Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Gli autori riconoscono vanderbilt University Start-up Funds e NIH award (R01GM117191) a RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

cPILOT è una strategia di multiplexing avanzata in grado di analizzare fino a 24 campioni in un singolo esperimento. La capacità di multiplexing dipende dal numero di combinazioni di tagging isotopico e isobarico disponibili. L'introduzione del TMTpro7, in grado di contrassegnare 16 campioni in un singolo esperimento, può spingere i limiti di cPILOT a 32-plex. cPILOT è costituito da più passaggi di pipettazione e richiede un'ampia cura e abilità dell'utente per eseguire la preparazione del campione. Anche con un utente esperto, gli errori manuali sono inevitabili, il che invita l'uso di piattaforme robotiche per elaborare campioni nella strategia cPILOT. Poiché cPILOT utilizza l'etichettatura dipendente dal pH dei peptidi, il pH deve essere mantenuto per la luce e il pesante set di campioni dimetilati. Il pH leggermente acido-basico può provocare la dimetilazione dei residui di N-termini e lisina. Un vantaggio di cPILOT è che richiede solo la metà dei tag isobarici poiché il peptide N-termini è occupato con i gruppi dimetil. Ciò offre un maggior numero di campioni da etichettare a metà del costo. La gestione di numeri di campione più grandi richiede che i tempi di esposizione dei reagenti siano simili per il primo e l'ultimo campione di un lotto. Un distributore di pipette in grado di ospitare fino a 32 campioni in parallelo può essere raggiunto al meglio con l'uso di dispositivi robotici di movimentazione dei liquidi.
Per elaborare più campioni tramite cPILOT, il flusso di lavoro manuale è stato modificato per incorporare l'automazione. Il gestore liquido robotico utilizzato in questo studio ha due pod con capacità di pipettazione a 96 canali e a 8 canali, con una pinza per posizionare le piastre nelle 28 posizioni del ponte disponibili. Il gestore del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva, uno shaker orbitale e un dispositivo per riscaldare / raffreddare i campioni nella piastra del pozzo 96. L'apparato a pressione positiva aiuta a eseguire scambi tampone nelle piastre SPE durante la pulizia, mentre lo shaker orbitale aiuta a vortice / mescolare i campioni. La piattaforma robotica è stata programmata per aspirare e erogare buffer e campioni a piastre da 96 pozzi, incubare, campioni di vortice e piastre di trasferimento. I liquidi con viscosità diverse, come acetonitrile e acqua, richiedono specifiche considerazioni di pipettazione che possono anche essere programmate nel metodo.
Il flusso di lavoro cPILOT, a partire dalla quantificazione proteica da parte di BCA all'etichettatura dei peptidi con tag isobarici (cioè TMT), è stato eseguito sul sistema di gestione dei liquidi. Il protocollo completo è stato scalato per utilizzare 96 piastre di pozzo profondo che possono contenere 2 mL per pozzo. I tamponi sono stati preparati prima dell'inizio dell'esperimento e aggiunti alla piastra del pozzo 96 in modo da consentire l'elaborazione parallela del campione. Nel presente studio, 22 repliche del flusso di lavoro dell'omogeneato epatico del topo sono state aggiunte alle piastre del pozzo profondo e prese attraverso il protocollo cPILOT. Infine, un singolo campione costituito dai peptidi taggati al fegato di topo equimolare da 22 plex è stato iniettato allo spettrometro di massa. Le intensità degli ioni reporter corrispondenti all'abbondanza di peptidi nei campioni hanno dimostrato che i campioni elaborati con il gestore del liquido hanno CV inferiori rispetto al protocollo manuale(dati non mostrati). La piattaforma robotica ha anche notevolmente migliorato la riproducibilità dell'elaborazione del campione. Riproducibilità e robustezza sono fattori molto importanti durante l'elaborazione di un gran numero di campioni. Gli errori di pipetting possono portare a una completa interpretazione errata dei dati e qui la piattaforma robotica ha fornito una bassa variazione tra campioni. Anche l'utilizzo della piattaforma robotica per cPILOT ha ridotto il tempo necessario per preparare i campioni. Ad esempio, dopo aver sviluppato il metodo automatizzato, è stato necessario 2,5 ore per elaborare 22 campioni rispetto a 7,5 ore per il cPILOT manuale. Sono in corso esperimenti nel nostro laboratorio per valutare ulteriormente i confronti dei flussi di lavoro cPILOT manuali e automatizzati. Sulla base di precedenti rapporti del nostro laboratorio, i CV%s di intensità ioniche di reporter proteico nel cPILOT manuale erano in media del 20% con alcuni outlier che superavano questo valore12.
cPILOT è una strategia di derivatizzazione chimica a livello peptidico, che può essere utilizzata per qualsiasi tipo di campione come cellule, tessuti e fluidi corporei. cPILOT offre un multiplexing dei campioni migliorato e con l'incorporazione dell'automazione può facilitare il multiplexing del campione ad alta produttività nella proteomica. Questa produttività è necessaria per far progredire ulteriormente la malattia e la comprensione biologica e la scoperta del biomarcatore.

La proteomica basata sulla spettrometria di massa (SM) è uno strumento di ricerca indispensabile per identificare biomarcatori specifici della malattia, comprendere la progressione della malattia e creare lead per lo sviluppo terapeutico. Questo può essere ottenuto da una serie di campioni clinici correlati alla malattia come siero del sangue / plasma, fluidi prossimali e tessuti1,2. La scoperta e la convalida del biomarcatore proteomica hanno recentemente guadagnato una considerazione significativa a causa della potenza delle strategie di multiplexing delcampione 3,4. Il multiplexing del campione è una tecnica che consente il confronto simultaneo e la quantificazione di due o più condizioni del campione all'interno di una singola iniezione MS5,6. Il multiplexing del campione si ottiene codificando peptidi o proteine da più campioni con tag chimici, enzimatici o metabolici e ottenendo informazioni sulla SM da tutti i campioni in un singolo esperimento MS o MS / MS. Tra i tag isobarici disponibili ci sono reagenti di tagging isobarico (iTRAQ), tag di massa tandem commerciali (TMT) e reagenti isobarici sintetizzati internamente N,N-dimetil leucina (DiLeu) con capacità fino a 16-plex7 e 21-plex8, rispettivamente.
L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) sono una tecnologia avanzata di multiplexing del campione. cPILOT combina l'etichettatura isotopica del peptide N-termini con isotopi leggeri [−(CH3)2] e pesanti [−(13C2H3)2] a basso pH (∼2.5), che mantiene disponibile il residuo di lisina per la successiva etichettatura isobarica ad alto pH (8,5) utilizzando TMT, DiLeu, o tag iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. Lo schema di doppia etichettatura della strategia cPILOT è descritto nella Figura 1 supplementare con due campioni che utilizzano un peptide di esempio. L'accuratezza e la precisione della quantificazione basata su TMT a livello ms2 possono essere compromesse a causa della presenza di ioni co-isolati e co-frammentati contaminanti definiti come effetto di interferenza15. Questa limitazione nei rapporti di ioni reporter imprecisi può essere superata con l'aiuto di spettrometri di massa Orbitrap tribridi. Ad esempio, l'effetto di interferenza può essere superato isolando un picco in una coppia dimetilata al livello MS1 nello spettrometro di massa, sottosottenendo il picco leggero o pesante alla frammentazione MS2 nella trappola ionica lineare e quindi sottosottenendo il frammento MS2 più intenso per HCD-MS3 per ottenere informazioni quantitative. Al fine di aumentare le possibilità di selezionare i peptidi senza ammine di lisina disponibili per generare ioni reporter, è possibile utilizzare anche un'acquisizione selettiva di MS3 basata sul frammento y-1 ed è un approccio che può comportare una maggiore percentuale di peptidi quantificabili con cPILOT9. La combinazione di etichettatura leggera e pesante aumenta le capacità di multiplexing del campione di un fattore 2 volte superiore a quello ottenuto con i singoli tag isobarici. Recentemente abbiamo utilizzato cPILOT per combinare fino a 24 campioni in un unico esperimento con reagenti DiLeu16. Inoltre cPILOT è stato utilizzato per studiare le modifiche ossidativi post-traslatori14 tra cui nitrazione proteica17, altri proteomi globali9, e ha dimostrato applicazioni su più campioni di tessuto in un topo del morbo di Alzheimermodello 11.
La robusta preparazione del campione è un passaggio critico in un esperimento cPILOT e può richiedere molto tempo, laboriosa ed estesa. Il multiplexing del campione migliorato richiede un'ampia pipettazione e personale di laboratorio altamente qualificato, e ci sono diversi fattori che possono influenzare pesantemente la riproducibilità dell'esperimento. Ad esempio, è necessaria un'attenta manipolazione dei campioni per garantire tempi di reazione simili per tutti i campioni e per mantenere un pH tampone appropriato per campioni dimetilati leggeri e pesanti. Inoltre, la preparazione manuale da decine a centinaia di campioni può introdurre un elevato errore sperimentale. Pertanto, per ridurre la variabilità della preparazione del campione, migliorare l'accuratezza quantitativa e aumentare la produttività sperimentale, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro cPILOT automatizzato. L'automazione si ottiene utilizzando un dispositivo robotico di movimentazione dei liquidi in grado di completare molti aspetti del flusso di lavoro (Figura 1). La preparazione del campione dalla quantificazione delle proteine all'etichettatura peptidica è stata eseguita su un gestore liquido automatizzato. Il gestore automatico del liquido è integrato con un apparato a pressione positiva (PPA) per lo scambio tampone tra le piastre di estrazione in fase solida (SPE), lo shaker orbitale e un dispositivo di riscaldamento / raffreddamento. La piattaforma robotica contiene 28 posizioni di coperta per ospitare piastre e buffer. Ci sono due baccelli con pinza per trasferire le piastre all'interno delle posizioni del ponte: una testa di pipettazione a volume fisso a 96 canali (5-1100 μL) e sonde a volume variabile a 8 canali (1-1000 μL). La piattaforma robotica è controllata utilizzando un software. L'utente deve essere addestrato professionalmente prima di utilizzare il gestore liquido robotico. Il presente studio si concentra sull'automazione del flusso di lavoro cPILOT manuale, che può essere laborioso per l'elaborazione di più di 12 campioni in un singolo batch. Al fine di aumentare la velocità effettiva dell'approccio cPILOT11, abbiamo trasferito il protocollo cPILOT a un gestore di liquidi robotici per elaborare più di 10 campioni in parallelo. L'automazione consente anche reazioni simili per ogni campione in parallelo durante varie fasi del processo di preparazione del campione, che ha richiesto agli utenti altamente qualificati di ottenere durante il cPILOT manuale. Questo protocollo si concentra sull'implementazione del dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi per eseguire cPILOT. Il presente studio descrive il protocollo per l'utilizzo di questo sistema automatizzato e ne dimostra le prestazioni utilizzando un'analisi "proof-of-concept" a 22 plex degli omogeneati epatici del topo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Abbiamo introdotto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ad alta produttività, etichettatura isotopica precursore combinata e tagging isobarico (cPILOT) in grado di multiplexare fino a 22 o 24 campioni con tag di massa tandem o tag isobarici N,N-dimetil leucine isobarici, rispettivamente, in un singolo esperimento. Questo multiplexing del campione migliorato riduce notevolmente i tempi di acquisizione della spettrometria di massa e aumenta l'utilità dei costosi reagenti isobarici commerciali. Tuttavia, il processo manuale di gestione dei campioni e le fasi di pipettazione nella strategia possono richiedere molto lavoro, richiedere molto tempo e introdurre la perdita di campioni e l'errore quantitativo. Queste limitazioni possono essere superate attraverso l'incorporazione dell'automazione. Qui abbiamo trasferito il protocollo cPILOT manuale a un dispositivo di movimentazione automatica dei liquidi in grado di preparare grandi numeri di campione (cioè 96 campioni) in parallelo. Nel complesso, l'automazione aumenta la fattibilità e la riproducibilità di cPILOT e consente un ampio utilizzo da parte di altri ricercatori con dispositivi di automazione comparabili.

La figura 2 mostra i dati MS rappresentativi di un peptide identificato in tutti i 22 canali di ioni reporter da un esperimento cPILOT a 22 plex, incluse le repliche del flusso di lavoro. La figura 2 (in alto) raffigura una coppia di picchi doppiamente carica separata da una spaziatura da 4 Da m/z che indica un singolo gruppo dimetile incorporato nel peptide. Le coppie di picco dimetilate leggere e pesanti erano isolate e frammentate indipendentemente per produrre la sequenza del peptide. La sequenza del peptide è G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) e corrisponde alla proteina Betaina-omocisteina S-metiltransferasi. Gli ioni di frammento più intensi per i picchi dimetilati leggeri e pesanti(non mostrati ) sono stati ulteriormente isolati per la frammentazione ms3 e gli ioni reporter(m/z 126-131) sono mostrati nella figura 2 (in basso). Le intensità degli ioni reporter sono direttamente proporzionate all'abbondanza peptidica nel campione. L'abbondanza peptidica dei campioni implica che la capacità di pipettazione della piattaforma robotica è abbastanza uniforme tra i 22 campioni. Nel complesso, questo esperimento cPILOT a 22 plex ha portato a 1326 (1209-luce/1181-pesanti) identificazioni di proteine risultanti da peptidi 3098 (6137-leggeri/5872-pesanti)(tabella 4). La figura 3 mostra il box plot tra l'abbondanza di log10 e le intensità totali degli ioni reporter su tutti i 22 canali che mostrano una minore variabilità inter-bene/intercampione. La valutazione dell'automazione totale è stata effettuata esaminando l'errore nell'abbondanza di ioni reporter in ciascuna proteina nei 22 campioni. La figura 4 mostra che l'elaborazione del campione con la piattaforma robotica ha portato a valori CV molto bassi. In particolare, nei 3098 peptidi identificati, il CV medio nell'abbondanza di ioni reporter era rispettivamente del 12,36 % e del 15,03 % per i peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Tra questi peptidi il 2032 di questi peptidi aveva un segnale di ioni reporter al di sopra della soglia minima e sono stati ritenuti quantificabili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale per elaborare 22 campioni in parallelo con un protocollo cPILOT automatizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Figura 2. Quantificazione dei peptidi su 22 campioni. Esempio di spettri MS (in alto) e MS3 (in basso) del peptide G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) quantificati in esperimenti cPILOT automatizzati a 22 plex per picchi leggeri dimetilati (in basso a sinistra) e pesanti dimetilati (in basso a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Figura 3. Box plot delle intensità totali degli ioni reporter rispetto all'abbondanza log10 di 22 campioni utilizzando lo scopritore di proteoma 2.3. Il file RAW è stato cercato due volte per peptidi leggeri e pesanti, ID proteine separatamente con TMT come modifica dinamica, dimetilazione leggera (+28.031 Da) e pesante (+36.076 e +35.069 Da) dimetilazione al peptide N-termini come modifica statica. Una ricerca combinata con tutte le modifiche di cui sopra è stata eseguita utilizzando Proteome Discover 2.3 per ottenere l'abbondanza log 10 di intensità peptidiche su tutti i canali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Figura 4. Trame per violino di co-efficiente della variazione dell'abbondanza peptidica dalle intensità di ioni reporter sommate attraverso i canali 126-131 m / z. Il peptide è stato quantificato con un valore medio CV di 12,36 e 15,03 per peptidi quantificabili leggeri (2373) e pesanti (2533). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1. Illustrazione del cPILOT con un singolo peptide. Mostrando l'etichettatura isotopica di due diversi campioni e l'etichettatura isobarica con TMT126, la miscela risultante è stata iniettata a MS per LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nome variabile</td>
			<td>Valore</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volume da utilizzare per la desalt fase 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volume da utilizzare per la desalt fase 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volume da utilizzare per la desalt fase 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>False</td>
			<td>False taglierà i tempi di incubazione a 30sec- True seguirà i tempi di incubazione nel protocollo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Volume di DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piastra filtro</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Piastra utilizzata per la dissalezione</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volume per la desalinizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>False</td>
			<td>Numero di lavaggi d'acqua sulla piastra SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume di iodoacetamide</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Volume di peptide per l'etichettatura TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pressione</td>
			<td>100</td>
			<td>pressione mbar a PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Variazione della temperatura</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Volume di tag isobarici da aggiungere</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volume per diluire il campione prima della digestione</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume di tripside</td>
		</tr>
<tr>
<td>UsePopTimer</td>
			<td>Vero</td>
			<td>True visualizza le opzioni per applicare la pressione sulla piastra, se necessario</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 1. Elenco di variabili utilizzate nel protocollo cPILOT automatizzato.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilSource</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>Origine stock</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>Ruota campione</td>
			<td>ID campione</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A10 A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B3 b) La commissione per i</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B4 b) La commissione per i</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B5 B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B6 b) La commissione per i</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B7 b) La commissione per i</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B8 B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B9 B9 b) la commissione</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B10 B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B11 B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Campioni</td>
			<td>B12 B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>La tabella 2. Volume di omogenato di fegato di topo e urea da 8 M.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>SourceWell</td>
			<td>SourceWell2</td>
			<td>Reporter Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volume</td>
			<td>ID campione</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7 A</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4 b) La commissione per i</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6 b) La commissione per i</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8 B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10 A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10 B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 3. Numero totale di peptidi, proteine e partite spettrali peptidiche (PS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">CPILOT automatizzato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Leggero</td>
			<td>Pesante</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteine</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptidi</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>Psm</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 4. Barcodifica delle etichette isobariche con i campioni etichettati leggeri e pesanti.

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Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L'incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l'accuratezza quantitativa.

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Il nostro protocollo cPILOT automatizzato rende più facile per i ricercatori analizzare i campioni in modo ad alta produttività. Questo è significativo perché ci consente di ottenere informazioni biologiche su malattie o condizioni diverse molto più velocemente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a elaborare più campioni in parallelo, riducendo così gli errori utilizzabili durante l'utilizzo di campioni ad alta velocità effettiva.Il nostro laboratorio è interessato ad applicazioni legate all'invecchiamento e al morbo di Alzheimer. Tuttavia, questa tecnica può anche essere utilizzata per studiare qualsiasi malattia o sfida per dove ci sono tessuti biologici coinvolti. Iniziare accendendo l'apparato a pressione positiva, il dispositivo di riscaldamento e raffreddamento e le pompe per vuoto.Collega tutti gli accessori con il gestore del liquido, che mostrerà una luce blu una volta collegato al computer e pronto per l'esercizio. Aliquot 300 microlitri del fegato omogeneizzano in un tubo da 500 microlitri e lo posizionano su una piastra profonda di due millilitri. Archiviare l'esempio a quattro gradi Celsius fino all'inizio del protocollo.Aprire il metodo nel software e posizionare i suggerimenti e i labware richiesti nelle loro posizioni. Quindi eseguire il controllo incrociato con il layout del mazzo finale e fare clic su Avanti per continuare il protocollo. Caricare 230 punte di microlitri e aspirare 90 microlitri di otto urea molare dal serbatoio.Quindi erogarlo per remare uno dei due millilitri neri piastra profonda bene. Scaricare le punte di TL1 e ripetere questo passaggio fino a quando l'urea non è stata aggiunta a tutti i pozzi. Dopo aver aggiunto il tampone di denaturazione, utilizzare 90 punte di microlitri per trasferire 10 microlitri di omogenato di fegato di topo nella piastra del pozzo profondo.Scaricare le punte, quindi caricare una fila di 90 punte di microlitri e aspirare tre microlitri di DTT dalla piastra di reagente uno. Distribuire DTT alle file uno e due della piastra del pozzo profondo. Sigillare la piastra campione con un foglio di alluminio e incubarla a 37 gradi Celsius per 600 secondi mentre si ruota a 300 giri/min.Dopo l'incubazione, caricare una fila di 90 punte di microlitri, aspirare sei microlitri di IAM dalla piastra del reagente una alla terza riga e erogarla per remare una delle piastre campione. Sigillare la piastra campione e incubarla a quattro gradi Celsius per 30 minuti mentre si ruota a 300 giri/min sul dispositivo di raffreddamento. Quindi smacchiare la piastra del campione e caricare una fila di 90 punte di microliter.Aspirare cinque microlitri di cistina dalla piastra del reagente uno alla riga due e disrogarlo alle file uno e due della piastra del campione. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, eseguire una scossa a tempo di 1800 giri/min per 30 minuti.Quindi aggiungere 800 microlitri di tampone Tris millimolare da 20 millimolare con cloruro di calcio millimolare ad ogni pozzo sulla piastra del campione per diluire la concentrazione di urea in due molari. Aggiungere 20 microlitri di triptina alla prima fila di una piastra da 96 pozzi e posizionare la piastra in una posizione specificata sul ponte. Dopo aver aggiunto la tripsina alla piastra del campione, sigillarla e incubarla per 15 ore a 37 gradi Celsius e 600 RPM sul dispositivo di riscaldamento e raffreddamento.Interrompere la digestione aspirando 150 microlitri di acido formico al 5% dalla terza riga della piastra dell'acido formico e erogandola alla piastra del campione alle file uno e due. Procedere a desalt i peptidi. Utilizzare 1070 punte di microlitri per aspirare 600 microlitridi di acetonitrile.Quindi erogarlo in file uno e due dell'estrazione in fase solida, o piastra SPE, per attivare il C-18. Quindi, caricare il campione digerito sulla piastra SPE in due passaggi. Caricare due file di punte, aspirare 534 microlitri dei campioni digeriti e disrogarli alle file uno e due della piastra SPE.Applicare la pressione sulla piastra e ripetere questo passaggio fino a quando tutti i campioni non vengono caricati. Pulire i peptidi lavandosi con acqua e diluire i peptidi con 60-40 acetonitrile nello 0,1% di acido formico. Quindi posizionare la piastra sopra una piastra di raccolta per elutare i peptidi usando l'apparato a pressione positiva.Disegnare il flow-through e impostare i suggerimenti e i labware richiesti nel software, fare un controllo incrociato con il layout del deck e fare clic su Avanti per continuare il protocollo per la dimetilazione. Ricostituire i peptidi in acido acetico all'1%. Per eseguire l'etichettatura di dimetilazione, caricare 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di formaldeide leggera da 60 millimolare dalla seconda fila di piastra reagente due.Erogarlo per remare una delle piastre campione, quindi scaricare le punte. Caricare una fila di 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di formaldeide pesante 60 millimolare dalla terza fila della piastra di reagente due. Erogarlo riga due della piastra campione e scaricare le punte.Caricare due file di 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di cianoboroidro di sodio millimolare e 24 millimolare cianoborodeuteride di sodio dalle file uno e due della piastra reagente tre, quindi erogare i reagenti alle file uno e due della piastra del campione per iniziare la reazione di dimetilazione. Scaricare le punte e utilizzare lo shaker orbitale per eseguire una scossa a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min. Quindi caricare due file di 90 punte di microlitri e aspirare 32 microlitri di 1% di ammoniaca dalle file tre e quattro della piastra di reagente tre.Erogarlo in file uno e due di piastra campione due per fermare la reazione. Combina volumi uguali di peptidi dimetilati leggeri e pesanti in una nuova piastra profonda di due millilitri per la dissalazione. Dopo aver dissaleto i peptidi leggeri e pesanti combinati, asciugare i peptidi ed eseguire l'etichettatura isobarica.Ricostituire i peptidi con 100 microlitri di tampone di bicarbonato di trietilonio millimolare su uno shaker orbitale. Quindi utilizzare 90 punte di microlitri per aspirare 25 microlitri dei peptidi dimetilati combinati e erogarli alla prima fila della piastra di lavorazione TMT. Caricare una riga di 90 punte di microlitri e aspirare 10 microlitri di TMT.Erogarlo nella prima riga della piastra di lavorazione TMT, scaricare le punte, quindi eseguire un frullato a tempo per un'ora a 1800 giri/min. Aspirare otto microlitri di idrossilammina dalla seconda fila della piastra TEAB e erogarla per remare una delle piastre di lavorazione TMT. Dopo una scossa di 15 minuti a 1800 giri/min, trasferire 30,5 microlitri dei peptidi etichettati TMT in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi procedere con l'acquisizione e l'analisi dei dati secondo le indicazioni manoscritte. I dati rappresentativi della SM di un peptide identificato in tutti i 22 canali ionici reporter da un esperimento di etichettatura isotopica del precursore combinato 22 Plex e di tagging isobarico sono mostrati qui. La sequenza del peptide corrisponde alla betaina-omocisteina S-metiltransferasi.Gli ioni di frammento più intensi sia per i picchi dimetilati leggeri che per i picchi dimetilati pesanti sono stati ulteriormente isolati per la frammentazione MS3. Le intensità degli ioni reporter sono direttamente proporzionate all'abbondanza peptidica nel campione. Nel complesso, questo esperimento combinato di etichettatura isotopica precursore e tagging isobarico ha ridotto i tempi di elaborazione del campione e ha permesso di visualizzare l'espressione proteica su più canali o condizioni.Il box plot dell'abbondanza del log 10 rispetto alle intensità totali degli ioni reporter su tutti i 22 canali mostra una minore variabilità tra i pozzi o tra campioni. La valutazione dell'automazione totale è stata effettuata esaminando l'errore nell'abbondanza di ioni reporter in ciascuna proteina nei 22 campioni. L'elaborazione del campione con la piattaforma robotica ha comportato coefficienti di variazione molto bassi.Nei 3098 peptidi, il coefficiente medio di variazione nell'abbondanza di ioni reporter era rispettivamente del 12,36% e del 15,03% per i peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Quando si tenta questo protocollo, è importante tenere presente che i livelli isotopico e isobarico vengono utilizzati in un singolo esperimento. Pertanto, è necessario eseguire un'attenta pianificazione per designare ogni campione con i tag destinati ad essere utilizzati nell'esperimento.Questo metodo può essere facilmente integrato in altri sistemi robotici e può essere applicato a una varietà di tessuti, come tessuti o lysati cellulari e altri biofluidi.

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