Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Forfatterne anerkender Vanderbilt University Start-up fonde og NIH pris (R01GM117191) til RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

cPILOT er en forbedret multiplexing-strategi, der kan analysere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment. Multiplexing kapacitet afhænger af antallet af tilgængelige isotop og isoobaric tagging kombinationer. Introduktion af TMTpro7, som er i stand til at mærke 16 prøver i enkelt eksperiment, kan skubbe grænserne for cPILOT til 32-plex. cPILOT består af flere pipetteringstrin og kræver omfattende pleje og brugerfærdigheder for at udføre prøveforberedelse. Selv med en ekspertbruger er manuelle fejl uundgåelige, hvilket opfordrer brugen af robotplatforme til at behandle prøver i cPILOT-strategien. Da cPILOT anvender pH-afhængig mærkning af peptiderne, skal pH-punktet opretholdes for lyset og det tunge dimethylerede sæt prøver. Mildt sur-basis pH kan resultere i dimethylering af både N-termini og lysin rester. En fordel ved cPILOT er, at det kun kræver halvdelen af de isobiske tags, da peptid N-termini er optaget af dimethylgrupperne. Dette giver et større antal prøver, der skal mærkes til halv pris. Håndtering af større stikprøvetal kræver, at reagenseksponeringstider er ens for den første og den sidste prøve i et parti. En pipettedispenser, der kan rumme op til 32 prøver parallelt, kan bedst opnås ved brug af robotvæskehåndteringsenheder.
For at behandle flere prøver af cPILOT blev den manuelle arbejdsgang ændret for at omfatte automatisering. Den robotvæske handler, der anvendes i denne undersøgelse har to bælg med 96-kanals og 8-kanals pipetting evner, med en griber til at placere pladerne i de tilgængelige 28 dæk steder. Væskebehandleren er integreret med et positivt trykapparat, orbital shaker og en anordning til opvarmning/afkøling af prøver i 96 brøndpladen. Det positive trykapparat hjælper med at udføre bufferudvekslinger i SPE-pladerne under oprydningen, mens orbitalshaskeren hjælper med at hvirvel/blande prøverne. Robotplatformen blev programmeret til at aspirere og dispensere buffere og prøver til 96-brøndplader, inkubere, vortexprøver og overførselsplader. Væsker med forskellige viskositeter, såsom acetonitril og vand, kræver specifikke pipettering overvejelser, der også kan programmeres til metoden.
CPILOT-arbejdsgangen, der startede fra BCA's proteinantificering til mærkning af peptiderne med isobiske tags (dvs. Den komplette protokol blev skaleret til at bruge 96 dybe brøndplader, der kan rumme 2 ml pr. brønd. Bufferne blev udarbejdet før forsøgets start og tilsat 96 brøndpladen, således at der kunne foretages en parallel prøveforarbejdning. I denne undersøgelse blev der tilføjet 22 workflow-replikater af muselever homogenat til de dybe brøndplader og taget gennem cPILOT-protokollen. Endelig blev der injiceret en enkelt prøve bestående af de 22-plex equimolar-muselever, der mærkede peptider, til massespektrometeret. De understøttende ionintensiteter svarende til peptidtætheden i prøverne viste, at prøver, der er behandlet med væskebehandleren, har lavere CV'er end den manuelle protokol (ikke viste data). Robotplatformen forbedrede også i høj grad reproducerbarheden af prøvebehandling. Reproducerbarhed og robusthed er meget vigtige faktorer under behandling af et stort antal prøver. Pipetteringsfejl kan føre til fuldstændig fejlfortolkning af dataene, og her leverede robotplatformen lav variation mellem prøverne. Ved hjælp af robotplatformen til cPILOT reducerede det den tid, det tog at forberede prøver. For eksempel krævede den efter at have udviklet den automatiserede metode 2,5 timer at behandle 22 prøver i forhold til 7,5 timer for manuel cPILOT. Der er forsøg i gang i vores laboratorium for yderligere at evaluere sammenligninger af manuelle og automatiserede cPILOT-arbejdsgange. Baseret på tidligere rapporter fra vores laboratorium var CV%s af proteinreporterionintensiteter i den manuelle cPILOT i gennemsnit 20% med nogle afvigende værdier, der oversteg denneværdi 12.
cPILOT er en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidniveau, der kan bruges til enhver prøvetype som celler, væv og kropsvæsker. cPILOT tilbyder forbedret prøve multiplexing og med inkorporering af automatisering kan lette høj-throughput prøve multiplexing i proteomics. Denne gennemløb er nødvendig for yderligere at fremme sygdom og biologisk forståelse og biomarkør opdagelse.

Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er et uundværligt forskningsredskab til at identificere sygdomsspecifikke biomarkører, forstå sygdomsprogression og skabe kundeemner til terapeutisk udvikling. Dette kan opnås fra en række sygdomsrelaterede kliniske prøver såsom blodserum/plasma, proksimale væsker og væv1,2. Proteomics biomarkør opdagelse og validering har for nylig fået betydelige overvejelser på grund af styrken af prøve multiplexing strategier3,4. Prøveud flerekspifikation er en teknik, der muliggør samtidig sammenligning og kvantificering af to eller flere prøvebetingelser inden for en enkeltMS-injektion 5,6. Prøve multiplexing opnås ved barcoding peptider eller proteiner fra flere prøver med kemiske, enzymatiske eller metaboliske tags og indhente MS oplysninger fra alle prøver i en enkelt MS eller MS / MS eksperiment. Blandt de tilgængelige isobaric tags er isobaric tagging reagenser (iTRAQ), kommercielle tandem masse tags (TMT), og i hus syntetiseret isobaric N, N-dimethyl leucin (DiLeu) reagenser med kapaciteter op til 16-plex7 og 21-plex8, hhv.
Kombineret prækursorisotopmærkning og isobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing teknologi. cPILOT kombinerer isotopmærkning af peptid N-termini med lys [−(CH3)2]og tung [−(13C2H3)2] isotoper ved lav pH (∼2.5), som holder lysinresterne til rådighed for efterfølgende høj pH(8.5) isobaric mærkning ved hjælp af TMT DiLeu eller iTRAQ-tagging3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategiens dobbelte mærkningsordning er afbildet i supplerende figur 1 med to prøver ved hjælp af et eksempel peptid. Nøjagtigheden og præcisionen af den TMT-baserede kvantificering på MS2-niveau kan bringes i fare på grund af tilstedeværelsen af kontaminerende co-isolerede og co-fragmenterede ioner, der betegnes som interferenseffekten15. Denne begrænsning i unøjagtige reporter ion nøgletal kan overvindes ved hjælp af tribrid Orbitrap massespektrometre. For eksempel kan interferenseffekten overvindes ved at isolere en top i et dimethyleret par på MS1-niveauet i massespektrometeret, udsætte den lette eller tunge top for MS2-fragmentering i den lineære ionfælde og derefter udsætte det mest intense MS2-fragment for HCD-MS3 for at få kvantitative oplysninger. For at øge chancerne for at vælge peptider uden lysinaminer til rådighed for at generere reporterioner, en selektiv MS3 erhvervelse baseret på y-1 fragment også kan anvendes og er en tilgang, som kan resultere i en højere procentdel af peptider kvantificerbare med cPILOT9. Kombinationen af let og tung mærkning øger prøve multiplexing kapaciteter med en faktor på 2x til den, der opnås med individuelle isoobaric tags. Vi har for nylig brugt cPILOT til at kombinere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment med DiLeu reagenser16. Derudover er cPILOT blevet anvendt til at studere oxidative post-translationelle modifikationer 14 , herunder proteinnitration17, andre globale proteomer9, og har demonstreret anvendelser på tværs af flere vævsprøver i en Musemodel11 forAlzheimers sygdom.
Robust prøveforberedelse er et kritisk trin i et cPILOT-eksperiment og kan være tidskrævende, besværligt og omfattende. Forbedret prøve multiplexing kræver omfattende pipettering og højt kvalificerede laboratoriepersonale, og der er flere faktorer, der kan stærkt påvirke reproducerbarheden af eksperimentet. F.eks. er omhyggelig håndtering af prøver nødvendig for at sikre lignende reaktionstider for alle prøver og for at opretholde passende bufferpH for lette og tunge dimethylerede prøver. Desuden kan manuel forberedelse af snesevis til hundredvis af prøver medføre en høj eksperimentel fejl. For at reducere variationen i prøveforberedelse, forbedre den kvantitative nøjagtighed og øge den eksperimentelle gennemløb har vi derfor udviklet en automatiseret cPILOT-arbejdsgang. Automatisering opnås ved hjælp af en robot væskehåndteringsenhed, der kan fuldføre mange aspekter af arbejdsprocessen (Figur 1). Prøvepræparatet fra proteinant kvantificering til peptidmærkning blev udført på en automatiseret væskehandler. Den automatiserede væskebehandler er integreret med et PPA (positivetryk) til bufferudvekslinger mellem spe-pladerne (solid phase extraction), orbitalshasker og en varme-/køleanordning. Robotplatformen indeholder 28 dækslokationer, der passer til plader og buffere. Der er to bælg med en griber til at overføre pladerne inden for dækket steder: en 96-kanals fast volumen pipettering hoved (5-1100 μL) og 8 kanal variabel volumen sonder (1-1000 μL). Robotplatformen styres ved hjælp af en software. Brugeren skal trænes professionelt, før der anvendes robotvæskebehandleren. Denne undersøgelse fokuserer på automatisering af den manuelle cPILOT arbejdsgang, som kan være arbejdskrævende til behandling af mere end 12 prøver i et enkelt parti. For at øge gennemløbet af cPILOT approach11overførte vi cPILOT-protokollen til en robotvæskebehandler for at behandle mere end 10 prøver parallelt. Automatiseringen giver også mulighed for lignende reaktioner for hver prøve parallelt under forskellige trin i prøveforberedelsesprocessen, hvilket krævede, at højtuddannede brugere kunne opnå under manuel cPILOT. Denne protokol fokuserer på implementering af den automatiserede væskehåndteringsenhed til udførelse af cPILOT. Denne undersøgelse beskriver protokollen for brug af dette automatiserede system og demonstrerer dens ydeevne ved hjælp af en 22-plex "proof-of-concept" analyse af muselever homogenater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Vi har indført en høj kapacitet kvantitative proteomics workflow, kombineret prækursor isotop mærkning og isobænsk tagging (cPILOT) i stand til multiplexing op til 22 eller 24 prøver med tandem masse tags eller isobaric N, N-dimethyl leucin isobaric tags, henholdsvis i et enkelt eksperiment. Denne forbedrede prøve multiplexing reducerer massespektrometri erhvervelse gange og øger nytten af de dyre kommercielle isoobaric reagenser. Den manuelle proces med prøvehåndterings- og pipetteringstrin i strategien kan dog være arbejdskrævende, tidskrævende og indføre prøvetab og kvantitative fejl. Disse begrænsninger kan overvindes ved at indarbejde automatisering. Her overførte vi den manuelle cPILOT-protokol til en automatiseret væskehåndteringsenhed, der kan tilberede store prøvenumre (dvs. 96 prøver) parallelt. Generelt øger automatisering gennemførligheden og reproducerbarheden af cPILOT og giver mulighed for bred brug af andre forskere med sammenlignelige automatiseringsenheder.

Figur 2 viser repræsentative MS-data for et peptid identificeret i alle 22 reporterionkanaler fra et 22-plex cPILOT-eksperiment, herunder workflow-replikater. Figur 2 (øverst) viser et dobbelt ladet toppar adskilt af 4 Da m/z-afstand, der angiver en enkelt dimethylgruppe, der er indbygget i peptidet. De lette og tunge dimethylerede peak par blev isoleret og fragmenteret uafhængigt for at give sekvensen af peptidet. Peptidets sekvens er G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) og svarer til proteinet Betaine-homocystein S-methyl transferase. De mest intense fragmentioner for både lette og tunge dimethylerede toppe (ikke vist) blev yderligere isoleret for MS3-fragmentering, og reporterionionerne (m/z 126-131) er vist i figur 2 (nederst). Reporterionintensiteterne står i direkte forhold til peptidtætheden i prøven. Peptid overflod af prøverne indebærer pipettering evne robot platform er temmelig ensartet på tværs af de 22 prøver. Samlet resulterede dette 22-plex cPILOT-eksperiment i 1326 (1209-let/1181-tunge) proteiner fra 3098 (6137-let/5872-tunge) peptider (Tabel 4). Figur 3 viser kasseplottet log10-forekomst i forhold til de samlede reporterionintensiteter på tværs af alle de 22 kanaler, der viser mindre variation mellem godt og mellemprøven. Evalueringen af den samlede automatisering blev udført ved at undersøge fejlen i reporter iontæthed på tværs af hvert protein i de 22 prøver. Figur 4 viser, at prøvebehandling med robotplatformen resulterede i meget lave CV-værdier. Specifikt var det gennemsnitlige CV i reporteriontæthed 12,36 % og 15,03 % for henholdsvis lette og tunge dimethylerede peptider på cv'et i forhold til 3098. Blandt disse peptider havde 2032 af disse peptider reporter ionsignal over minimumsgrænsen og blev anset for kvantificerbare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Figur 1. Eksperimentel arbejdsgang til behandling af 22 prøver parallelt med en automatiseret cPILOT-protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Figur 2. Kvantificering af peptider på tværs af 22 prøver. Eksempel MS (top) og MS3 (bund) spektre af peptid G (dimethyl)AAELMQQK (TMT-11plex) kvantificeret i 22-plex automatiseret cPILOT eksperiment for lys dimethyleret (nederst til venstre) og tunge dimethylerede (nederst til højre) toppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Figur 3. Box plot af samlede reporter ion intensiteter versus log10 overflod af 22 prøver ved hjælp af proteome discoverer 2,3. RAW-filen blev søgt to gange efter lette og tunge peptider, proteiner id'er separat med TMT som dynamisk modifikation, lys (+28.031 Da) og tunge (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation ved peptid N-termini som statisk modifikation. En kombineret søgning med alle de ovennævnte ændringer blev kørt ved hjælp af Proteome Discover 2,3 for at opnå Log 10 Abundance af peptid intensiteter på tværs af alle kanaler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Figur 4. Violin plots af co-effektiv variation af peptid overflod fra summede reporter ion intensiteter på tværs af kanaler 126-131 m / z. Peptidet blev kvantificeret med en gennemsnitlig CV-værdi på 12,36 og 15,03 for lette (2373) og tunge (2533) kvantificerbare peptider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1. Illustration af cPILOT med et enkelt peptid. Den resulterende blanding blev injiceret til MS for LC-MS3, der viste isotopmærkning af to forskellige prøver og isotopmærkning med TMT126. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Variabelnavn</td>
			<td>Værdi</td>
			<td>Beskrivelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>AfsaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>AfsaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>Falsk</td>
			<td>Falsk vil skære ned inkubationstiderne til 30sec- True vil følge inkubation timing i protokollen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Mængden af DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filterplate</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Plade, der anvendes til afsaltning</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Lydstyrke til afsaltning</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>Falsk</td>
			<td>Antal vandvaske på SPE-pladen</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Mængden af iodoacetamid</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptidETMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Mængden af peptid til TMT-mærkning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pres</td>
			<td>100</td>
			<td>mbartryk ved elkøbsaftale</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Ændring i temperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Isobaric tag volumen, der skal tilføjes</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volumen til fortyndelse af prøve før fordøjelsen</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Mængden af trypsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>BrugPopTimer</td>
			<td>Sandt</td>
			<td>True viser mulighederne for at lægge pres på pladen, hvis det er nødvendigt</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Liste over variabler, der anvendes i automatiseret cPILOT-protokol.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilKilde</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>EksempelVol</td>
			<td>Eksempel-id</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prøver</td>
			<td>kr.</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2. Mængden af muselever homogenat og 8 M urinstof.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>KildeWell</td>
			<td>KildeWell2</td>
			<td>Reporter Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Eksempel-id</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>126</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>130N</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>130C</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>kr.</td>
			<td>kr.</td>
			<td>131C</td>
			<td>kr.</td>
			<td>dagens e-kr.</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Samlet antal peptider, proteiner og peptidsspektrale tændstikker (PSM'er).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Automatiseret cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Lys</td>
			<td>Tunge</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteiner</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptider</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PsM'er</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4. Barcoding de isoobariske tags med lette og tunge mærkede prøver.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Kombineret prækursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing strategi, der er i stand til at øge antallet af prøver, der kan analyseres samtidig med tilgængelige isobaric tags. Inkorporering af en robotplatform har øget den eksperimentelle overførselshastighed, reproducerbarhed og kvantitative nøjagtighed betydeligt.

Automatiseret prøve multiplexing ved hjælp af kombineret precursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Vores automatiserede cPILOT-protokol gør det nemmere for forskere at analysere prøver på en høj gennemløbs måde. Dette er vigtigt, fordi det giver os mulighed for at komme til biologiske oplysninger om sygdomme eller forskellige forhold meget hurtigere. Den største fordel ved denne teknik er, at det hjælper med at behandle flere prøver parallelt, hvilket reducerer handlingsrettede fejl, mens du bruger høj gennemløbsprøver.Vores laboratorium er interesseret i applikationer relateret til aldring og Alzheimers sygdom. Men, denne teknik kan også bruges til at studere enhver sygdom eller udfordring for, hvor der er biologiske væv involveret. Begynd med at tænde for det positive trykapparat, varme- og køleanordningen og vakuumpumperne.Tilslut alt tilbehør med væskebehandleren, som viser et blåt lys, når det er tilsluttet computeren og klar til brug. Aliquot 300 mikroliter af leveren homogenat i en 500 mikroliter rør og placere den på en to milliliter dyb brønd plade. Prøven opbevares ved fire grader Celsius indtil protokollens begyndelse.Åbn metoden i softwaren og placere de nødvendige tips og labware i deres positioner. Krydstjek derefter med det endelige dæklayout, og klik på Næste for at fortsætte protokollen. Der skal indlæses 230 mikroliterspidser, og der aspireres 90 mikroliter af otte molar urea fra reservoiret.Derefter dispenseres det til række en af de sorte to milliliter dyb godt plade. Fjern spidsen af TL1 og gentag dette trin, indtil urinstof er blevet tilføjet til alle brønde. Efter tilsætning af denatureringsbufferen skal du bruge 90 mikroliterspidser til at overføre 10 mikroliter af muselever homogenat til den dybe brøndplade.Fjern spidserne, og indlæs derefter en række med 90 mikroliterspidser, og indsugning tre mikroliter DTT fra reagensplade et. Dispenser DTT til række et og to af den dybe brøndplade. Prøvepladen forsegles med aluminiumsfolie og inkuberes ved 37 grader Celsius i 600 sekunder, mens den roteres ved 300 omdr./min.Efter inkubationen indlæses en række med 90 mikroliterspidser, der aspirerer seks mikroliter af IAM fra reagensplade et ved række tre, og den afgør den til at række et af prøvepladen. Prøvepladen forsegles og inkuberes ved fire grader Celsius i 30 minutter, mens den roteres ved 300 omdr./min. på køleanordningen. Derefter unseal prøvepladen og indlæse en række af 90 microliter tips.Aspirere fem mikroliter cystin fra reagensplade et i række to og dispenseres til række et og to af prøvepladen. Pladen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubationen udføres en tidsindstillet rystelse på 1800 omdr./min. i 30 minutter.Derefter tilsættes 800 mikroliter af 20 millimolar Tris buffer med 10 millimolar calciumchlorid til hver brønd på prøvepladen for at fortynde urinstofkoncentrationen til to kindtand. Tilføj 20 mikroliter trypsin til den første række af en 96 brøndplade og placer pladen på et bestemt sted på dækket. Efter tilsætning af trypsin til prøvepladen forsegles den og inkuberes den i 15 timer ved 37 grader Celsius og 600 omdr./min. på varme- og køleapparatet.Fordøjelsen standses ved at aspirere 150 mikroliter 5% myresyre fra række tre af myresyrepladen og dispensere den til prøvepladen i række et og to. Fortsæt med at afsalt peptiderne. Brug 1070 mikroliterspidser til at aspirere 600 mikroliter acetonitril.Derefter dispenseres det i række et og to af den faste fase ekstraktion, eller SPE plade, for at aktivere C-18. Dernæst skal du lægge den fordøjede prøve på SPE-pladen i to gennemløb. Læg to rækker spidser, aspirerer 534 mikroliter af de fordøjede prøver, og dispenser dem til række et og to af SPE-pladen.Tryk på pladen, og gentag dette trin, indtil alle prøverne er indlæst. Peptiderne rengøres ved at vaske med vand og fortynde pepderne med 60 til 40 acetonitril i 0,1% myresyre. Anstæng derefter pladen oven på en opsamlingsplade for at fremkalde peptiderne ved hjælp af det positive trykapparat.Tegn flow-through og oprette de nødvendige tips og labware i softwaren, krydstjekke med dæk layout, og klik på Næste for at fortsætte protokollen for dimethylation. Rekonstituere peptider i 1%eddikesyre. For at udføre dimethylering mærkning, belastning 90 mikroliter tips og aspirere 16 mikroliter af 60 millimolar lys formaldehyd fra den anden række af reagensplade to.Dispenser den til række en af prøven plade, derefter losse spidserne. Der indlæst en række med 90 mikroliterspidser, og aspirerer 16 mikroliter af 60 millimolar tung formaldehyd fra række tre af reagensplade to. Den aflæsses i række to af prøvepladen, og spidserne skal aflæsses.Læg to rækker af 90 mikroliterspidser og aspirere 16 mikroliter af 24 millimolar natriumcyanoborohydrid og 24 millimolar natriumcyanoborodeuterid fra række et og to af reagensplade tre, og dispenseres derefter reagenserne til række et og to af prøvepladen for at starte dimethylens reaktion. Fjern spidserne og brug orbital shaker til at udføre en timet ryste i 15 minutter ved 1800 RPM. Derefter indlæses to rækker med 90 mikroliterspidser og aspirerer 32 mikroliter på 1% ammoniak fra række tre og fire af reagensplade tre.Dispenseres det i række et og to af prøveplade to for at stoppe reaktionen. Kombiner lige store mængder lette og tunge dimethylerede peptider i en ny to milliliter dyb brøndplade til afsaltning. Efter afsaltning af de kombinerede lette og tunge peptider, tør peptiderne ned og udfør isoobaric tagging.Rekonstituere peptiderne med 100 mikroliter på 100 millimolar triethylmonium bikarbonat buffer på en orbital shaker. Brug derefter 90 mikroliterspidser til at aspirere 25 mikroliter af de kombinerede dimethylerede peptider og dispensere dem til den første række af TMT-forarbejdningspladen. Læg en række med 90 mikroliterspidser, og indsugning af 10 mikroliter TMT.Dispensere det i den første række af TMT forarbejdning plade, losse spidserne, derefter udføre en timet ryste i en time ved 1800 RPM. Aspirere otte mikroliter af hydroxylamin fra række to af TEAB plade og dispensere den til række en af TMT forarbejdning plade. Efter 15 minutters rystelse ved 1800 omdr./min. overføres 30,5 mikroliter af TMT-mærkede peptider til et 1,5 milliliterrør.Fortsæt derefter med dataindsamling og analyse i henhold til manuskriptanvisningerne. Repræsentative MS-data for et peptid identificeret i alle 22 reporter ion kanaler fra en 22 Plex kombineret prækursor isotop mærkning og isobaric tagging eksperiment er vist her. Peptidets sekvens svarer til betain-homocystein S-methyltransferase.De mest intense fragmenteringer for både de lette og tunge dimethylerede toppe blev yderligere isoleret for MS3-fragmentering. Reporterionintensiteterne står i direkte forhold til peptidtætheden i prøven. Samlet set reducerede dette kombinerede prækursorisotopmærknings- og isobaric mærkningseksperiment prøven og gjorde det muligt at visualisere proteinudtrykket på tværs af flere kanaler eller tilstande.Boksen plot af log 10 overflod versus samlede reporter ion intensiteter på tværs af alle de 22 kanaler viser mindre inter-godt eller inter-prøve variation. Evalueringen af den samlede automatisering blev udført ved at undersøge fejlen i reporter iontæthed på tværs af hvert protein i de 22 prøver. Prøvebehandling med robotplatformen resulterede i meget lave variationskoefficienter.På tværs af 3098-peptiderne var den gennemsnitlige variationskoefficient i reporteriontætheden henholdsvis 12,36 og 15,03% for lette og tunge dimethylerede peptider. Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at huske på, at isotop og isoobariske niveauer bruges i et enkelt eksperiment. Derfor skal der udføres omhyggelig planlægning for at angive hver prøve med de mærker, der er beregnet til at blive anvendt i forsøget.Denne metode kan let integreres i andre robotsystemer, og den kan anvendes på en række forskellige væv, såsom væv eller cellelysater og andre biofluider.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitative Proteomics anvendelse af reduktiv Dimethylation for mærkning med stabile isotoper

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

High Precision Zink Isotopiske Målinger Anvendt til Mouse organer

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

En Kvantitativ Glycomics og Proteomics Kombineret Purification strategi

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, Kvantificering og Compound-specifikke isotopanalyse pyrogenfrihed Carbon Brug Benzen polycarboxylsyrer (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Webstedet Instrueret Spin Mærkning og EPR spektroskopiske Undersøgelser af pentamere ligand ionkanaler

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptid og Protein kvantificering ved hjælp af automatiseret Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automatiseret 90Sr adskillelse og Preconcentration i et Lab på ventil System på Ppq niveau

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine-meta afhandling af silica-støttede katalysatorer ved hjælp af metodologien for overflade Organometallisk kemi

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Isotop effekt i dobbelt proton overførsel proces af Porphycen undersøgt ved forbedret QM/MM metode

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Prøveforberedelse i kvarts krystal Mikrobalance målinger af protein adsorption og polymer mekanik

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...