Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Os autores reconhecem os Fundos de Start-up da Universidade Vanderbilt e o prêmio NIH (R01GM117191) ao RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

cPILOT é uma estratégia de multiplexação aprimorada que pode analisar até 24 amostras em um único experimento. A capacidade de multiplexing depende do número de combinações isotópicas e isobáricas disponíveis. A introdução do TMTpro7, que é capaz de marcar 16 amostras em um único experimento, pode empurrar os limites do cPILOT para 32-plex. cPILOT consiste em múltiplas etapas de pipetação e requer cuidados extensivos e habilidades do usuário para realizar a preparação da amostra. Mesmo com um usuário especialista, erros manuais são inevitáveis, o que convida o uso de plataformas robóticas para processar amostras na estratégia cPILOT. Uma vez que o cPILOT utiliza a marcação dependente de pH dos peptídeos, o pH precisa ser mantido para a luz e o conjunto de amostras estilizadas pesadas. PH levemente ácido-básico pode resultar em dimetilação tanto de resíduos de N-termini quanto de lisina. Uma vantagem do cPILOT é que ele requer apenas metade das tags isobáricas, uma vez que peptídeo N-termini são ocupados com os grupos de dimetila. Isso permite que um número maior de amostras seja rotulada pela metade do custo. O manuseio de números amostrais maiores requer que os tempos de exposição ao reagente sejam semelhantes para a primeira e a última amostra em um lote. Um distribuidor de pipetas que pode acomodar até 32 amostras em paralelo pode ser melhor alcançado com o uso de dispositivos robóticos de manuseio líquido.
Para processar várias amostras por cPILOT, o fluxo de trabalho manual foi alterado para incorporar a automação. O manipulador líquido robótico usado neste estudo possui dois pods com habilidades de pipetação de 96 canais e 8 canais, com uma pinça para colocar as placas nos 28 locais disponíveis. O manipulador líquido é integrado com um aparelho de pressão positivo, shaker orbital e um dispositivo para aquecer/resfriar amostras na placa de 96 poços. O aparelho de pressão positiva auxilia na realização de trocas tampão nas placas de SPE durante a limpeza, enquanto o agitador orbital ajuda a vórtice/misturar as amostras. A plataforma robótica foi programada para aspirar e distribuir tampões e amostras para placas de 96 poços, incubar, amostras de vórtice e placas de transferência. Líquidos com diferentes viscosidades, como acetonitrilo e água, requerem considerações específicas de pipetização que também podem ser programadas no método.
O fluxo de trabalho cPILOT, desde a quantificação proteica pelo BCA até a rotulagem dos peptídeos com tags isobáricas (ou seja, TMT), foi realizado no sistema de manipuladores líquidos. O protocolo completo foi dimensionado para usar 96 placas de poços profundos que podem conter 2 mL por poço. Os buffers foram preparados antes do início do experimento e adicionados à placa do poço 96, de modo a permitir o processamento paralelo da amostra. No presente estudo, 22 réplicas do fluxo de trabalho do homogeneato do fígado do camundongo foram adicionadas às placas profundas do poço e levadas através do protocolo cPILOT. Finalmente, uma única amostra constituída pelo fígado de rato equimolar de 22 plex foi injetada no espectrômetro de massa. Intensidades de íons repórteres correspondentes à abundância de peptídeos nas amostras demonstraram que as amostras processadas com o manipulador líquido têm CVs menores do que o protocolo manual(dados não mostrados). A plataforma robótica também melhorou muito a reprodutibilidade do processamento de amostras. A reprodutibilidade e robustez são fatores muito importantes ao processar um grande número de amostras. Erros de pipetação podem levar à interpretação errada completa dos dados e aqui a plataforma robótica forneceu baixa variação entre amostras. Também o uso da plataforma robótica para cPILOT reduziu o tempo necessário para preparar amostras. Por exemplo, depois de desenvolver o método automatizado, foi necessário 2,5 h para processar 22 amostras em comparação com 7,5 h para cPILOT manual. Experimentos estão em andamento em nosso laboratório para avaliar ainda mais as comparações dos fluxos de trabalho cPILOT manuais e automatizados. Com base em relatórios anteriores do nosso laboratório, os CV%'s de intensidades de íons de repórter de proteína no cPILOT manual foram, em média, 20% com alguns outliers excedendo esse valor12.
cPILOT é uma estratégia de derivação química no nível do peptídeo, que pode ser usada para qualquer tipo de amostra, como células, tecidos e fluidos corporais. o cPILOT oferece multiplexing de amostra aprimorado e com a incorporação da automação pode facilitar o multiplexing de amostra de alto rendimento em proteômica. Esse rendimento é necessário para avançar ainda mais a compreensão biológica e a descoberta de biomarcadores.

A espectrometria de massa (mS) é uma ferramenta de pesquisa indispensável na identificação de biomarcadores específicos da doença, na compreensão da progressão da doença e na criação de leads para o desenvolvimento terapêutico. Isso pode ser obtido a partir de uma série de amostras clínicas relacionadas à doença, como soro/plasma sanguíneo, fluidos proximais e tecidos1,2. A descoberta e validação de biomarcadores de proteômica ganharam recentemente significativa consideração devido ao poder das estratégias de multiplexação da amostra3,4. Multiplexação amostral é uma técnica que permite a comparação simultânea e quantificação de duas ou mais condições amostrais dentro de uma única injeção de MS5,6. O multiplexing amostral é obtido através de peptídeos de barcodificação ou proteínas de múltiplas amostras com marcas químicas, enzimáticas ou metabólicas e obtenção de informações de MS de todas as amostras em um único experimento em MS ou MS/MS. Entre as etiquetas isobáricas disponíveis estão reagentes isobáicos de marcação (iTRAQ), tags de massa tandem comercial (TMT) e em casa sintetizados reagentes isobáricos N,N-dimethyl leucina (DiLeu) com capacidades de até 16-plex7 e 21-plex8, respectivamente.
A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma tecnologia de multiplexação de amostra aprimorada. cPILOT combina rotulagem isotópica de peptídeo N-termini com leve [-(CH3)2] e pesado [−(13C2H3)2] isótopos em pH baixo (∼2,5), que mantém o resíduo de liseina disponível para rotulagem isobárica de pH (8,5) DiLeu, ou iTRAQ marcando3,9,10,11,12,13,14. O esquema de rotulagem dupla da estratégia cPILOT é retratado na Figura Suplementar 1 com duas amostras usando um peptídeo de exemplo. A precisão e precisão da quantificação baseada em TMT no nível MS2 pode ser comprometida devido à presença de íons co-isolados e co-fragmentados considerados como efeito de interferência15. Essa limitação em proporções de íons de repórter imprecisas pode ser superada com a ajuda de espectrômetros de massa tribrid Orbitrap. Por exemplo, o efeito de interferência pode ser superado isolando um pico em um par dimetilado no nível MS1 no espectrômetro de massa, submetendo o pico leve ou pesado à fragmentação de MS2 na armadilha de íons lineares e, em seguida, submetendo o fragmento mais intenso de MS2 para HCD-MS3 para obter informações quantitativas. A fim de aumentar as chances de seleção dos peptídeos sem aminas de liseina disponíveis para geração de íons repórteres, uma aquisição seletiva de MS3 com base no fragmento y-1 também pode ser usada e é uma abordagem que pode resultar em uma maior porcentagem de peptídeos quantificáveis com cPILOT9. A combinação de rotulagem leve e pesada aumenta as capacidades de multiplexação da amostra em um fator de 2x ao alcançado com tags isobáricas individuais. Recentemente, usamos o cPILOT para combinar até 24 amostras em um único experimento com reagentes DiLeu16. Além disso, o cPILOT tem sido usado para estudar modificações oxidativas pós-translacionais14, incluindo nitração proteica17, outros proteomes globais9, e demonstrou aplicações em várias amostras de tecido em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer11.
A preparação robusta da amostra é um passo crítico em um experimento cPILOT e pode ser demorado, trabalhoso e extenso. Multiplexing de amostra aprimorado requer tubulação extensiva e pessoal de laboratório altamente qualificado, e há vários fatores que podem influenciar fortemente a reprodutibilidade do experimento. Por exemplo, o manuseio cuidadoso das amostras é necessário para garantir tempos de reação semelhantes para todas as amostras e manter o pH tampão adequado para amostras fracastiladas leves e pesadas. Além disso, a preparação manual de dezenas a centenas de amostras pode introduzir um alto erro experimental. Portanto, para reduzir a variabilidade de preparação da amostra, melhorar a precisão quantitativa e aumentar o throughput experimental, desenvolvemos um fluxo de trabalho automatizado cPILOT. A automação é alcançada utilizando um dispositivo de manuseio líquido robótico que pode completar muitos aspectos do fluxo de trabalho (Figura 1). A preparação da amostra da quantificação proteica para a rotulagem de peptídeos foi realizada em um manipulador líquido automatizado. O manipulador líquido automatizado é integrado a um aparelho de pressão positivo (PPA) para trocas de buffer entre as placas de extração em fase sólida (SPE), shaker orbital e um dispositivo de aquecimento/resfriamento. A plataforma robótica contém 28 locais de deck para acomodar placas e buffers. Existem dois pods com um gripper para transferir as placas dentro dos locais do convés: uma cabeça de tubulação de volume fixo de 96 canais (5-1100 μL) e sondas de volume variável de 8 canais (1-1000 μL). A plataforma robótica é controlada usando um software. O usuário precisa ser treinado profissionalmente antes de usar o manipulador líquido robótico. O presente estudo se concentra na automatização do fluxo de trabalho manual cPILOT, que pode ser intensivo em mão-de-obra para o processamento de mais de 12 amostras em um único lote. A fim de aumentar o rendimento da abordagem cPILOT11,transferimos o protocolo cPILOT para um manipulador líquido robótico para processar mais de 10 amostras em paralelo. A automação também permite reações semelhantes para cada amostra em paralelo durante várias etapas do processo de preparação da amostra, o que exigiu que usuários altamente treinados alcançassem durante o CPILOT manual. Este protocolo se concentra na implementação do dispositivo de manuseio líquido automatizado para realizar o cPILOT. O presente estudo descreve o protocolo para o uso deste sistema automatizado e demonstra seu desempenho usando uma análise de 22 plex "prova de conceito" de homogeneizadores hepáticos de camundongos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Introduzimos um fluxo de trabalho de proteômica quantitativa de alto rendimento, rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT) capaz de multiplexar até 22 ou 24 amostras com etiquetas de massa tandem ou etiquetas isobáricas N,N-dimethyl leucina isobaric, respectivamente, em um único experimento. Este multiplexagem de amostra aprimorado reduz consideravelmente os tempos de aquisição de espectrometria de massa e aumenta a utilidade dos reagentes isobáicos comerciais caros. No entanto, o processo manual de manuseio de amostras e etapas de pipetação na estratégia pode ser trabalhoso, demorado e introduzir perda de amostra e erro quantitativo. Essas limitações podem ser superadas através da incorporação da automação. Aqui transferimos o protocolo manual cPILOT para um dispositivo de manuseio líquido automatizado que pode preparar grandes números de amostra (ou seja, 96 amostras) em paralelo. No geral, a automação aumenta a viabilidade e a reprodutibilidade do cPILOT e permite um amplo uso por outros pesquisadores com dispositivos de automação comparáveis.

A Figura 2 mostra dados representativos de MS de um peptídeo identificado em todos os 22 canais de íons de repórter de um experimento de 22-plex cPILOT, incluindo réplicas de fluxo de trabalho. A Figura 2 (topo) retrata um par de pico duplamente carregado separado por 4 espaçamentos de m/z indicando um único grupo de dimetila incorporado ao peptídeo. Os pares de pico dimetilado leves e pesados foram isolados e fragmentados independentemente para produzir a sequência do peptídeo. A sequência do peptídeo é G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) e corresponde à proteína Betaine-homocysteine S-metil transferase. Os íons fragmentos mais intensos para os picos leves e pesados dimetilados(não mostrados) foram ainda mais isolados para a fragmentação de MS3 e os íons repórteres(m/z 126-131) são mostrados na Figura 2 (inferior). As intensidades de íons repórteres são diretamente proporcionais à abundância de peptídeos na amostra. A abundância de peptídeos das amostras implica que a capacidade de pipetação da plataforma robótica é bastante uniforme nas 22 amostras. No geral, este experimento de 22 plex cPILOT resultou em 1326 (1209-light/1181-heavy) identificações de proteínas resultantes de 3098 (6137-light/5872-heavy) peptídeos(Tabela 4). A Figura 3 mostra o enredo da caixa de abundância log10 versus intensidades totais de íons de repórter em todos os 22 canais mostrando menor variabilidade entre bem/inter-amostra. A avaliação da automação total foi feita examinando o erro na abundância de íons repórteres em cada proteína nas 22 amostras. A Figura 4 mostra que o processamento de amostras com a plataforma robótica resultou em valores cv muito baixos. Especificamente, nos 3098 peptídeos identificados, o CV médio em abundância de íons repórteres foi de 12,36 % e 15,03 % para peptídeos leves e pesados dimetilados, respectivamente. Entre esses peptídeos 2032 desses peptídeos tinham sinal de íon repórter acima do limiar mínimo e foram considerados quantificáveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Figura 1. Fluxo de trabalho experimental para processar 22 amostras em paralelo com um protocolo cPILOT automatizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação de peptídeos em 22 amostras. Exemplo MS (superior) e MS3 (inferior) espectros do peptídeo G (dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) quantificados em 22-plex experimento cPILOT automatizado para picos dimetilados leves (inferior esquerdo) e dimetilados pesados (inferior direito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Figura 3. Gráfico de caixa de intensidades totais de íons de repórter versus log10 abundância de 22 amostras usando o descobridor proteome 2.3. O arquivo RAW foi pesquisado duas vezes por peptídeos leves e pesados, IDs de proteínas separadamente com TMT como modificação dinâmica, leve (+28.031 Da) e pesada (+36.076 & +35.069 Da) dimetilação no peptídeo N-termini como modificação estática. Uma pesquisa combinada com todas as modificações acima foi executada usando Proteome Discover 2.3 para obter o Log 10 Abundância de intensidades de peptídeos em todos os canais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Figura 4. Gráficos de violino de co-eficiente de variação da abundância de peptídeos a partir de intensidades de íons repórteres somadas através dos canais 126-131 m/z. O peptídeo foi quantificado com um valor médio cv de 12,36 e 15,03 para peptídeos leves (2373) e pesados (2533). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar 1. Ilustração do cPILOT com um único peptídeo. Mostrando a rotulagem isotópica de duas amostras diferentes e a marcação isobárica com TMT126,a mistura resultante foi injetada em MS para LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nome variável</td>
			<td>Valor</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volume a ser usado para desalto passo 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volume a ser usado para desalto passo 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volume a ser usado para desalto passo 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>False</td>
			<td>Falso reduzirá os tempos de incubação para 30seg- True seguirá o tempo de incubação no protocolo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Volume de DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de filtro</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Placa usada para desalvar</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volume para desalting</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>False</td>
			<td>Número de lavagens de água na placa SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume de iodoacetamida</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Volume de peptídeo para rotulagem TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pressão</td>
			<td>100</td>
			<td>pressão mbar no PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Mudança de temperatura</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Volume de tags isobárica a ser adicionado</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volume para diluir amostra antes da digestão</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volume de trippsina</td>
		</tr>
<tr>
<td>UsePopTimer</td>
			<td>Verdade</td>
			<td>True exibe as opções para aplicar pressão na placa, se necessário</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Lista de variáveis utilizadas no protocolo cPILOT automatizado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Fonte dil</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>Amostraid</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Amostras</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Mesa 2. Volume de fígado de rato homogeneado e 8 M de ureia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>FonteWell</td>
			<td>FonteWell2</td>
			<td>Repórter Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Amostraid</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 3. Número total de peptídeos, proteínas e fósforos espectrais de peptídeos (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">CPILOT automatizado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Luz</td>
			<td>Pesado</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteínas</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptídeos</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSMs</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 4. Barcoding as etiquetas isobáricas com as amostras leves e pesadas rotuladas.

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Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma estratégia de multiplexação de amostra aprimorada que é capaz de aumentar o número de amostras que podem ser analisadas simultaneamente com tags isobáricas disponíveis. A incorporação de uma plataforma robótica aumentou consideravelmente o rendimento experimental, a reprodutibilidade e a precisão quantitativa.

Multiplexação automatizada da amostra usando rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Nosso protocolo automatizado cPILOT torna mais fácil para os pesquisadores analisar amostras de forma de alto rendimento. Isso é significativo porque nos permite chegar a informações biológicas sobre doenças ou condições diferentes muito mais rapidamente. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a processar várias amostras em paralelo, reduzindo assim erros acionáveis ao usar amostras de alto rendimento.Nosso laboratório está interessado em aplicações relacionadas ao envelhecimento e doença de Alzheimer. No entanto, essa técnica também pode ser usada para estudar qualquer doença ou desafio para onde há tecidos biológicos envolvidos. Comece ligando o aparelho de pressão positiva, o dispositivo de aquecimento e resfriamento e as bombas de vácuo.Conecte todos os acessórios com o manipulador líquido, que mostrará uma luz azul uma vez que esteja conectada ao computador e pronta para operar. Aliquot 300 microliters do fígado homogeneizam-se em um tubo de 500 microliteres e colocá-lo em uma placa de poço de dois mililitros profundos. Armazene a amostra a quatro graus Celsius até o início do protocolo.Abra o método no software e coloque as dicas e labware necessários em suas posições. Em seguida, cruze com o layout final do deck e clique em Seguir para continuar o protocolo. Carregue 230 pontas de microliter e aspire 90 microliters de oito ureia molar do reservatório.Em seguida, dispensá-lo para remar um dos dois mililitros pretos placa de poço profundo. Descarregue as pontas do TL1 e repita esta etapa até que a ureia tenha sido adicionada a todos os poços. Depois de adicionar o tampão de desnaturação, use 90 dicas de microliter para transferir 10 microliters de fígado de rato homogeneizar para a placa do poço profundo.Descarregue as pontas, depois carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire três microliters de DTT a partir da placa de reagente um. Dispense dTT para as fileiras um e dois da placa do poço profundo. Sele a placa de amostra com papel alumínio e incuba-a a 37 graus Celsius por 600 segundos enquanto gira a 300 RPM.Após a incubação, carregue uma linha de 90 pontas de microliter, aspire seis microliters de IAM da placa de reagente um na linha três, e dispense-o para remar uma das placas de amostra. Sele a placa de amostra e incuba-a a quatro graus Celsius por 30 minutos enquanto gira a 300 RPM no dispositivo de resfriamento. Em seguida, deslacria a placa de amostra e carregue uma linha de 90 pontas de microliter.Aspire cinco microliters de cistina da placa de reagente um na linha dois e dispense-o para as linhas um e dois da placa de amostra. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, realize um shake cronometrado de 1800 RPM por 30 minutos.Em seguida, adicione 800 microliters de 20 mililitros tris tampão com 10 milimilas cloreto de cálcio em cada poço na placa de amostra para diluir a concentração de ureia para dois molares. Adicione 20 microliters de trippsina à primeira linha de uma placa de 96 poços e coloque a placa em um local especificado no convés. Depois de adicionar a trippsina à placa de amostra, selá-la e incuba-la por 15 horas a 37 graus Celsius e 600 RPM no dispositivo de aquecimento e resfriamento.Pare a digestão aspirando 150 microlitadores de ácido fórmico de 5% da linha três da placa de ácido fórmico e distribuindo-a para a placa de amostra nas linhas um e dois. Vá para desaltar os peptídeos. Use 1070 dicas de microliter para aspirar 600 microliters de acetonitrila.Em seguida, dispense-o nas linhas um e dois da extração de fase sólida, ou placa SPE, para ativar C-18. Em seguida, carregue a amostra digerida na placa SPE em duas passagens. Carregue duas linhas de pontas, aspire 534 microliters das amostras digeridas e dispense-as para as linhas um e dois da placa SPE.Aplique pressão na placa e repita esta etapa até que todas as amostras estejam carregadas. Limpe os peptídeos lavando com água e diluindo os peptídeos com 60 a 40 acetonitrila em ácido fórmico de 0,1%. Em seguida, coloque a placa em cima de uma placa de coleta para elute os peptídeos usando o aparelho de pressão positiva.Desenhe o fluxo e configure as dicas e labware necessários no software, cruze com o layout do deck e clique em Seguir para continuar o protocolo de dimetilação. Reconstitua os peptídeos em ácido acético de 1%. Para realizar a rotulagem de dimetilação, carregue 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 60 mililitros de formaldeído leve da segunda fileira da placa de reagente dois.Dispense-o para remar uma das placas de amostra e, em seguida, descarregue as pontas. Carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 60 mililitros de formaldeído pesado da linha três da placa de reagente dois. Dispense-o remar dois da placa de amostra e descarregue as pontas.Carregue duas linhas de 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 24 mililitros de sódio cianoboroidido e 24 milimolar de cianoborodeuteride de sódio das linhas um e dois da placa de reagente três, em seguida, dispense os reagentes para linhas um e dois da placa de amostra para iniciar a reação de dimetilação. Descarregue as pontas e use o agitador orbital para realizar um shake cronometrado por 15 minutos a 1800 RPM. Em seguida, carregue duas linhas de 90 pontas de microliter e aspire 32 microliters de 1%amônia das linhas três e quatro da placa de reagente três.Distribua-o nas linhas um e dois da placa de amostra dois para parar a reação. Combine volumes iguais de peptídeos dimetilados leves e pesados em uma nova placa de poço de dois mililitros profundos para desalar. Depois de desalar os peptídeos leves e pesados combinados, seque os peptídeos e realize a marcação isobárica.Reconstitua os peptídeos com 100 microlitres de 100 milimônios tampão de bicarbonato de trietilmonium em um agitador orbital. Em seguida, use 90 pontas de microliter para aspirar 25 microliters dos peptídeos dimetilados combinados e dispensá-los à primeira linha da placa de processamento TMT. Carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire 10 microliters de TMT.Dispense-o na primeira linha da placa de processamento TMT, descarregue as pontas e, em seguida, realize um shake cronometrado por uma hora a 1800 RPM. Aspire oito microliters de hidroxilamina da linha dois da placa TEAB e dispense-a para remar uma das placas de processamento TMT. Depois de um shake de 15 minutos a 1800 RPM, transfira 30,5 microliters dos peptídeos rotulados TMT para um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, proceda com a aquisição e análise dos dados de acordo com as instruções do manuscrito. Os dados representativos de MS de um peptídeo identificado em todos os 22 canais de íons de repórter de um 22 Plex combinados de rotulagem isotópica precursora e experimento de marcação isobárica são mostrados aqui. A sequência do peptídeo corresponde à betaine-homocisteína S-metiltransferase.Os íons fragmentos mais intensos para os picos leves e pesados dimetilados foram ainda mais isolados para a fragmentação de MS3. As intensidades de íons repórteres são diretamente proporcionais à abundância de peptídeos na amostra. No geral, este experimento de rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica reduziu os tempos de processamento da amostra e tornou possível visualizar a expressão proteica em vários canais ou condições.O gráfico de caixa de log 10 abundância versus intensidades totais de íons de repórter em todos os 22 canais mostra menor variabilidade entre poços ou inter-amostra. A avaliação da automação total foi feita examinando o erro na abundância de íons repórteres em cada proteína nas 22 amostras. O processamento de amostras com a plataforma robótica resultou em coeficientes muito baixos de variação.Nos 3098 peptídeos, o coeficiente médio de variação na abundância de íons repórteres foi de 12,36 e 15,03% para peptídeos leves e pesados dimetilados, respectivamente. Ao tentar este protocolo, é importante ter em mente que os níveis isotópicos e isobáricos são usados em um único experimento. Assim, é necessário realizar um planejamento cuidadoso para designar cada amostra com as tags destinadas a serem utilizadas no experimento.Este método pode ser facilmente integrado a outros sistemas robóticos, e pode ser aplicado a uma variedade de tecidos, como tecidos ou lisatos celulares e outros biofluidos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Química

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Medições de alta precisão de zinco isotópicas Aplicadas à mouse Órgãos

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Caracterização, quantificação e específicos do Composto isotópica Análise de Pirogênica carbono, usando Benzeno policarboxílicos Acids (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Separação e pré-concentração automatizadas de 90Sr em um sistema Lab-on-Valve no nível Ppq

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Metathesis de imine por catalisadores sílica-apoiados usando a metodologia da química organometálica de superfície

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Efeito isotópico no processo de transferência de prótons duplo de Porficeno investigado por método Enhanced QM/MM

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Preparação de amostras em medições de microequilíbrio de cristal de quartzo de adsorção de proteínas e mecânica de polímeros

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...