Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Die Autoren würdigen vanderbilt University Start-up Funds und NIH Award (R01GM117191) an RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

cPILOT ist eine verbesserte Multiplexing-Strategie, die bis zu 24 Proben in einem einzigen Experiment analysieren kann. Die Multiplexing-Kapazität hängt von der Anzahl der verfügbaren isotopischen und isobarischen Tagging-Kombinationen ab. Die Einführung des TMTpro7, der in der Lage ist, 16 Proben in einzelexperimentn zu markieren, kann die Grenzen von cPILOT auf 32-plex verschieben. cPILOT besteht aus mehreren Pipettierschritten und erfordert umfangreiche Sorgfalt und Benutzerfertigkeiten, um die Probenvorbereitung durchzuführen. Auch bei einem fachkundigen Anwender sind manuelle Fehler unvermeidlich, die den Einsatz von Roboterplattformen zur Bearbeitung von Proben in der cPILOT-Strategie einlädt. Da cPILOT pH-abhängige Markierungen der Peptide verwendet, muss der pH-Wert für das Licht und den schweren dimethylierten Satz von Proben aufrechterhalten werden. Leicht saur-Basic pH kann zur Dimethylierung von N-Termini- und Lysinrückständen führen. Ein Vorteil von cPILOT ist, dass es nur die Hälfte der isobarischen Tags benötigt, da Peptid N-termini mit den Dimethylgruppen besetzt sind. Dadurch kann eine größere Anzahl von Proben zu halben Kosten gekennzeichnet werden. Die Handhabung größerer Probennummern erfordert, dass die Expositionszeiten für Reagenzien für die erste und die letzte Probe in einer Charge ähnlich sind. Ein Pipettenspender, der bis zu 32 Proben parallel aufnehmen kann, kann am besten mit Deminkern von Flüssigkeitshandhabungsgeräten erreicht werden.
Um mehrere Proben von cPILOT zu verarbeiten, wurde der manuelle Workflow um Automatisierung geändert. Der in dieser Studie verwendete Roboter-Flüssigkeitshandler verfügt über zwei Hülsen mit 96-Kanal- und 8-Kanal-Pipettierfähigkeiten, mit einem Greifer, um die Platten in den verfügbaren 28 Deckpositionen zu platzieren. Der Flüssigkeitshandler ist mit einem Positivdruckgerät, einem Orbital-Shaker und einer Vorrichtung zum Erhitzen/Kühlen von Proben in der 96-Well-Platte integriert. Der Positivdruckapparat hilft bei der Durchführung von Pufferaustauschen in den SPE-Platten während der Reinigung, während der Orbital-Shaker hilft, die Proben zu wirbeln/zu mischen. Die Roboterplattform wurde so programmiert, dass Sie Puffer und Proben an 96-Well-Platten, Inkubationen, Wirbelproben und Transferplatten ansaugen und verteilen. Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten, wie Acetonitril und Wasser, erfordern spezifische Pipettierüberlegungen, die auch in die Methode programmiert werden können.
Der cPILOT-Workflow, angefangen von der Proteinquantifizierung durch BCA bis zur Kennzeichnung der Peptide mit isobarischen Tags (d.h. TMT), wurde auf dem Flüssigkeitshandlersystem durchgeführt. Das komplette Protokoll wurde so skaliert, dass 96 Tiefbrunnenplatten verwendet werden, die 2 ml pro Brunnen aufnehmen können. Die Puffer wurden vor Beginn des Experiments vorbereitet und der 96-Wellplatte hinzugefügt, um eine parallele Probenbearbeitung zu ermöglichen. In der vorliegenden Studie wurden 22 Workflow-Replikationen von Mausleberhomogenat zu den Tiefenbrunnenplatten hinzugefügt und durch das cPILOT-Protokoll übernommen. Schließlich wurde dem Massenspektrometer eine einzige Probe injiziert, die aus den 22-plexe equimolaren Mausleber-Tagged-Peptiden besteht. Reporter-Ionen-Intensitäten, die Peptid-Überfluss in den Proben entsprachen, zeigten, dass Proben, die mit dem Flüssigkeitshandler verarbeitet wurden, niedrigere Lebensläufe haben als das manuelle Protokoll(Daten nicht gezeigt). Die Roboterplattform hat auch die Reproduzierbarkeit der Probenverarbeitung erheblich verbessert. Reproduzierbarkeit und Robustheit sind sehr wichtige Faktoren bei der Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben. Pipettierfehler können zu einer vollständigen Fehlinterpretation der Daten führen und hier sorgte die Roboterplattform für eine geringe Variation zwischen Denbeinern. Auch die Verwendung der Roboterplattform für cPILOT reduzierte die Zeit, die für die Probenvorbereitung benötigt wurde. Zum Beispiel, nach der Entwicklung der automatisierten Methode, benötigte es 2,5 h, um 22 Proben im Vergleich zu 7,5 h für manuelle cPILOT zu verarbeiten. In unserem Labor laufen Experimente, um Vergleiche der manuellen und automatisierten cPILOT-Workflows weiter zu bewerten. Basierend auf früheren Berichten aus unserem Labor lagen die CV%s der Proteinreporter-Ionenintensitäten im Handbuch cPILOT im Durchschnitt bei 20 %, wobei einige Ausreißer diesen Wert12überstiegen.
cPILOT ist eine chemische Derivatisierungsstrategie auf Peptidebene, die für jeden Probentyp wie Zellen, Gewebe und Körperflüssigkeiten verwendet werden kann. cPILOT bietet verbessertes Probenmultiplexing und kann mit der Integration von Automatisierung das Probenmultiplexing mit hohem Durchsatz in der Proteomik erleichtern. Dieser Durchsatz ist notwendig, um Krankheiten und biologisches Verständnis sowie die Entdeckung von Biomarkern weiter voranzutreiben.

Die auf der Massenspektrometrie (MS) basierende Proteomik ist ein unverzichtbares Forschungsinstrument, um krankheitsspezifische Biomarker zu identifizieren, das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen und Leads für die therapeutische Entwicklung zu schaffen. Dies kann aus einer Reihe von krankheitsbedingten klinischen Proben wie Blutserum/Plasma, proximale Flüssigkeiten und Gewebe1,2erreicht werden. Proteomics Biomarker Entdeckung und Validierung haben in letzter Zeit erhebliche Berücksichtigung aufgrund der Leistungsfähigkeit der Probenmultiplexing-Strategien3,4. Das Sample-Multiplexing ist eine Technik, die den gleichzeitigen Vergleich und die Quantifizierung von zwei oder mehr Probenbedingungen innerhalb einer einzelnen MS-Injektion5,6ermöglicht. Das Probenmultiplexing wird erreicht, indem Peptide oder Proteine aus mehreren Proben mit chemischen, enzymatischen oder metabolischen Tags gekodiert und MS-Informationen aus allen Proben in einem einzigen MS- oder MS/MS-Experiment erhalten werden. Zu den verfügbaren isobarischen Tags gehören isobaric Tagging Reagenzien (iTRAQ), kommerzielle Tandem-Massen-Tags (TMT) und im Haus synthetisierte isobaric N,N-dimethyl leucin (DiLeu) Reagenzien mit Fähigkeiten bis zu 16-plex7 bzw. 21-plex8.
Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und die isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Probenmultiplexing-Technologie. cPILOT kombiniert die Isotopenbeschriftung von Peptid N-Termini mit leichten [(CH3)2] und schweren[(13C2H3)2] Isotopen bei niedrigem pH-Wert (2,5 ), wodurch der Lysinrückstand für die anschließende hohe pH-Kennzeichnung (8,5) mit TMT, DiLeu oder iTRAQ-Tagging3,9,10,11,12,13,14" zur Verfügung steht. Das duale Kennzeichnungsschema der cPILOT-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 mit zwei Proben anhand eines Beispielpeptids dargestellt. Die Genauigkeit und Genauigkeit der TMT-basierten Quantifizierung auf MS2-Ebene kann durch das Vorhandensein kontaminierender, koisolierter und kofragmentierter Ionen, die als Interferenzeffekt15bezeichnet werden, beeinträchtigt werden. Diese Einschränkung in ungenauen Reporter-Ionen-Verhältnissen kann mit Hilfe von tribrid Orbitrap-Massenspektrometern überwunden werden. Beispielsweise kann der Interferenzeffekt überwunden werden, indem ein Peak in einem dimethylierten Paar auf der MS1-Ebene im Massenspektrometer isoliert wird, der leichte oder schwere Peak der MS2-Fragmentierung in der linearen Ionenfalle unterzogen wird und dann das intensivste MS2-Fragment für HCD-MS3 unterzogen wird, um quantitative Informationen zu erhalten. Um die Chancen auf die Auswahl der Peptide ohne Lysinamin elekläge, die für die Erzeugung von Reporterionen zur Verfügung stehen, zu erhöhen, kann auch eine selektiveMS3-Erfassung auf Basis des y-1-Fragments verwendet werden und ist ein Ansatz, der zu einem höheren Prozentsatz der mit cPILOT 9 quantifizierbaren Peptide führen kann. Die Kombination aus leichter und schwerer Beschriftung erhöht die Multiplexing-Fähigkeiten der Probe um den Faktor 2x auf den Faktor, der mit einzelnen isobarischen Tags erreicht wird. Wir haben vor kurzem cPILOT verwendet, um bis zu 24 Proben in einem einzigen Experiment mit DiLeu Reagenzien16zu kombinieren. Zusätzlich wurde cPILOT verwendet, um oxidative posttranslationale Modifikationen14 einschließlich Proteinnitration17, andere globale Proteome9, zu studieren und hat Anwendungen in mehreren Gewebeproben in einem Alzheimer-Mausmodell11demonstriert.
Robuste Probenvorbereitung ist ein kritischer Schritt in einem cPILOT-Experiment und kann zeitaufwändig, mühsam und umfangreich sein. Verbessertes Probenmultiplexing erfordert umfangreiches Pipettieren und hochqualifiziertes Laborpersonal, und es gibt mehrere Faktoren, die die Reproduzierbarkeit des Experiments stark beeinflussen können. Beispielsweise ist ein sorgfältiger Umgang mit Proben erforderlich, um ähnliche Reaktionszeiten für alle Proben zu gewährleisten und einen angemessenen Puffer-pH-Wert für leichte und schwere dimethylierte Proben aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann die manuelle Vorbereitung von Dutzenden bis Hunderten von Proben zu hohen experimentellen Fehlern führen. Um die Variabilität der Probenvorbereitung zu reduzieren, die quantitative Genauigkeit zu verbessern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, haben wir einen automatisierten cPILOT-Workflow entwickelt. Die Automatisierung erfolgt mit einem Roboter-Flüssigkeitshandlinggerät, das viele Aspekte des Workflows vervollständigen kann (Abbildung 1). Die Probenvorbereitung von der Proteinquantifizierung bis zur Peptidkennzeichnung wurde auf einem automatisierten Flüssigkeitshandler durchgeführt. Der automatisierte Flüssigkeitshandler ist mit einem Positivdruckgerät (PPA) für den Pufferaustausch zwischen den Festphasen-Extraktionsplatten (SPE), dem Orbitalshaker und einem Heiz-/Kühlgerät integriert. Die Roboterplattform enthält 28 Deckstandorte für Platten und Puffer. Es gibt zwei Hülsen mit einem Greifer, um die Platten innerhalb der Deckpositionen zu übertragen: einen 96-Kanal-Festvolumen-Pipettierkopf (5-1100 l) und 8 Kanal-Variable Volumensonden (1-1000 l). Die Roboterplattform wird über eine Software gesteuert. Der Anwender muss professionell geschult werden, bevor er den Roboter-Flüssigkeitshandler verwendet. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Automatisierung des manuellen cPILOT-Workflows, der für die Verarbeitung von mehr als 12 Proben in einer Charge arbeitsintensiv sein kann. Um den Durchsatz des cPILOT-Ansatzes11zu erhöhen, haben wir das cPILOT-Protokoll an einen Roboter-Flüssigkeitshandler übertragen, um mehr als 10 Proben parallel zu verarbeiten. Die Automatisierung ermöglicht auch ähnliche Reaktionen für jede Probe parallel während verschiedener Schritte des Probenvorbereitungsprozesses, die hochqualifizierte Benutzer während der manuellen cPILOT zu erreichen erforderte. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Implementierung der automatisierten Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung zur Durchführung von cPILOT. Die vorliegende Studie beschreibt das Protokoll für die Verwendung dieses automatisierten Systems und demonstriert seine Leistungsfähigkeit anhand einer 22-plexitorischen "Proof-of-Concept"-Analyse von Mausleberhomogenaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Wir haben einen quantitativen Proteomik-Workflow mit hohem Durchsatz, kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarischeKennzeichnung (cPILOT) eingeführt, die in der Lage ist, bis zu 22 bzw. 24 Proben mit Tandem-Massen-Tags oder isobaric N,N-Dimethyl-Leucin-Isobaric-Tags bzw. in einem einzigen Experiment zu multiplexen. Dieses verbesserte Probenmultiplexing reduziert die Erfassungszeiten der Massenspektrometrie erheblich und erhöht den Nutzen der teuren kommerziellen isobarischen Reagenzien. Der manuelle Prozess der Probenhandhabung und Pipettierschritte in der Strategie kann jedoch arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein und zu Probenverlusten und quantitativen Fehlern führen. Diese Einschränkungen können durch die Integration der Automatisierung überwunden werden. Hier haben wir das manuelle cPILOT-Protokoll an ein automatisiertes Flüssigkeitshandhabungsgerät übertragen, das große Probennummern (d.h. 96 Proben) parallel erstellen kann. Insgesamt erhöht die Automatisierung die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit von cPILOT und ermöglicht eine breite Nutzung durch andere Forscher mit vergleichbaren Automatisierungsgeräten.

Abbildung 2 zeigt repräsentative MS-Daten eines Peptids, das in allen 22 Reporterionenkanälen aus einem 22-Plex-cPILOT-Experiment identifiziert wurde, einschließlich Workflow-Replikationen. Abbildung 2 (oben) zeigt ein doppelt geladenes Spitzenpaar, das durch 4 Da m/z-Abstand getrennt ist und eine einzelne Dimethylgruppe anzeigt, die in das Peptid integriert ist. Die leichten und schweren dimethylierten Spitzenpaare wurden unabhängig voneinander isoliert und fragmentiert, um die Sequenz des Peptids zu ergeben. Die Sequenz des Peptids ist G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) und entspricht dem Protein Betain-Homocystein-S-Methyltransferase. Die intensivsten Fragmentionen sowohl für die leichten als auch für die schweren dimethylierten Spitzen(nicht dargestellt)wurden für die MS3-Fragmentierung weiter isoliert und die Reporterionen (m/z 126-131) sind in Abbildung 2 (unten) dargestellt. Die Ionenintensitäten des Reporters stehen in direktem Verhältnis zur Peptidfülle in der Probe. Die Peptidfülle der Proben impliziert, dass die Pipettierfähigkeit der Roboterplattform in den 22 Proben ziemlich gleichmäßig ist. Insgesamt ergab dieses 22-plexcPILOT-Experiment 1326 (1209-light/1181-heavy) Protein-Identifikationen, die aus 3098 (6137-light/5872-heavy) Peptiden resultierten (Tabelle 4). Abbildung 3 zeigt das Box-Diagramm der log10-Überfluss menge im Vergleich zu den Gesamt-Reporterionenintensitäten auf allen 22 Kanälen, die eine geringere Inter-Well-/Inter-Sample-Variabilität anzeigen. Die Bewertung der Gesamtautomatisierung erfolgte durch die Untersuchung des Fehlers in der Reporterionenfülle über jedes Protein in den 22 Proben. Abbildung 4 zeigt, dass die Probenverarbeitung mit der Roboterplattform zu sehr niedrigen CV-Werten geführt hat. Insbesondere betrug bei den 3098 festgestellten Peptiden der durchschnittliche Lebenslauf in der Reporterionenfülle 12,36 % bzw. 15,03 % für leichte und schwere dimethylierte Peptide. Unter diesen Peptiden 2032 dieser Peptide hatte Reporter-Ionen-Signal über der Mindestschwelle und wurden als quantifizierbar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Abbildung 1. Experimenteller Workflow zur Verarbeitung von 22 Proben parallel zu einem automatisierten cPILOT-Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Abbildung 2. Quantifizierung von Peptiden in 22 Proben. Beispiel MS (oben) und MS3 (unten) Spektren des Peptids G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) quantifiziert in 22-plexe automatisiertem cPILOT-Experiment für leichte dimethylierte (unten links) und schwere dimethylierte (unten rechts) Spitzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Abbildung 3. Box-Plot der gesamten Reporterionenintensitäten im Vergleich zu log10 Fülle von 22 Proben mit Proteom-Entdecker 2.3. Die RAW-Datei wurde zweimal nach leichten und schweren Peptiden, Protein-IDs getrennt mit TMT als dynamische Modifikation, leicht (+28.031 Da) und schwerer (+36.076 & +35.069 Da) Dimethylierung bei Peptid N-termini als statische Modifikation durchsucht. Eine kombinierte Suche mit allen oben genannten Modifikationen wurde mit Proteome Discover 2.3 ausgeführt, um die Log 10 Fülle von Peptidintensitäten über alle Kanäle zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Abbildung 4. Geigenplots der Koeffizienten der Variation der Peptidfülle von summierten Reporterionenintensitäten über Kanäle 126-131 m/z. Das Peptid wurde mit einem durchschnittlichen CV-Wert von 12,36 und 15,03 für leichte (2373) und schwere (2533) quantifizierbare Peptide quantifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1. Abbildung des cPILOT mit einem einzigen Peptid. Die Isotop-Kennzeichnung von zwei verschiedenen Proben und isobaric-Tagging mit TMT126wurde der resultierenden Mischung in MS für LC-MS3injiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Variablenname</td>
			<td>Wert</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volumen für Entaltschritt 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volumen für Desaltschritt 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volumen für Entaltschritt 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>FALSE</td>
			<td>False verkürzt die Inkubationszeiten auf 30sec- True folgt dem Inkubationszeitpunkt im Protokoll.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Volumen der DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlate</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Platte zur Entsalzung</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volumen zum Entsalzen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>FALSE</td>
			<td>Anzahl der Wasserwass auf der SPE-Platte</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volumen von Iodoacetamid</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Peptidvolumen für die TMT-Kennzeichnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Druck</td>
			<td>100</td>
			<td>mbar Druck bei PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Temperaturänderung</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Isobaric-Tag-Volume wird hinzugefügt</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volumen zur Verdünnung der Probe vor der Verdauung</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volumen von Trypsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>UsePopTimer</td>
			<td>STIMMT</td>
			<td>True zeigt die Optionen zum Druck auf die Platte bei Bedarf an</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Liste der Variablen, die im automatisierten cPILOT-Protokoll verwendet werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilSource</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Proben</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2. Volumen der Mausleber homogenat und 8 M Harnstoff.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>SourceWell</td>
			<td>SourceWell2</td>
			<td>Reporter Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Gesamtzahl der Peptide, Proteine und Peptidspektralübereinstimmungen (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Automatisierter cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Licht</td>
			<td>Schwere</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteine</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptide</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>Psms</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4. Barcoding der isobaric Tags mit den leichten und schweren beschrifteten Proben.

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Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.

Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Unser automatisiertes cPILOT-Protokoll erleichtert es Forschern, Proben mit hohem Durchsatz zu analysieren. Dies ist wichtig, weil es uns ermöglicht, zu biologischen Informationen über Krankheiten oder verschiedene Bedingungen viel schneller zu gelangen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hilft, mehrere Samples parallel zu verarbeiten, wodurch umsetzbare Fehler bei Verwendung von Proben mit hohem Durchsatz reduziert werden.Unser Labor interessiert sich für Anwendungen im Zusammenhang mit Alterung und Alzheimer-Krankheit. Diese Technik kann jedoch auch verwendet werden, um jede Krankheit oder Herausforderung zu untersuchen, wenn biologisches Gewebe beteiligt sind. Beginnen Sie mit dem Einschalten des Überdruckgeräts, des Heiz- und Kühlgeräts und der Vakuumpumpen.Schließen Sie alle Zubehörteile mit dem Flüssigkeitshandler an, der ein blaues Licht anzeigt, sobald es mit dem Computer verbunden und betriebsbereit ist. Aliquot 300 Mikroliter der Leber homogenisieren in eine 500-Mikroliter-Röhre und legen Sie sie auf eine zwei Milliliter tiefe Brunnenplatte. Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius bis zum Beginn des Protokolls auf.Öffnen Sie die Methode in der Software und platzieren Sie die erforderlichen Tipps und Labware in ihre Positionen. Überprüfen Sie dann das endgültige Decklayout und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll fortzusetzen. 230 Mikroliter-Spitzen laden und 90 Mikroliter von acht Molharnstoff aus dem Reservoir ansaugen.Dann geben Sie es, um eine der schwarzen zwei Milliliter tiefen Brunnenplatte zu rudern. Entladen Sie die Spitzen von TL1 und wiederholen Sie diesen Schritt, bis Harnstoff in allen Brunnen hinzugefügt wurde. Nach Dem Hinzufügen des Denaturierungspuffers verwenden Sie 90 Mikroliter-Spitzen, um 10 Mikroliter Mausleber homogenat auf die Tiefe Brunnenplatte zu übertragen.Entladen Sie die Spitzen, dann laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter Spitzen und aspirieren Sie drei Mikroliter DTT von Reagenzplatte eins. Geben Sie DTT auf die Reihen eins und zwei der tiefen Brunnenplatte. Versiegeln Sie die Probenplatte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie sie bei 37 Grad Celsius für 600 Sekunden, während Sie sich bei 300 Umdrehungen drehen.Nach der Inkubation eine Reihe von 90 Mikroliterspitzen laden, sechs Mikroliter IAM von Reagenzplatte eins in Reihe drei ansaugen und für eine Reihe der Probenplatte abgeben. Versiegeln Sie die Probenplatte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, während Sie sich bei 300 Umdrehungen pro Minute auf dem Kühlgerät drehen. Dann die Probenplatte entsiegeln und eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen laden.Fünf Mikroliter Cystin aus Reagenzplatte eins in Reihe zwei aspirieren und in die Reihen eins und zwei der Probenplatte geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Führen Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang einen Zeitshake von 1800 RPM durch.Dann fügen Sie 800 Mikroliter 20 Millimolar Tris Puffer mit 10 Millimolar Calciumchlorid zu jedem Brunnen auf der Probenplatte, um die Harnstoffkonzentration auf zwei Molaren zu verdünnen. Fügen Sie 20 Mikroliter Trypsin in die erste Reihe einer 96-Well-Platte und legen Sie die Platte an einer bestimmten Stelle auf dem Deck. Nachdem Sie das Trypsin auf die Probenplatte gesetzt haben, versiegeln und bebrüten Sie es 15 Stunden bei 37 Grad Celsius und 600 Umdrehungen pro Minute auf dem Heiz- und Kühlgerät.Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 150 Mikroliter 5%Ameisensäure aus Reihe drei der Ameisensäureplatte ansaugen und an die Probenplatte in den Zeilen eins und zwei abgeben. Fahren Sie fort, um die Peptide zu entsalzen. Verwenden Sie 1070 Mikroliter-Spitzen, um 600 Mikroliter Acetonitril zu aspirieren.Geben Sie es dann in den Zeilen eins und zwei der Festphasenextraktion oder SPE-Platte aus, um C-18 zu aktivieren. Als nächstes laden Sie die verdaute Probe in zwei Durchgängen auf die SPE-Platte. Laden Sie zwei Reihen von Spitzen, aspirieren Sie 534 Mikroliter der verdauten Proben und geben Sie sie an die Reihen eins und zwei der SPE-Platte.Drücken Sie auf die Platte und wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Proben geladen sind. Reinigen Sie die Peptide durch Waschen mit Wasser und verdünnen Sie die Peptide mit 60 bis 40 Acetonitril in 0,1% Ameisensäure. Legen Sie dann die Platte auf eine Sammelplatte, um die Peptide mit dem Positivdruckgerät zu entschärfen.Zeichnen Sie den Durchfluss herunter und richten Sie die erforderlichen Tipps und Labware in der Software ein, kreuzen Sie die Seite mit dem Decklayout ab, und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll für die Dimethylierung fortzusetzen. Die Peptide in 1%essigsäure rekonstituieren. Zur Durchführung der Dimethylierungskennzeichnung 90 Mikroliter-Spitzen laden und 16 Mikroliter 60 Millimolar-Lichtformaldehyd aus der zweiten Reihe der Reagenzplatte zwei absaugen.Geben Sie es, um eine der Probenplatte zu rudern, dann entladen Sie die Spitzen. Laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 16 Mikroliter 60 Millimolar schweres Formaldehyd aus Reihe drei der Reagenzplatte zwei. Geben Sie es Zeile zwei der Probenplatte und entladen Sie die Spitzen.Laden Sie zwei Reihen von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 16 Mikroliter 24 Millimolar Natriumcyanoborohydrid und 24 Millimolar Natriumcyanoborodeuterid aus den Reihen eins und zwei der Reagenzplatte drei, dann geben Sie die Reagenzien an die Reihen eins und zwei der Probenplatte, um die Dimethylierungsreaktion zu starten. Entladen Sie die Spitzen und verwenden Sie den Orbital-Shaker, um einen zeitgetisten Shake für 15 Minuten bei 1800 RPM durchzuführen. Dann zwei Reihen von 90 Mikroliter Spitzen laden und 32 Mikroliter 1%Ammoniak aus den Reihen drei und vier der Reagenzplatte drei aspirieren.Geben Sie es in die Reihen eins und zwei der Probenplatte zwei, um die Reaktion zu stoppen. Kombinieren Sie gleiche Mengen an leichten und schweren dimethylierten Peptiden in einer neuen zwei Milliliter tiefen Brunnenplatte zum Entsalzen. Nach dem Entsalzen der kombinierten leichten und schweren Peptide trocknen Sie die Peptide aus und führen Sie isobaric Tagging durch.Rekonstituieren Sie die Peptide mit 100 Mikrolitern 100 Millimolar Triethylmonium BicarbonatPuffer auf einem Orbitalshaker. Dann verwenden Sie 90 Mikroliter-Spitzen, um 25 Mikroliter der kombinierten dimethylierten Peptide zu aspirieren und in die erste Reihe der TMT-Verarbeitungsplatte zu geben. Laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 10 Mikroliter TMT.Geben Sie es in der ersten Reihe der TMT-Verarbeitungsplatte, entladen Sie die Spitzen, und führen Sie dann einen zeitgezeitigten Shake für eine Stunde bei 1800 RPM durch. Acht Mikroliter Hydroxylamin aus Reihe zwei der TEAB-Platte ansaugen und für eine der TMT-Verarbeitungsplatten abgeben. Nach einem 15-minütigen Schütteln bei 1800 U/min 30,5 Mikroliter der TMT-markierten Peptide in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen.Fahren Sie dann mit der Datenerfassung und -analyse gemäß den Manuskriptrichtungen fort. Repräsentative MS-Daten eines Peptids, das in allen 22 Reporterionenkanälen aus einem 22 Plex kombinierten Vorläufer-Isotop-Etikettierung und einem isobarischen Tagging-Experiment identifiziert wurde, werden hier gezeigt. Die Sequenz des Peptids entspricht Betain-Homocystein-S-Methyltransferase.Die intensivsten Fragmentionen sowohl für die leichten als auch für die schweren dimethylierten Spitzen wurden für die MS3-Fragmentierung weiter isoliert. Die Ionenintensitäten des Reporters stehen in direktem Verhältnis zur Peptidfülle in der Probe. Insgesamt reduzierte dieses kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierungs- und isobarische Tagging-Experiment die Probenverarbeitungszeiten und ermöglichte es, die Proteinexpression über mehrere Kanäle oder Bedingungen hinweg zu visualisieren.Das Box-Plot von Log 10 Fülle im Vergleich zu gesamt Reporterionenintensitäten auf allen 22 Kanälen zeigt eine geringere Inter-Well- oder Inter-Sample-Variabilität. Die Bewertung der Gesamtautomatisierung erfolgte durch die Untersuchung des Fehlers in der Reporterionenfülle über jedes Protein in den 22 Proben. Die Probenverarbeitung mit der Roboterplattform führte zu sehr niedrigen Variationskoeffizienten.Über die 3098 Peptide hinweg betrug der durchschnittliche Variationskoeffizient in der Reporterionenfülle 12,36 bzw. 15,03 % bei leichten und schweren dimethylierten Peptiden. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig zu bedenken, dass isotopen- und isobarische Ebenen in einem einzigen Experiment verwendet werden. Daher muss sorgfältig geplant werden, um jede Probe mit den Tags zu bestimmen, die für das Experiment verwendet werden sollen.Diese Methode kann leicht in andere Robotersysteme integriert werden, und es kann auf eine Vielzahl von Geweben angewendet werden, wie Gewebe oder Zelllysate und andere Biofluide.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Forschung

Chemie

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

High Precision Zink Isotopenmessungen an Maus-Orgeln Angewandte

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Charakterisierung, Quantifizierung und substanzspezifische Isotopenanalyse von Pyrogene Kohle Benzolpolycarbonsäuren (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automatisierte 90Sr Trennung und Anreicherung in einem Labor-Valve System auf Ppq-Ebene

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine Metathesis von Silica-unterstützten Katalysatoren mit der Methodik der Oberflächenorganometallischen Chemie

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Isotopische Wirkung im doppelten Protonentransferprozess von Porphycen nach verbesserter QM/MM-Methode untersucht

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Probenvorbereitung in Quarzkristall-Mikrobilanzmessungen der Proteinadsorption und Polymermechanik

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...