولار ثلاثية الإيثيلمونيوم bicarbonate العازلة على شاكر المدارية. ثم استخدم 90 نصائح ميكروليتر لpirate 25 ميكرولترات من الببتيدات dimethylated مجتمعة والاستغناء عنها إلى الصف الأول من لوحة معالجة TMT. تحميل صف واحد من 90 نصائح ميكرولتر وpirate 10 ميكرولترات من TMT.الاستغناء عنه في الصف الأول من لوحة معالجة TMT، تفريغ النصائح، ثم تنفيذ هزة موقوتة لمدة ساعة واحدة في 1800 دورة في الدقيقة. التعرق ثمانية ميكرولترات من الهيدروكسيلمين من الصف الثاني من لوحة TEAB والاستغناء عنه إلى صف واحد من لوحة معالجة TMT. بعد اهتزاز 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة، نقل 30.5 ميكرولترات من الببتيدات TMT المسمى إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.ثم المضي قدما في الحصول على البيانات وتحليلها وفقا لتوجيهات المخطوطة. تظهر هنا بيانات MS التمثيلية لببتيد تم تحديدها في جميع القنوات الأيونية المراسلة 22 من 22 Plex مجتمعة السلائف النظائرية وتجربة وضع العلامات الهزوبية. تسلسل الببتيد يتوافق مع betaine-homocysteine S-ميثيلtransferase.وكانت الأيونات المجزأة الأكثر كثافة لكل من القمم الباهتة الفاتحة والثقيلة معزولة أكثر لتفتت MS3. المراسل كثافة الأيونات هي متناسبة مباشرة مع وفرة الببتيد في العينة. وعموما، فإن هذه التسميات النظائرية المزدوجة وتجربة وضع العلامات الهزوبية التساوية تقلل من أوقات معالجة العينات وجعلت من الممكن تصور تعبير البروتين عبر قنوات أو ظروف متعددة.المؤامرة مربع من سجل 10 وفرة مقابل إجمالي كثافة أيون مراسل عبر جميع القنوات 22 يظهر أقل بين البئر أو بين العينات المتغيرة. تم تقييم الأتمتة الإجمالية من خلال دراسة الخطأ في وفرة أيون المراسلين عبر كل بروتين في العينات الـ 22. وقد أدى تجهيز العينات باستخدام النظام الأساسي الروبوتي إلى معاملات منخفضة جداً من التباين.عبر الببتيدات 3098، كان متوسط معامل الاختلاف في وفرة الأيونات المراسل 12.36 و 15.03٪ للببتيدات ذات الديمثيلات الخفيفة والثقيلة على التوالي. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن المستويات التساوي والتساوي المستخدمة في تجربة واحدة. وبالتالي، يجب إجراء تخطيط دقيق لتعيين كل عينة مع العلامات المقصود استخدامها في التجربة.ويمكن دمج هذه الطريقة بسهولة في أنظمة روبوتية أخرى، ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الأنسجة، مثل الأنسجة أو الخلايا وغيرها من الفلورويدات الحيوية.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

عالية الدقة قياس الزنك النظائر تطبق على الماوس هيئات

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

التوصيف، الكمي ومجمع محددة تحليل النظائر من مولد للحمى الكربون عن طريق البنزين كاربوكسيلية الأحماض (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

الببتيد والبروتين القياس الكمي باستخدام الآلية المناعية-استخدام (إيمالدي)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

الفصل الآلي 90ريال وبريكونسينتريشن في نظام المعمل على صمام المستوى بك

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine Metathesis بواسطة المحفزات المدعومة من السيليكا باستخدام منهجيه الكيمياء فلزي السطحية

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

تأثير النظائر في عملية نقل البروتون المزدوج من البورفيسين التحقيق من قبل طريقة QM/MM المحسنة

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

اعداد العينات في الكوارتز الكريستال ميكروتوازن قياسات الامتزاز البروتين وميكانيكا البوليمر

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...