Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

De auteurs erkennen Vanderbilt University Start-up Funds en NIH award (R01GM117191) aan RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

cPILOT is een verbeterde multiplexing strategie die tot 24 monsters in een enkel experiment kan analyseren. De multiplexingcapaciteit is afhankelijk van het aantal beschikbare isotopen- en isobarische tagging-combinaties. De introductie van de TMTpro7, die in staat is om 16 monsters in één experiment te taggen, kan de grenzen van de CPILOT verleggen tot 32-plex. cPILOT bestaat uit meerdere pipetting stappen en vereist uitgebreide zorg en gebruikersvaardigheden om monstervoorbereiding uit te voeren. Zelfs met een deskundige gebruiker, handmatige fouten zijn onvermijdelijk, die het gebruik van robotplatforms uitnodigt om monsters te verwerken in de cPILOT-strategie. Aangezien cPILOT pH-afhankelijke tagging van de peptiden gebruikt, moet de pH worden gehandhaafd voor het licht en de zware dimethylated set monsters. Licht zuur-basis pH kan resulteren in dimethylation van zowel N-termini en lysine residuen. Een voordeel van cPILOT is dat het slechts de helft van de isobarische tags vereist, omdat peptide N-termini bezet zijn met de dimethylgroepen. Dit biedt een groter aantal monsters te worden geëtiketteerd tegen de helft van de kosten. Voor het hanteren van grotere steekproefnummers moeten de blootstellingstijden van reagens vergelijkbaar zijn voor het eerste en het laatste monster in een batch. Een pipetdispenser die plaats biedt aan maximaal 32 monsters parallel kan het best worden bereikt met behulp van robotvloeistofbehandelingsapparaten.
Om meerdere monsters per cPILOT te verwerken, werd de handmatige workflow aangepast om automatisering op te nemen. De robot vloeistof handler gebruikt in deze studie heeft twee pods met 96-kanaals en 8-kanaals pipetting vaardigheden, met een grijper om de platen te plaatsen in de beschikbare 28 dek locaties. De vloeistof handler is geïntegreerd met een positieve druk apparaat, orbitale shaker, en een apparaat om te verwarmen / afkoelen monsters in de 96 put plaat. Het positieve drukapparaat helpt bij het uitvoeren van bufferuitwisselingen in de SPE-platen tijdens het opruimen, terwijl de orbitale shaker helpt om de monsters te wervelen/mengen. Het robotplatform was geprogrammeerd om buffers en monsters op te zuipen en af te geven aan 96-putplaten, incubeer, vortexmonsters en overdrachtsplaten. Vloeistoffen met verschillende viscositeiten, zoals acetonitril en water, vereisen specifieke pipetting overwegingen die ook kunnen worden geprogrammeerd in de methode.
De cPILOT-workflow, vanaf eiwitkwantificering door BCA tot het labelen van de peptiden met isobaric tags (d.w.z. TMT), werd uitgevoerd op het vloeistofhandlersysteem. Het volledige protocol werd geschaald om 96 diepe putplaten te gebruiken die 2 mL per put kunnen bevatten. De buffers werden vóór het begin van het experiment voorbereid en toegevoegd aan de 96 putplaat om parallelle monsterverwerking mogelijk te maken. In deze studie, 22 workflow replica's van muis lever homogenaat werden toegevoegd aan de diepe put platen en genomen door middel van de cPILOT protocol. Ten slotte werd een enkel monster, bestaande uit de 22-plex equimolar muis lever gelabelde peptiden geïnjecteerd naar de massaspectrometer. Reporter ion intensiteiten die overeenkomen met peptide overvloed in de monsters aangetoond dat monsters verwerkt met de vloeibare handler hebben lagere cv's dan de handmatige protocol(gegevens niet getoond). Het robotplatform heeft ook de reproduceerbaarheid van monsterverwerking aanzienlijk verbeterd. Reproduceerbaarheid en robuustheid zijn zeer belangrijke factoren bij de verwerking van grote aantallen monsters. Pipetting fouten kan leiden tot volledige verkeerde interpretatie van de gegevens en hier de robot platform verstrekt lage inter-sample variatie. Ook het gebruik van het robotplatform voor de CPILOT heeft de tijd die nodig is om monsters te bereiden verminderd. Bijvoorbeeld, na het ontwikkelen van de geautomatiseerde methode, het vereiste 2,5 uur om 22 monsters te verwerken in vergelijking met 7,5 uur voor handmatige cPILOT. In ons laboratorium worden experimenten gedaan om vergelijkingen van de handmatige en geautomatiseerde cPILOT-workflows verder te evalueren. Op basis van eerdere rapporten uit ons laboratorium, de CV%'s van eiwit reporter ion intensiteiten in de handmatige cPILOT waren gemiddeld 20% met een aantal uitschieters boven deze waarde12.
cPILOT is een chemische afleidingsstrategie op peptideniveau, die kan worden gebruikt voor elk monstertype zoals cellen, weefsels en lichaamsvloeistoffen. cPILOT biedt verbeterde monster multiplexing en met de integratie van automatisering kan high-throughput monster multiplexing in proteomics vergemakkelijken. Deze doorvoer is nodig om ziekte en biologisch begrip en biomarkerontdekking verder te bevorderen.

Massaspectrometrie (MS)-gebaseerde proteomics is een onmisbaar onderzoeksinstrument bij het identificeren van ziektespecifieke biomarkers, het begrijpen van ziekteprogressie en het creëren van leads voor therapeutische ontwikkeling. Dit kan worden bereikt uit een reeks ziektegerelateerde klinische monsters, zoals bloedserum/plasma, proximale vloeistoffen en weefsels1,2. Proteomics biomarker ontdekking en validatie hebben onlangs opgedaan aanzienlijke aandacht als gevolg van de kracht van monster multiplexing strategieën3,4. Monster multiplexing is een techniek die gelijktijdige vergelijking en kwantificering van twee of meer monsteromstandigheden binnen één MS-injectie5,6mogelijkmaakt . Monster multiplexing wordt bereikt door het barcoding peptiden of eiwitten uit meerdere monsters met chemische, enzymatische of metabole tags en het verkrijgen van MS-informatie uit alle monsters in een enkel MS of MS / MS experiment. Onder de beschikbare isobaric tags zijn isobaric tagging reagentia (iTRAQ), commerciële tandem massa tags (TMT), en in huis gesynthetiseerd isobaric N,N-dimethyl leucine (DiLeu) reagentia met mogelijkheden tot 16-plex7 en 21-plex8, respectievelijk.
Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde sample multiplexing technologie. cPILOT combineert isotopen van peptide N-termini met licht [−(CH3)2] en zware [−(13C2H3)2] isotopen bij lage pH (∼2,5), waardoor het lysineresidu beschikbaar blijft voor latere hoge pH(8,5) isobarische etikettering met behulp van TMT, DiLeu, of iTRAQ tagging3,9,10,11,12,13,14. Het dual labeling schema van de cPILOT strategie is afgebeeld in supplementaire figuur 1 met twee monsters met behulp van een voorbeeld peptide. De nauwkeurigheid en precisie van de op TMT gebaseerde kwantificering op MS2-niveau kunnen in het gedrang komen als gevolg van de aanwezigheid van vervuilende co-geïsoleerde en co-gefragmenteerde ionen die als interferentie-effect15worden genoemd . Deze beperking in onnauwkeurige reporter ion ratio's kan worden overwonnen met behulp van tribrid Orbitrap massaspectrometers. Het interferentie-effect kan bijvoorbeeld worden overwonnen door een piek in een dimethylated paar op MS1-niveau in de massaspectrometer te isoleren, de lichte of zware piek te onderwerpen aan MS2-fragmentatie in de lineaire ionenval en vervolgens het meest intense MS2-fragment voor HCD-MS3 te onderwerpen om kwantitatieve informatie te verkrijgen. Om de kans op het selecteren van de peptiden zonder lysine amines beschikbaar voor het genereren van reporter ionen te verhogen, kan ook een selectieve MS3-acquisitie op basis van het y-1-fragment worden gebruikt en is het een aanpak die kan resulteren in een hoger percentage peptiden kwantificeerbaar met cPILOT9. De combinatie van lichte en zware etikettering verhoogt de multiplexingmogelijkheden van het monster met een factor 2x tot die van individuele isobarische tags. We hebben onlangs gebruik gemaakt van cPILOT te combineren tot 24 monsters in een enkel experiment met DiLeu reagentia16. Daarnaast is cPILOT gebruikt om oxidatieve post-translationele wijzigingen14 te bestuderen, waaronder eiwitnitrantie17, andere globale proteomen9, en heeft toepassingen aangetoond voor meerdere weefselmonsters in een alzheimermuismodel11.
Robuuste monstervoorbereiding is een kritieke stap in een cPILOT-experiment en kan tijdrovend, omslachtig en uitgebreid zijn. Verbeterde monster multiplexing vereist uitgebreide pipetting en hoogopgeleide laboratorium personeel, en er zijn verschillende factoren die sterk kunnen invloed hebben op de reproduceerbaarheid van het experiment. Zo is een zorgvuldige behandeling van monsters noodzakelijk om voor alle monsters vergelijkbare reactietijden te garanderen en om de juiste bufferpH voor lichte en zware dimethylated monsters te behouden. Bovendien kan handmatige bereiding van tientallen tot honderden monsters leiden tot een hoge experimentele fout. Daarom hebben we een geautomatiseerde cPILOT-workflow ontwikkeld om de variabiliteit van de monstervoorbereiding te verminderen, de kwantitatieve nauwkeurigheid te verbeteren en de experimentele doorvoer te verhogen. Automatisering wordt bereikt met behulp van een robotachtige vloeistofbehandelingsapparaat dat vele aspecten van de workflow kan voltooien(figuur 1). Monsterpreparaat van eiwitkwantificering tot peptide-etikettering werd uitgevoerd op een geautomatiseerde vloeistofhandler. De automatische vloeistofafhandelaar is geïntegreerd met een positief drukapparaat (PPA) voor bufferuitwisselingen tussen de solid-phase extraction (SPE) platen, orbitale shaker en een verwarmings-/koelapparaat. Het robotplatform bevat 28 deklocaties voor platen en buffers. Er zijn twee pods met een grijper om de platen binnen de deklocaties over te brengen: een 96-kanaals vaste volumepipettingkop (5-1100 μL) en 8-kanaals variabele volumesondes (1-1000 μL). Het robotplatform wordt aangestuurd met behulp van een software. De gebruiker moet professioneel worden opgeleid voordat de robotvloeistofhandler wordt gebruikt. De huidige studie richt zich op het automatiseren van de handmatige cPILOT workflow, die arbeidsintensief kan zijn voor de verwerking van meer dan 12 monsters in een enkele batch. Om de doorvoer van de cPILOT-aanpak11te verhogen, hebben we het cPILOT-protocol overgebracht naar een robotvloeistofhandler om meer dan 10 monsters parallel te verwerken. De automatisering maakt het ook mogelijk soortgelijke reacties voor elk monster parallel tijdens verschillende stappen van het monster voorbereidingsproces, die hoog opgeleide gebruikers nodig om te bereiken tijdens handmatige cPILOT. Dit protocol richt zich op de implementatie van het geautomatiseerde vloeistofbehandelingsapparaat voor het uitvoeren van cPILOT. De huidige studie beschrijft het protocol voor het gebruik van dit geautomatiseerde systeem en toont de prestaties met behulp van een 22-plex "proof-of-concept" analyse van muis lever homogenaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

We hebben een hoge doorvoer kwantitatieve proteomics workflow, gecombineerde precursor isototopische etikettering en isobaric tagging (cPILOT) geschikt voor multiplexing tot 22 of 24 monsters met tandem massa tags of isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectievelijk, in een enkel experiment. Deze verbeterde monster multiplexing vermindert aanzienlijk massaspectrometrie acquisitie tijden en verhoogt het nut van de dure commerciële isobarische reagentia. Het handmatige proces van monsterbehandeling en pipetting-stappen in de strategie kan echter arbeidsintensief, tijdrovend zijn en monsterverlies en kwantitatieve fouten introduceren. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door de integratie van automatisering. Hier hebben we het handmatige cPILOT-protocol overgebracht naar een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsapparaat dat grote monsternummers (d.w.z. 96 monsters) parallel kan voorbereiden. Over het geheel genomen verhoogt automatisering de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van de CPILOT en maakt het een breed gebruik mogelijk door andere onderzoekers met vergelijkbare automatiseringsapparaten.

Figuur 2 toont representatieve MS-gegevens van een peptide dat is geïdentificeerd in alle 22 reporter ionkanalen van een 22-plex cPILOT-experiment, inclusief workflowreplicaties. Figuur 2 (boven) toont een dubbel geladen piekpaar gescheiden door 4 Da m / z afstand met vermelding van een enkele dimethyl groep opgenomen in het peptide. De lichte en zware dimethylated piekparen werden geïsoleerd en onafhankelijk gefragmenteerd om de opeenvolging van het peptide op te leveren. De volgorde van het peptide is G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) en komt overeen met het eiwit Betaïne-homocysteïne S-methyl transferase. De meest intense fragmentionen voor zowel de lichte als de zware dimethylated pieken(niet getoond) werden verder geïsoleerd voor MS3 fragmentatie en de reporter ionen(m/z 126-131) worden weergegeven in figuur 2 (onder). De reporter ion intensiteiten zijn direct evenredig aan de peptide overvloed in de steekproef. De peptide overvloed van de monsters impliceert de pipetting vermogen van de robot platform is vrij uniform over de 22 monsters. In totaal resulteerde dit 22-plex cPILOT experiment in 1326 (1209-light/1181-heavy) eiwitten identificaties als gevolg van 3098 (6137-light/5872-heavy) peptiden (Tabel 4). Figuur 3 toont de doos plot van log10 overvloed ten opzichte van de totale reporter ion intensiteiten over alle 22 kanalen met mindere inter-well / inter-sample variabiliteit. Evaluatie van de totale automatisering werd gedaan door het onderzoeken van de fout in reporter ion overvloed over elk eiwit in de 22 monsters. Figuur 4 laat zien dat monsterverwerking met het robotplatform heeft geleid tot zeer lage CV-waarden. Specifiek, over de 3098 peptiden geïdentificeerd de gemiddelde CV in reporter ion overvloed was 12,36 % en 15,03 % voor lichte en zware dimethylated peptiden, respectievelijk. Onder deze peptiden 2032 van deze peptiden had reporter ion signaal boven de minimumdrempel en werden geacht kwantificeerbaar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Figuur 1. Experimentele workflow om 22 monsters parallel met een geautomatiseerd cPILOT-protocol te verwerken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Figuur 2. Kwantificering van peptiden over 22 monsters. Voorbeeld MS (boven) en MS3 (bodem) spectra van het peptide G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) gekwantificeerd in 22-plex geautomatiseerd cPILOT experiment voor licht dimethylated (linksonder) en zware dimethylated (rechtsonder) pieken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Figuur 3. Box plot van de totale reporter ion intensiteiten versus log10 overvloed van 22 monsters met behulp van proteome discoverer 2.3. Het RAW-bestand werd twee keer gezocht naar lichte en zware peptiden, eiwitten-id's afzonderlijk met TMT als dynamische modificatie, licht (+28.031 Da) en zwaar (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation bij peptide N-termini als statische modificatie. Een gecombineerde zoekopdracht met alle bovenstaande wijzigingen werd uitgevoerd met behulp van Proteome Discover 2.3 om de Log 10 Overvloed aan peptide intensiteiten over alle kanalen te verkrijgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Figuur 4. Viool percelen van co-efficiënte van variatie van peptide overvloed van samengevat reporter ion intensiteiten over kanalen 126-131 m/z. Het peptide werd gekwantificeerd met een gemiddelde CV-waarde van 12,36 en 15,03 voor licht (2373) en zware (2533) kwantificeerbare peptiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullend figuur 1. Illustratie van cPILOT met één enkel peptide. Met de isotopenetikettering van twee verschillende monsters en isobarische tagging met TMT126werd het resulterende mengsel voor LC-MS3geïnjecteerd in MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Variabele naam</td>
			<td>Waarde</td>
			<td>Beschrijving</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>Valse</td>
			<td>Valse zal de incubatietijden tot 30sec verminderen- True zal de incubatietijd in het protocol volgen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol (DTTVol)</td>
			<td>3</td>
			<td>Volume of DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filterplaat</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Plaat die voor desalting wordt gebruikt</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterplateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volume voor ontzilting</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes HAWaterWashes</td>
			<td>Valse</td>
			<td>Aantal waterwassingen op de SPE-plaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume iodoacetamide</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Volume peptide voor TMT-etikettering</td>
		</tr>
<tr>
<td>Druk</td>
			<td>100</td>
			<td>mbardruk bij PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Temperatuurverandering</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Te toevoegen isobaric-tagvolume</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volume om het monster te verdunnen voorafgaand aan de spijsvertering</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume trypsine</td>
		</tr>
<tr>
<td>PopTimer gebruiken</td>
			<td>Waar</td>
			<td>True geeft de opties weer om druk op de plaat toe te passen indien nodig</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Lijst van variabelen die worden gebruikt in het geautomatiseerde cPILOT-protocol.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilSource DilSource</td>
			<td>DilWell DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell DestWell</td>
			<td>DilVolume DilVolume</td>
			<td>Voorraadbron</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>VoorbeeldID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A3 A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A4 A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A5 A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A6 A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A8 A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A9 A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>A12 A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B8 B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Monsters</td>
			<td>B12 B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2. Volume van muisleverhomogeen en 8 M ureum.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>SourceWell</td>
			<td>BronWell2</td>
			<td>Verslaggever Ion</td>
			<td>DestWell1 DestWell1</td>
			<td>DestWell2 DestWell2</td>
			<td>Volume</td>
			<td>VoorbeeldID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1 E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3 A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5 A5</td>
			<td>C5 C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3 A3</td>
			<td>E3 E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7 C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4 A4</td>
			<td>E4 E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9 A9</td>
			<td>C9 C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5 A5</td>
			<td>E5 E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6 A6</td>
			<td>E6 E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7 E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8 A8</td>
			<td>E8 E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6.</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9 A9</td>
			<td>E9 E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8 B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10 E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11 E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Totaal aantal peptiden, eiwitten en peptide spectrale lucifers (PSM's).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Geautomatiseerde cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Licht</td>
			<td>Zware</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eiwitten</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptides</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSM's</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4. Barcoding de isobarische tags met de lichte en zware gelabelde monsters.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Ons geautomatiseerde cPILOT-protocol maakt het voor onderzoekers gemakkelijker om monsters op een hoge doorvoerwijze te analyseren. Dit is belangrijk omdat het ons in staat stelt om sneller bij biologische informatie over ziekten of verschillende aandoeningen te komen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt om meerdere monsters parallel te verwerken, waardoor bruikbare fouten worden verminderd tijdens het gebruik van hoge doorvoermonsters.Ons laboratorium is geïnteresseerd in toepassingen met betrekking tot veroudering en de ziekte van Alzheimer. Deze techniek kan echter ook worden gebruikt om elke ziekte of uitdaging te bestuderen voor waar biologische weefsels bij betrokken zijn. Begin met het inschakelen van het positieve drukapparaat, het verwarmings- en koelapparaat en de vacuümpompen.Sluit alle accessoires aan met de vloeistofhandler, die een blauw licht laat zien zodra dat is aangesloten op de computer en klaar is om te werken. Aliquot 300 microliters van de lever homogenaat in een 500 microliter buis en plaats het op een twee milliliter diepe put plaat. Bewaar het monster op vier graden Celsius tot het begin van het protocol.Open de methode in de software en plaats de benodigde tips en labware in hun posities. Schakel vervolgens met de laatste decklay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten. Laad 230 microliter tips en aanzuigen 90 microliter van acht molaire ureum uit het reservoir.Dan afzien aan rij een van de zwarte twee milliliter diepe put plaat. Ontlaad de uiteinden van TL1 en herhaal deze stap totdat ureum is toegevoegd aan alle putten. Na het toevoegen van de denaturatiebuffer gebruikt u 90 microlitertips om 10 microliter muisleverhomogeen over te brengen naar de diepe putplaat.Ontlaad de uiteinden, laad vervolgens een rij van 90 microliter tips en aspirate drie microliters van DTT uit reagens plaat een. Geef DTT af aan rijen één en twee van de diepe putplaat. Verzegel de monsterplaat met aluminiumfolie en broed deze gedurende 600 seconden op 37 graden Celsius terwijl u draait bij 300 RPM.Laad na de incubatie één op rij drie microliterpunten, haal zes microliter van IAM op reagensplaat één op rij drie en doseer deze aan een van de monsterplaat. Verzegel de monsterplaat en ontcubeer deze gedurende 30 minuten op vier graden Celsius terwijl u op 300 RPM draait op het koelapparaat. Maak vervolgens de monsterplaat los en laad een rij van 90 microliter tips.Aspirate vijf microliter cystine uit reagens plaat een op rij twee en afzien van het aan rijen een en twee van de monsterplaat. Broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie voert u gedurende 30 minuten een getimede shake van 1800 RPM uit.Voeg vervolgens 800 microliter van 20 millimolar Tris buffer met 10 millimolar calciumchloride toe aan elke put op de monsterplaat om de ureumconcentratie te verdunnen tot twee kies. Voeg 20 microliters trypsine toe aan de eerste rij van een 96 putplaat en plaats de plaat op een bepaalde locatie op het dek. Na het toevoegen van de trypsine aan de monsterplaat, verzegelen en uitbroeden voor 15 uur bij 37 graden Celsius en 600 RPM op de verwarming en koeling apparaat.Stop de spijsvertering door 150 microliter van 5% mierenzuur uit rij drie van de mierenzuurplaat te aspireren en deze op de monsterplaat in rijen één en twee af te geven. Ga over tot desalt de peptiden. Gebruik 1070 microliter tips om 600 microliter acetonitril aan tezuilen.Dan afzien in rijen een en twee van de vaste fase extractie, of SPE plaat, om C-18 te activeren. Laad vervolgens het verteerde monster in twee passen op de SPE-plaat. Laad twee rijen tips, aspirate 534 microliters van de verteerde monsters, en geef ze af aan rijen een en twee van de SPE-plaat.Druk op de plaat en herhaal deze stap totdat alle monsters zijn geladen. Reinig de peptiden door te wassen met water en verdun de peptiden met 60 tot 40 acetonitril in 0,1%mierenzuur. Plaats vervolgens de plaat op een verzamelplaat om de peptiden te ontwijken met behulp van het positieve drukapparaat.Teken de flow-through en het opzetten van de vereiste tips en labware in de software, crosscheck met het dek lay-out, en klik op Volgende om het protocol voor dimethylation voort te zetten. Reconstrueren van de peptiden in 1%azijnzuur. Om dimethylation labeling uit te voeren, laad 90 microliter tips en aspirate 16 microliter van 60 millimolar licht formaldehyde uit de tweede rij van reagens plaat twee.Doe het af om een van de monsterplaat te roeien en los vervolgens de uiteinden uit. Laad een rij van 90 microliter tips en aanzuigen 16 microliters van 60 millimolar zware formaldehyde uit rij drie van reagens plaat twee. Doe rij twee van de monsterplaat af en ontlaad de uiteinden.Laad twee rijen van 90 microliteruiteinden en aspiraat 16 microliter van 24 millimolar natriumcyanoborohydride en 24 millimolar natriumcyanoborodeuteride uit rijen één en twee van reagensplaat drie, dan delen de reagentia aan rijen een en twee van de monsterplaat om de dimethylation reactie te starten. Ontlaad de uiteinden en gebruik de orbitale shaker om een getimede shake gedurende 15 minuten uit te voeren bij 1800 RPM. Laad vervolgens twee rijen van 90 microliter tips en aspirate 32 microliters van 1%ammoniak uit rijen drie en vier van reagens plaat drie.Doe het in rijen een en twee van monster plaat twee om de reactie te stoppen. Combineer gelijke volumes van licht en zware dimethylated peptiden in een nieuwe twee milliliter diepe put plaat voor desalting. Na het ontzilten van de gecombineerde lichte en zware peptiden, droog de peptiden af en voer isobarische tagging uit.Reconstrueer de peptiden met 100 microliter van 100 millimolar triethylmonium bicarbonaat buffer op een orbitale shaker. Gebruik vervolgens 90 microlitertips om 25 microliter van de gecombineerde dimethylated peptiden op te halen en ze af te geven aan de eerste rij van de TMT-verwerkingsplaat. Laad een rij van 90 microliter tips en aspirate 10 microliter van TMT.Doe het af in de eerste rij van de TMT-verwerkingsplaat, ontlaad de tips en voer vervolgens een getimede shake uit gedurende een uur bij 1800 RPM. Aspirate acht microliters hydroxylamine uit rij twee van de TEAB-plaat en doseer deze aan een van de TMT-verwerkingsplaat. Na een shake van 15 minuten bij 1800 RPM, breng je 30,5 microliter van de TMT gelabelde peptiden over naar een buis van 1,5 milliliter.Ga dan verder met het verwerven en analyseren van gegevens volgens de handschriftaanwijzing. Representatieve MS-gegevens van een peptide geïdentificeerd in alle 22 reporter ion kanalen van een 22 Plex gecombineerde voorloper isopic etikettering en isobaric tagging experiment wordt hier getoond. De volgorde van het peptide komt overeen met betaïne-homocysteïne S-methyltransferase.De meest intense fragmentionen voor zowel de lichte als de zware dimethylated pieken werden verder geïsoleerd voor MS3 fragmentatie. De reporter ion intensiteiten zijn direct evenredig aan de peptide overvloed in de steekproef. Over het algemeen verminderde dit gecombineerde isotopische etiketterings- en isobarische tagging-experiment de verwerkingstijden van het monster en kon de eiwitexpressie via meerdere kanalen of omstandigheden worden gevisualiseerd.De box plot van log 10 overvloed versus totale reporter ion intensiteiten over alle 22 kanalen toont mindere inter-goed of inter-sample variabiliteit. Evaluatie van de totale automatisering werd gedaan door het onderzoeken van de fout in reporter ion overvloed over elk eiwit in de 22 monsters. Monsterverwerking met het robotplatform resulteerde in zeer lage variatiecoëfficiënten.Over de 3098 peptiden, de gemiddelde coëfficiënt van variatie in reporter ion overvloed was 12,36 en 15,03%voor lichte en zware dimethylated peptiden respectievelijk. Bij het proberen van dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat isotopen en isobarische niveaus worden gebruikt in een enkel experiment. Daarom moet een zorgvuldige planning worden uitgevoerd om elk monster aan te wijzen met de tags die bedoeld zijn om in het experiment te worden gebruikt.Deze methode kan gemakkelijk worden geïntegreerd in andere robotsystemen, en het kan worden toegepast op een verscheidenheid van weefsels, zoals weefsel of cel lysates en andere biofluïden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

High Precision zink isotoopmetingen Toegepast op Mouse Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, kwantificeren en Compound-specifieke isotopenanalyse van Pyrogene Carbon Met behulp van Benzeen polycarbonzuren (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Geautomatiseerde 90Sr scheiding en Preconcentration in een Lab-op-Valve-systeem op het niveau van de Ppq

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine-meta thesis door silica-ondersteunde katalysatoren met behulp van de methodologie van de Oppervlakteorganometaalchemie

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Isotopic effect in dubbele Proton overdracht proces van Porfycene onderzocht door verbeterde QM/MM-methode

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Monstervoorbereiding in kwartskristal microbalans metingen van eiwit adsorptie en polymeer mechanica

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...