Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

המחברים מכירים בקרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת ונדרבילט ובפרס NIH (R01GM117191) ל-RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

cPILOT היא אסטרטגיית מוליפלקס משופרת שיכולה לנתח עד 24 דגימות בניסוי יחיד. קיבולת ההטיה תלויה במספר שילובי התיוגים באיזוטופיים ואיזובאריים הזמינים. הקדמה של TMTpro7, אשר מסוגל תיוג 16 דגימות בניסוי יחיד, יכול לדחוף את הגבולות של CPILOT ל 32-plex. CPILOT מורכבת ממספר שלבי צנרת ודורשת טיפול נרחב וכישורי משתמש לביצוע הכנה לדוגמה. גם עם משתמש מומחה, שגיאות ידניות הן בלתי נמנעות, אשר מזמינה את השימוש בפלטפורמות רובוטיות כדי לעבד דגימות באסטרטגיית cPILOT. מכיוון ש-CPILOT משתמש בתיוג תלוי pH של הפפטידים, יש לשמור על ה-pH עבור האור ואת סט הדגימות הכבדות. חומציות בסיסית במתינות pH יכול לגרום dimethylation של שני משקעים N-termini ו לינזין. היתרון של cPILOT הוא שזה דורש רק מחצית תגי isobaric מאז פפטיד N-termini עסוקים עם קבוצות דימתיל. זה מאפשר מספר גדול יותר של דגימות להיות מתויג בחצי העלות. טיפול במספרים לדוגמה גדולים יותר מחייב שזמן החשיפה של Reagent יהיה דומה לדוגמה הראשונה והאחרון באצווה. מתקן פיפטה שיכול להכיל עד 32 דגימות במקביל ניתן להשיג בצורה הטובה ביותר עם השימוש במכשירי טיפול בנוזל רובוטי.
על מנת לעבד דגימות מרובות על ידי cPILOT, זרימת העבודה הידנית תוקנה כדי לשלב אוטומציה. המטפל הנוזלי הרובוטי המשמש במחקר זה יש שני תרמילים עם יכולות pipetting 96-ערוצים ו 8 ערוצים, עם תופס למקם את הצלחות 28 מיקומי הסיפון הזמינים. המטפל הנוזלי משולב עם מערכת לחץ חיובית, שייקר מסלול, והתקן לדגימות חום/צינון בצלחת 96 באר. אפליקציית הלחץ החיובי מסייעת בביצוע חילופי חיץ בצלחות SPE במהלך הניקוי, בעוד שמנער המסלול מסייע למערבולת/לערבב את הדגימות. הפלטפורמה הרובוטית תוכנתה לשאוף ולחלק מאגרים ודגימות ל-96 לוחות, דגירה, דגימות מערבולת ולוחיות העברה. נוזלים עם צמיגות שונות, כגון acetonitrile ומים, דורשים שיקולי pipetting ספציפיים שניתן גם לתכנת לתוך השיטה.
זרימת העבודה של CPILOT, החל מכמת חלבון על ידי BCA ועד לתיוג הפפטידים עם תגיות איזובריות (כלומר, TMT), בוצעה במערכת המטפל הנוזלי. הפרוטוקול המלא היה קנה מידה להשתמש 96 צלחות באר עמוק שיכול להכיל 2 מ"ל לכל באר. המאגרים הוכנו לפני תחילת הניסוי והוספו לצלחת 96 באר כדי לאפשר עיבוד מדגם מקבילי. במחקר הנוכחי, 22 שכפולים של זרימת עבודה של הומוגנאט כבד העכבר נוספו צלחות באר עמוקה ונלקחו דרך פרוטוקול cPILOT. לבסוף, דגימה אחת המורכבת כבד עכבר שיווי משקל 22-plex מתויג פפטידים הוזרק ספקטרומטר המסה. עוצמת היונים העיתונאית המתאימה לשפע פפטיד בדגימות הוכיחה כי דגימות המעובדות עם המטפל הנוזלי יש CVs נמוך יותר מאשר הפרוטוקול הידני(נתונים לא מוצגים). הפלטפורמה הרובוטית גם שיפרה מאוד את יכולת הרבייה של עיבוד לדוגמה. שכפול וחוסן הם גורמים חשובים מאוד בעת עיבוד מספר גדול של דגימות. שגיאות Pipetting יכול להוביל לפרשנות שגויה מלאה של הנתונים וכאן הפלטפורמה הרובוטית סיפקה וריאציה בין-מדגם נמוך. כמו כן, השימוש בפלטפורמה הרובוטית ל-CPILOT הפחית את הזמן הנדרש להכנת דגימות. לדוגמה, לאחר פיתוח השיטה האוטומטית, נדרשו 2.5 שעות כדי לעבד 22 דגימות בהשוואה ל-7.5 שעות עבור CPILOT ידני. ניסויים הם מתמשכים במעבדה שלנו כדי להעריך עוד יותר השוואות של זרימות עבודה ידניות ואוטומטיות של CPILOT. בהתבסס על דיווחים קודמים מהמעבדה שלנו, CV%'s של עוצמת יון כתב חלבון בcPILOT ידני היו בממוצע 20% עם כמה חריגים עולה עלערך זה 12.
cPILOT היא אסטרטגיית נגזרות כימית ברמת הפפטיד, שניתן להשתמש בה עבור כל סוג מדגם כגון תאים, רקמות ונוזלי גוף. cPILOT מציעה מולטיפלקס מדגם משופר ועם שילוב של אוטומציה יכול להקל על מולטיפלקס מדגם בתפוקה גבוהה פרוטאומיקה. תפוקה זו נחוצה כדי לקדם עוד יותר מחלות והבנה ביולוגית וגילוי סמן ביולוגי.

ספקטרומטריית מסה (MS) פרוטאומיקה מבוססת הוא כלי מחקר חיוני בזיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים למחלה, הבנת התקדמות המחלה, ויצירת לידים לפיתוח טיפולי. ניתן להשיג זאת ממגוון של דגימות קליניות הקשורות למחלות כגון סרום דם/ פלזמה, נוזלים פרוקסימליים,ורקמות 1,2. גילוי ואימות של סמן ביולוגי Proteomics זכו לאחרונה לשיקול משמעותי בשל העוצמה של אסטרטגיות מרובותמדגם 3,4. מדגם multiplexing היא טכניקה המאפשרת השוואה בו-זמנית וכמות של שני תנאי מדגם או יותר בתוך הזרקת MSאחת 5,6. מדגם multiplexing מושגת על ידי פפטידים ברקוד או חלבונים מדגימות מרובות עם כימי, אנזימטי, או תגים מטבוליים וקבלת מידע MS מכל הדגימות בניסוי אחד MS או MS / MS. בין תגיות isobaric זמין הם ריאגנטים תיוג isobaric (iTRAQ), מסחרי תגים המוניים טנדם (TMT), ובבית מסונתז isobaric N,N-dimethyl leucine (DiLeu) ריאגנטים עם יכולות של עד 16-plex7 ו 21-plex8,בהתאמה.
תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזוברי (cPILOT) הוא טכנולוגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת. cPILOT משלב תיוג איזוטופי של פפטיד N-termini עם אור [-(CH3)2] וכבד [(13 C2H3)2]איזוטופים ב pH נמוך (∼2.5), אשר שומר על שאריות לינזין זמין עבור pH גבוה עוקבות (8.5) תיוג איזוברי באמצעות TMT, דילאו, או תיוג iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. ערכת התיוג הכפולה של אסטרטגיית cPILOT מתוארת בדמות משלימה 1 עם שתי דוגמאות באמצעות פפטיד לדוגמה. הדיוק והדיוק של הכימות מבוסס TMT ברמת MS2 יכול להיות בסכנה בשל הנוכחות של מזהמים יונים מבודדים ומפוצלים co-fragmented בשם אפקטההפרעה 15. מגבלה זו ביחסי יון עיתונאי לא מדויק ניתן להתגבר בעזרת ספקטרומטרים מסה Orbitrap טריברי. לדוגמה, ניתן להתגבר על אפקט ההפרעה על-ידי בידוד שיאבזוג dimethylated ברמת MS 1 בספקטרומטר המסה, עצם הפסגה הקלה אוהכבדה לפיצול MS 2 במלכודת היונים הליניארית ולאחר מכן עצם שבר MS2 האינטנסיבי ביותר עבור HCD-MS3 כדי להשיג מידע כמותי. על מנת להגדיל את הסיכויים לבחור את הפפטידים ללא ליסין אמין זמין ליצירת יונים עיתונאיים, רכישת MS3 סלקטיבית המבוססת על שבר y-1 גם ניתן להשתמש והיא גישה אשר יכול לגרום אחוז גבוה יותר של פפטידים הניתנים לכימות עם cPILOT9. השילוב של תיוג קל וכבד מגדיל את יכולות ההטיה לדוגמה על-ידי פקטור של פי 2 לזה שהושג עם תגיות isobaric בודדות. לאחרונה השתמשנו cPILOT לשלב עד 24 דגימות בניסוי יחיד עם Reagents DiLeu16. בנוסף, נעשה שימוש ב-CPILOT כדי ללמוד שינויים חמצוניים לאחרתרגום 14, כולל חנקתחלבון 17, פרוטאומיםגלובליים אחרים 9, והדגימה יישומים על פני דגימות רקמות מרובות במודל עכבר מחלתאלצהיימר 11.
הכנת מדגם איתנה היא צעד קריטי בניסוי של CPILOT והיא יכולה להיות גוזלת זמן, מייגעת ונרחבת. מדגם משופר מולטיפלקסינג דורש צנרת נרחבת ואנשי מעבדה מיומנים, ויש מספר גורמים שיכולים להשפיע במידה רבה על יכולת הרבייה של הניסוי. לדוגמה, יש צורך בטיפול זהיר בדגימות כדי להבטיח זמני תגובה דומים עבור כל הדגימות ולשמור על pH של מאגר מתאים לדגימות דימתילציה קלות וכבדות. יתר על כן, הכנה ידנית של עשרות עד מאות דגימות יכולה לגרום לשגיאה ניסיונית גבוהה. לכן, כדי להפחית את השתנות הכנת המדגם, לשפר את הדיוק הכמותי ולהגדיל את התפוקה הניסיונית, פיתחנו זרימת עבודה אוטומטית של cPILOT. אוטומציה מושגת באמצעות התקן רובוטי לטיפול בנוזלים שיכול להשלים היבטים רבים של זרימת העבודה (איור 1). הכנה לדוגמה מכמת חלבונים לתיוג פפטיד בוצעה על מטפל נוזלי אוטומטי. המטפל הנוזלי האוטומטי משולב עם מערכת לחץ חיובית (PPA) לחילופי חוצץ בין לוחות החילוץ (SPE) של שלב מוצק, שייקר מסלולי והתקן חימום/קירור. הפלטפורמה הרובוטית מכילה 28 מיקומי סיפון כדי להכיל לוחות ומאגרים. ישנם שני תרמילים עם תופסן להעביר את הצלחות בתוך מיקומי הסיפון: ראש pipetting נפח קבוע 96 ערוצים (5-1100 μL) ו 8 ערוצים נפח משתנה בדיקות (1-1000 μL). הפלטפורמה הרובוטית נשלטת באמצעות תוכנה. המשתמש צריך להיות מאומן באופן מקצועי לפני השימוש המטפל נוזלי רובוטי. המחקר הנוכחי מתמקד באוטומציה של זרימת העבודה הידנית של CPILOT, שיכולה להיות עבודה אינטנסיבית לעיבוד יותר מ-12 דגימות באצווה אחת. על מנת להגדיל את התפוקה של גישת CPILOT11, העברתנו את פרוטוקול CPILOT למטפל נוזלי רובוטי כדי לעבד יותר מ-10 דגימות במקביל. האוטומציה גם מאפשרת תגובות דומות עבור כל מדגם במקביל במהלך שלבים שונים של תהליך הכנת המדגם, אשר דרש ממשתמשים מיומנים להשיג במהלך CPILOT ידני. פרוטוקול זה מתמקד בהטמעת התקן הטיפול הנוזלי האוטומטי לביצוע CPILOT. המחקר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול לשימוש במערכת אוטומטית זו ומדגים את ביצועיו באמצעות ניתוח 22-plex "הוכחת הרעיון" של הומוגניאטים כבד העכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

הצגנו זרימת עבודה פרוטאומיקה כמותית בתפוקה גבוהה, בשילוב תיוג איזוטופי מבשר ותיוג isobaric (cPILOT) מסוגל מולטיפלקס של עד 22 או 24 דגימות עם תגי מסה דו-דם או תגיות isobaric N,N-dimethyl לאוצין isobaric, בהתאמה, בניסוי יחיד. מדגם משופר זה multiplexing מפחית באופן משמעותי את זמני רכישת ספקטרומטריה מסה ומגביר את השירות של ריאגנטים isobaric מסחרי יקר. עם זאת, התהליך הידני של טיפול בדגימה וצעדי pipetting באסטרטגיה יכול להיות עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ולהציג אובדן מדגם ושגיאה כמותית. ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות התאגדות של אוטומציה. כאן העבירנו את פרוטוקול CPILOT הידני למכשיר טיפול בנוזלים אוטומטי שיכול להכין מספרי דגימה גדולים (כלומר, 96 דגימות) במקביל. בסך הכל, אוטומציה מגבירה את הכדאיות והרבייה של מדד המחירים לצרכן ומאפשרת שימוש נרחב על ידי חוקרים אחרים עם התקני אוטומציה דומים.

איור 2 מציג נתוני MS מייצגים של פפטיד שזוהו בכל 22 ערוצי היונים של הכתבים מניסוי של 22-plex cPILOT, כולל שכפולים של זרימת עבודה. איור 2 (למעלה) מתאר זוג שיא טעון כפליים המופרד על-ידי מרווח של 4 Da m/z המציין קבוצת דימתיל אחת המשולבת בפפטיד. זוגות השיא הקלים והכבדים היו מבודדים ומפוצלים באופן עצמאי כדי להניב את רצף הפפטיד. הרצף של הפפטיד הוא G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11פלקס) ומתאים לחלבון Betaine-homocysteine S-מתיל transferase. יונים השברים האינטנסיביים ביותר הן לפסגות הקלות והן לפסגות ה-dimethylated הכבדות(לאמוצגות) היו מבודדות עוד יותר לפיצול MS3, ויונים הכתבים(m/z 126-131) מוצגים בדמות 2 (למטה). עוצמת היונים הכתבת פרופורציונלית ישירות לשפע הפפטיד בדגימה. שפע הפפטיד של הדגימות מרמז על יכולת pipetting של הפלטפורמה הרובוטית הוא אחיד למדי על פני 22 דגימות. בסך הכל, ניסוי זה 22-plex cPILOT הביא 1326 (1209-אור/ 1181 כבד) זיהוי חלבונים הנובעים 3098 (6137 אור / 5872 כבד) פפטידים(טבלה 4). איור 3 מציג את עלילת התיבה של שפע log10 לעומת עוצמת יון כתב הכולל על פני כל 22 הערוצים המציגים שונות בין-טובה/בין-מדגם פחותה. הערכת האוטומציה הכוללת נעשתה על ידי בחינת השגיאה בשפע היונים של הכתבים על פני כל חלבון ב-22 הדגימות. איור 4 מראה כי עיבוד לדוגמה עם הפלטפורמה הרובוטית הביא לערכי CV נמוכים מאוד. באופן ספציפי, לאורך 3098 פפטידים זיהו את קורות החיים הממוצעים בשפע יון כתב היה 12.36 % ו 15.03% עבור פפטידים dimethylated קל וכבד, בהתאמה. בין פפטידים אלה 2032 של פפטידים אלה היה אות יון כתב מעל הסף המינימלי ונחשבו לכמת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> איור 1. זרימת עבודה ניסיונית לעיבוד 22 דגימות במקביל לפרוטוקול אוטומטי של cPILOT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> איור 2. כימות פפטידים על פני 22 דגימות. ספקטרה לדוגמה MS(למעלה) ו-MS 3 (למטה) של פפטיד G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11פלקס) מכמתת בניסוי CPILOT אוטומטי של 22-plex עבור דימתילציה קלה (שמאלית למטה) ופסגות דימתילציה כבדות (מימין למטה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> איור 3. עלילת התיבה של עוצמת היונים הכתב הכולל לעומת שפע log10 של 22 דגימות באמצעות מגלה proteome 2.3. קובץ RAW נערך פעמיים פפטידים קלים וכבדים, מזהי חלבונים בנפרד עם TMT כשינוי דינמי, אור (+28.031 Da) וכבד (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation בפפטיד N-termini כשינוי סטטי. חיפוש משולב עם כל השינויים לעיל נוהל באמצעות Proteome Discover 2.3 כדי להשיג את יומן 10 שפע של עוצמות פפטיד בכל הערוצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> איור 4. כינור עלילות של שיתוף יעיל של וריאציה של שפע פפטיד מעוצמות יון כתב מסכם על פני ערוצים 126-131 m/z. הפפטיד היה מכמת עם ערך CV ממוצע של 12.36 ו 15.03 עבור אור (2373) וכבד (2533) פפטידים הניתנים לכימות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
דמות משלימה 1. איור של CPILOT עם פפטיד יחיד. הצגת תיוג isotopic של שתי דגימות שונות תיוג isobaric עם TMT126, התערובת שנוצרה הוזרק MS עבור LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>שם משתנה</td>
			<td>ערך</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>דסלת סאומפ1</td>
			<td>1065</td>
			<td>אמצעי אחסון לשימוש עבור התפלת שלב 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>דסלת זאמפ2</td>
			<td>392</td>
			<td>אמצעי אחסון לשימוש עבור שלב desalt 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>דסלת זאמפ3</td>
			<td>100</td>
			<td>אמצעי אחסון לשימוש עבור התפלת שלב 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד'ומוד</td>
			<td>False</td>
			<td>שקר יחתוך את זמני הדגירה ל-30 שניות...</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>אמצעי אחסון של DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>סנןפלת</td>
			<td>טרגה (טארגה)</td>
			<td>צלחת המשמשת להתפלה</td>
		</tr>
<tr>
<td>סנןפלאטוול</td>
			<td>600</td>
			<td>אמצעי אחסון להתפלה</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטיפת המים</td>
			<td>False</td>
			<td>מספר מים שוטפים על לוח SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>כרך של איודואצטאמיד</td>
		</tr>
<tr>
<td>פפטידTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>נפח פפטיד לתיוג TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>לחץ</td>
			<td>100</td>
			<td>לחץ mbar ב PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ערכת טמפו-אוף</td>
			<td>1</td>
			<td>שינוי בטמפרטורה</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת.מ.ט.וול</td>
			<td>10</td>
			<td>אמצעי אחסון של תג Isobaric להווסף</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריסוול (1100)</td>
			<td>800</td>
			<td>נפח לדילל מדגם לפני העיכול</td>
		</tr>
<tr>
<td>ניסיון ניסיון ווול</td>
			<td>2</td>
			<td>נפח של שלושה נסיפסין</td>
		</tr>
<tr>
<td>שימוש ב-PopTimer</td>
			<td>נכון</td>
			<td>True מציג את האפשרויות להפעיל לחץ על הלוח במידת הצורך</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1 . רשימת המשתנים המשמשים בפרוטוקול CPILOT אוטומטי.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>דילסורס</td>
			<td>דילוול (דילוול)</td>
			<td>דסט (Dest)</td>
			<td>דסטוול (119)</td>
			<td>דילוולום (ת')</td>
			<td>מקור מניות</td>
			<td>סטוקוול</td>
			<td>מדגם וול</td>
			<td>זהה מדגם</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A2 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A3 (3)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A4 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A5 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A6 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A8 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A9 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>A12 (12)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B1 (B1)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B3 (100)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B4 (B4)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B5 (120)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B6 (B6)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B7 (100)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B8 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B9 (100)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B10 (10)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B11 (11)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>דגימות</td>
			<td>B12 (12)</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>שולחן 2 . נפח של כבד עכבר הומוגניאט ו 8 M אוריאה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מקורוול</td>
			<td>מקורוול2</td>
			<td>כתב יון</td>
			<td>ת.ד. 55</td>
			<td>ת.ד. 2</td>
			<td>אמצעי אחסון</td>
			<td>זהה מדגם</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 35</td>
			<td>C1 (1)</td>
			<td>126</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>E1 (E1)</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3 (3)</td>
			<td>C3 (100)</td>
			<td>127N ,ןוהל</td>
			<td>A2 (10)</td>
			<td>E2 (E2)</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5 (10)</td>
			<td>C5 (100)</td>
			<td>127C (127C)</td>
			<td>A3 (3)</td>
			<td>E3 (E3)</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 35</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N ,םינווה</td>
			<td>A4 (10)</td>
			<td>E4 (E4)</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9 (10)</td>
			<td>C9 (100)</td>
			<td>128C (128C)</td>
			<td>A5 (10)</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 35</td>
			<td>C11 (11)</td>
			<td>129N (129N)</td>
			<td>A6 (10)</td>
			<td>E6 (E6)</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2 (2)</td>
			<td>129C (129C)</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>E7 (E7)</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4 (B4)</td>
			<td>D4 (D4)</td>
			<td>130N 130N</td>
			<td>A8 (10)</td>
			<td>E8 (10)</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6 (B6)</td>
			<td>D6 (D6)</td>
			<td>130C - 130C</td>
			<td>A9 (10)</td>
			<td>E9 (10)</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8 (10)</td>
			<td>D8 (100)</td>
			<td>131N ,ןוהל</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>E10 (10)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10 (10)</td>
			<td>D10 (10)</td>
			<td>131C (131C)</td>
			<td>ת"א 35</td>
			<td>E11 (11)</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 3. המספר הכולל של פפטידים, חלבונים וגפרורים ספקטרליים פפטיד (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">1000000000000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>אור</td>
			<td>כבד</td>
		</tr>
<tr>
<td>חלבונים</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>פפטידים</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSMs (PSMs)</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 4. ברקוד התגים המיובאריים עם הדגימות הקלות והכבדות המסומנות בסימון.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

פרוטוקול cPILOT האוטומטי שלנו מקל על החוקרים לנתח דגימות באופן בעל תפוקה גבוהה. זה משמעותי כי זה מאפשר לנו להגיע למידע ביולוגי על מחלות או תנאים שונים הרבה יותר מהר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה עוזר לעבד דגימות מרובות במקביל, ובכך להפחית שגיאות לפעולה תוך שימוש בדגימות תפוקה גבוהה.המעבדה שלנו מעוניינת ביישומים הקשורים להזדקנות ומחלת אלצהיימר. עם זאת, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד כל מחלה או אתגר שבו יש רקמות ביולוגיות מעורבים. התחל בהדלקת מנגנון הלחץ החיובי, מכשיר החימום והקירור ומשאבות הוואקום.חבר את כל האביזרים עם המטפל בנוזלים, אשר יראה אור כחול פעם אחת המחובר למחשב ומוכן לפעולה. Aliquot 300 microliters של הכבד הומוגנית לתוך צינור 500 microliter ולה מניחים אותו על צלחת באר עמוקה שני מיליליטר. אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד לתחילת הפרוטוקול.פתח את השיטה בתוכנה והצב את הטיפים וכלי המעבדה הנדרשים בעמדותיהם. לאחר מכן בצע הצלבה עם פריסת החפיסה הסופית ולחץ על הבא כדי להמשיך בפרוטוקול. לטעון 230 טיפים microliter ושוגם 90 microliters של שמונה אוריאה טוחן מהמאגר.ואז לחלק אותו לחתור אחד שחור שני מיליליטר עמוק צלחת היטב. לפרוק את העצות של TL1 ולחזור על שלב זה עד אוריאה נוספה לכל הבארים. לאחר הוספת חיץ denaturation, להשתמש 90 טיפים microliter להעביר 10 microliters של כבד העכבר הומוגנית לצלחת באר עמוקה.לפרוק את הטיפים, ולאחר מכן לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוגם שלושה microliters של DTT מצלחת reagent אחד. לוותר על DTT לשורות 1 ו -2 של צלחת באר עמוקה. לאטום את צלחת המדגם עם רדיד אלומיניום דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 600 שניות תוך סיבוב ב 300 סל"ד.לאחר הדגירה, לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter, שאף שישה microliters של IAM מצלחת reagent אחד בשורה שלוש, ולחלק אותו בשורה אחת של צלחת המדגם. אטמו את צלחת הדגימה והדגירה אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב במהירות של 300 סל"ד במכשיר הקירור. לאחר מכן בטל את חתימה של לוח הדגימה וטען שורה אחת של 90 טיפים מיקרוליטר.שאפו חמישה מיקרוליטרים של ציסטין מצלחת הריג'נט אחת בשורה השנייה וחלקו אותה לשורות 1 ו-2 של צלחת הדגימה. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, בצע טלטול מתוזמן של 1800 סל"ד במשך 30 דקות.לאחר מכן להוסיף 800 microliters של 20 מילימולר טריס חיץ עם 10 מילימולר סידן כלורי לכל באר על צלחת המדגם כדי לדלל את ריכוז אוריאה לשתי טוחנות. הוסף 20 microliters של טריפסין לשורה הראשונה של צלחת 96 היטב למקם את הצלחת במיקום מסוים על הסיפון. לאחר הוספת טריפסין לצלחת המדגם, לאטום אותו למדוד אותו במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 600 סל"ד על מכשיר חימום וקירור.לעצור את העיכול על ידי שאפת 150 microliters של 5% חומצה פורמית משורה שלוש של צלחת חומצה פורמית ולחלק אותו לצלחת המדגם בשורות אחת ושתיים. המשך להתפלת הפפטידים. השתמש 1070 טיפים microliter לשאוף 600 microliters של אצטוניטריל.לאחר מכן לוותר אותו בשורות אחד ושתיים של מיצוי פאזה מוצק, או צלחת SPE, כדי להפעיל C-18. לאחר מכן, לטעון את המדגם מתעכל לצלחת SPE בשני מעברים. לטעון שתי שורות של טיפים, שאפו 534 מיקרוליטרים של הדגימות המתעכלות, וחלקו אותן לשורות 1 ו-2 של צלחת ה-SPE.יש להפעיל לחץ על הצלחת ולחזור על שלב זה עד שכל הדגימות ייטענו. נקו את הפפטידים על ידי שטיפה במים ודללו את הפפטידים עם 60 עד 40 אצטוניטריל בחומצה פורמית של 0.1%. לאחר מכן מניחים את הצלחת על גבי צלחת אוסף כדי ללטף את הפפטידים באמצעות מנגנון הלחץ החיובי.משוך מטה את הזרימה והגדר את העצות וכלי המעבדה הדרושים בתוכנה, הצלב עם פריסת החפיסה ולחץ על הבא כדי להמשיך את הפרוטוקול לדימתילציה. יש לייפס מחדש את הפפטידים בחומצה אצטית של 1%. כדי לבצע תיוג דימתילציה, לטעון 90 טיפים microliter ושוכם 16 microliters של פורמלדהיד אור 60 מילימולר משורה השנייה של צלחת reagent שני.מחלקים אותו לשורה אחת מצלחת הדגימה, ואז פורקים את העצות. לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוכם 16 microliters של 60 מילימולרים פורמלדהיד כבד משורה שלוש של צלחת reagent 2. לוותר עליו שורה שתיים של צלחת המדגם ולפרוק את הטיפים.לטעון שתי שורות של 90 טיפים microliter ו שאיפה 16 microliters של 24 מילימולר נתרן cyanoborohydride ו 24 מילימולאר נתרן ציאנובורדוטרייד משורות 1 ו -2 של צלחת ריאגנט שלוש, ולאחר מכן לחלק את ריאגנטים לשורות אחד ושניים של צלחת מדגם כדי להתחיל את תגובת דימתילציה. לפרוק את הטיפים ולהשתמש שייקר מסלולית לבצע טלטול מתוזמן במשך 15 דקות ב 1800 סל"ד. לאחר מכן לטעון שתי שורות של 90 טיפים microliter ושוכם 32 microliters של 1% אמוניה משורות שלוש וארבעה של לוח reagent שלוש.מחלקים אותו לשורות 1 ו-2 של צלחת מדגם 2 כדי לעצור את התגובה. שלבו כמויות שוות של פפטידים קלים וכבדים עם דימתילציה בצלחת באר עמוקה חדשה של שני מיליליטר להתפלה. לאחר התפלת הפפטידים הקלים והכבדים המשולבים, ייבשו את הפפטידים ובצעו תיוג isobaric.מחדש את הפפטידים עם 100 מיקרוליטר של חיץ טריאתילמוניום ביקרבונט 100 מילימולארי על שייקר מסלולי. לאחר מכן השתמש 90 טיפים microliter כדי לשאוף 25 microliters של פפטידים dimethylated בשילוב ולחלק אותם לשורה הראשונה של צלחת עיבוד TMT. לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוגם 10 microliters של TMT.לוותר עליו בשורה הראשונה של לוח העיבוד TMT, לפרוק את העצות, ולאחר מכן לבצע טלטול מתוזמן במשך שעה אחת ב 1800 סל"ד. שאפו שמונה מיקרוליטרים של הידרוקסילאמין משורה 2 של צלחת TEAB וחלוקתו לשורה אחת של צלחת העיבוד TMT. לאחר 15 דקות של טלטול ב-1800 סל"ד, העבר 30.5 מיקרוליטר של הפפטידים המסומנים ב-TMT לצינור של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן המשיכו ברכישת נתונים וניתוחם בהתאם לכיווני כתב היד. נתוני MS מייצגים של פפטיד שזוהו בכל 22 ערוצי היונים הכתבים מ- 22 Plex משולבים תיוג isotopic וניסוי תיוג isobaric מוצג כאן. רצף הפפטיד מתאים לבטאין-הומוציסטאין S-מתילטרנספראז.היונים האינטנסיביים ביותר עבור פסגות דימתילציה קלות וכבדות היו מבודדים עוד יותר עבור פיצול MS3. התעצמות היונים של הכתב פרופורציונלית ישירות לשפע הפפטידים בדגימה. בסך הכל, ניסוי משולב זה של תיוג איסוטופי ותיוג isobaric הפחית את זמני העיבוד של הדגימה ואי אפשר לדמיין את ביטוי החלבון בערוצים או בתנאים מרובים.עלילת התיבה של שפע יומן 10 לעומת התעצמות יון הכתב הכולל על פני כל 22 הערוצים מראה שונות בין טוב פחות או בין מדגם. הערכת האוטומציה הכוללת נעשתה על ידי בחינת השגיאה בשפע היונים הכתבים בכל חלבון ב-22 הדגימות. עיבוד מדגם עם הפלטפורמה הרובוטית הביא מקדמים נמוכים מאוד של וריאציה.על פני 3098 פפטידים, המקדם הממוצע של וריאציה בשפע יונים הכתב היה 12.36 ו 15.03% עבור פפטידים דימתילציה קלה וכבדה בהתאמה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי רמות isotopic ו isobaric משמשים בניסוי אחד. לפיכך, תכנון זהיר צריך להתבצע כדי לייעד כל מדגם עם התגים שנועדו לשמש בניסוי.שיטה זו יכולה להיות משולבת בקלות במערכות רובוטיות אחרות, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רקמות, כגון רקמות או לייסטים תא וביופלואידים אחרים.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

מדידות דיוק אבץ איזוטופי גבוהות יישומים לאיברי עכבר

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

אפיון, כימות מתחם ספציפי ניתוח איזוטופי של Pyrogenic פחמן שימוש בנזן Polycarboxylic חומצות (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

ההפרדה Sr אוטומטי 90ו- Preconcentration במערכת המעבדה-על-שסתום ברמה Ppq

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine מטאפיתזה על ידי הזרזים התומכים בסיליקה באמצעות מתודולוגיה של כימיה אורגנומתכתית של פני השטח

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

אפקט איזונושא בתהליך העברת פרוטונים כפול של פורקן נחקר על-ידי שיטת QM/MM משופרת

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

הכנה לדוגמא במיקרומאזן קריסטל קוורץ מדידות של חלבון ומכניקה פולימר

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...