Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Авторы признают стартовые фонды Университета Вандербильта и премию NIH (R01GM117191) RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

cPILOT является усовершенствованная стратегия мультиплексирования, которая может анализировать до 24 образцов в одном эксперименте. Емкость мультиплексирования зависит от количества доступных изотопных и изобарических комбинаций меток. Внедрение TMTpro7, который способен помечать 16 образцов в одном эксперименте, может раздвинуть границы cPILOT до 32-plex. cPILOT состоит из нескольких шагов по трубе и требует тщательного ухода и навыков пользователя для выполнения подготовки образца. Даже с экспертом пользователя, ручные ошибки неизбежны, что предлагает использовать роботизированные платформы для обработки образцов в стратегии cPILOT. Так как cPILOT использует рН зависимых пометки пептидов, рН необходимо поддерживать для света и тяжелых dimethylated набор образцов. Мягко кисло-основной рН может привести к диметиляции как N-термини и лизина остатков. Преимущество cPILOT в том, что он требует только половины изобаричных тегов, так как пептид N-термини заняты диметил-группами. Это дает большее количество образцов, которые будут маркированы на половину стоимости. Обработка больших номеров выборки требует, чтобы время воздействия реагентов было аналогичным для первого и последнего образца в партии. Дозатор пипеток, который может вместить до 32 образцов параллельно, может быть лучше всего достигнут с помощью роботизированных жидкостных устройств обработки.
Для обработки нескольких образцов cPILOT в ручной рабочий процесс были внесены поправки, предусматривающие автоматизацию. Роботизированный жидкий обработчик, используемый в этом исследовании, имеет два стручка с 96-канальными и 8-канальными способностями трубоупожимить, с захватом, чтобы разместить пластины в доступных 28 местах палубы. Обработчик жидкости интегрирован с аппаратом положительного давления, орбитальным шейкером и устройством для нагрева/охлаждения образцов в пластине 96 хорошо. Аппарат положительного давления помогает выполнять буферные обмены в пластинах SPE во время очистки, в то время как орбитальный шейкер помогает вихрь / смешать образцы. Роботизированная платформа была запрограммирована на аспират и распределение буферов и образцов на 96-колодец пластин, инкубации, вихревых образцов и переносных пластин. Жидкости с различными вязкостями, такие как ацетонитрил и вода, требуют конкретных соображений трубопроводов, которые также могут быть запрограммированы в метод.
Рабочий процесс cPILOT, начиная от количественной оценки белка BCA и маркировки пептидов изобарических тегов (т.е. TMT), был выполнен в системе обработчика жидкостей. Полный протокол был масштабирован, чтобы использовать 96 глубоких пластин, которые могут в течение 2 мл на колодец. Буферы были подготовлены до начала эксперимента и добавлены к пластине 96, чтобы позволить параллельную обработку образца. В настоящем исследовании, 22 рабочих процессов репликации однородной печени мыши были добавлены в глубокие пластины хорошо и приняты через протокол cPILOT. Наконец, один образец, состоящий из 22-plex equimolar мыши печени помечены пептиды были введены в масс-спектрометр. Ионные интенсивности репортеров, соответствующие пептидным изобилиям в образцах, показали, что образцы, обработанные с помощью жидкого обработчика, имеют более низкие резюме, чем ручной протокол(данные не показаны). Роботизированная платформа также значительно улучшила воспроизводимость обработки образцов. Воспроизводимость и надежность являются очень важными факторами при обработке большого количества образцов. Ошибки трубопроводов могут привести к полной неправильной интерпретации данных, и здесь роботизированная платформа обеспечивает низкую меж образец вариации. Также использование роботизированной платформы для CPILOT сократило время, необходимое для подготовки образцов. Например, после разработки автоматизированного метода потребовалось 2,5 ч для обработки 22 образцов по сравнению с 7,5 ч для ручного cPILOT. В нашей лаборатории идут эксперименты по дальнейшей оценке сравнений ручных и автоматизированных рабочих процессов cPILOT. Основываясь на предыдущих отчетах из нашей лаборатории, CV%'s белка репортер ионных интенсивностей в ручной cPILOT были в среднем 20% с некоторыми выбросами превышает этозначение 12.
cPILOT является химической стратегией производной на пептидном уровне, которая может быть использована для любого типа образцов, таких как клетки, ткани и жидкости организма. cPILOT предлагает расширенный мультиплексирование образцов и с включением автоматизации может облегчить высокой пропускной способностью образца мультиплексирования в протеомии. Эта пропускная способность необходима для дальнейшего развития болезни и биологического понимания и открытия биомаркеров.

Масс-спектрометрия (MS) на основе протеомии является незаменимым инструментом исследования в выявлении конкретных биомаркеров заболевания, понимание прогрессирования заболевания, и создание приводит к терапевтическому развитию. Это может быть достигнуто из целого ряда связанных с болезнями клинических образцов, таких как сыворотка крови / плазма, проксимальные жидкости,и ткани 1,2. Открытие биомаркеров Proteomics и проверка в последнее время получили значительное внимание из-за мощности образца мультиплексированиястратегии 3,4. Пример мультиплексирования является методом, который позволяет одновременное сравнение и количественная оценка двух или более условий выборки в рамках одной инъекции MS5,6. Мультиплексирование образцов достигается путем штрихкодирования пептидов или белков из нескольких образцов с химическими, энзиматичными или метаболическими тегами и получения информации о MS из всех образцов в одном эксперименте MS или MS/MS. Среди доступных изобаричных тегов – изобаричные метки реагентов (iTRA), коммерческие тандемные метки массы (TMT), а в доме синтезированы изобарик N,N-dimethyl leucine (DiLeu) реагенты с возможностями до 16-plex7 и 21-plex8,соответственно.
Комбинированная изотопная маркировка прекурсоров и изобаричная маркировка (cPILOT) — это усовершенствованная технология мультиплексирования образцов. cPILOT сочетает в себе изотопную маркировку пептида N-термини со светом (CH3)2и тяжелым q(13C2H 3 )2- изотопами принизком рН (∼2,5), который сохраняет остатки лизина доступными для последующего высокого рН (8,5) изобарической маркировки с использованием TMT, DiLeu, или iTRA'пометки 3,9,10,11,12,13,14. Схема двойной маркировки стратегии cPILOT изображена на дополнительном рисунке 1 с двумя образцами с использованием пептида примера. Точность и точность количественной оценки на основе ТМТ на уровне MS2 могут быть скомпрометированы из-за наличия загрязняющих совместно изолированных и фрагментированных ионов, которые называются эффектом интерференции15. Это ограничение в неточных коэффициентах ионов репортера может быть преодолено с помощью трехбридных масс-спектрометров Orbitrap. Например, эффект интерференции можно преодолеть, изолировав пик в диметилированной паре на уровне MS1 в масс-спектрометре, подвергая свет или тяжелый пик фрагментации MS2 в линейной ионные ловушки, а затем подвергая наиболее интенсивный фрагмент MS2 для HCD-MS3 для получения количественной информации. Для того, чтобы увеличить шансы на выбор пептидов без лизина аминов, доступных для генерации ионов репортера, селективный MS3 приобретение на основе y-1 фрагмент также может быть использован и является подходом, который может привести к более высокий процент пептидов количественно с cPILOT9. Сочетание легкой и тяжелой маркировки увеличивает возможности мультиплексирования выборки в 2 раз, что достигается с помощью отдельных изобаричных тегов. Недавно мы использовали cPILOT для объединения до 24 образцов в одном эксперименте с реагентами DiLeu16. Кроме того cPILOT был использован для изучения окислительныхпост-переводческих модификаций 14 в том числебелка нитрат 17, другиеглобальные протеомы 9, и продемонстрировал применение через несколько образцов тканей в болезни Альцгеймера мышимодели 11.
Надежная подготовка образцов является важным шагом в эксперименте cPILOT и может быть трудоемкой, трудоемкой и обширной. Улучшенный мультиплексирование образцов требует обширного трубопроводного и высококвалифицированного лабораторного персонала, и есть несколько факторов, которые могут сильно повлиять на воспроизводимость эксперимента. Например, тщательная обработка образцов необходима для обеспечения аналогичного времени реакции для всех образцов и поддержания соответствующего буферного рН для легких и тяжелых диметилированных образцов. Кроме того, ручная подготовка десятков и сотен образцов может привести к высокой экспериментальной ошибке. Поэтому, чтобы уменьшить изменчивость подготовки выборки, повысить количественную точность и увеличить экспериментальную пропускную способность, мы разработали автоматизированный рабочий процесс cPILOT. Автоматизация достигается с помощью роботизированного жидкостного устройства обработки, которое может завершить многие аспекты рабочего процесса(рисунок 1). Подготовка образца от количественной оценки белка до маркировки пептидов проводилась на автоматизированном жидком обработчике. Автоматизированный жидкостный обработчик интегрирован с аппаратом положительного давления (PPA) для буферных обменов между твердоф фазаными пластинами извлечения (SPE), орбитальным шейкером и нагревательно-охлаждающим устройством. Роботизированная платформа содержит 28 палубных локаций для размещения пластин и буферов. Есть два стручка с захватом для передачи пластин в пределах палубы местах: 96-канал фиксированного объема трубы голову (5-1100 йл) и 8 каналов переменного объема зондов (1-1000 l). Роботизированная платформа управляется с помощью программного обеспечения. Пользователь должен быть профессионально обучен перед использованием роботизированного жидкого обработчика. Настоящее исследование посвящено автоматизации ручного рабочего процесса cPILOT, который может быть трудоемким для обработки более 12 образцов в одной партии. Для увеличения пропускной способности подхода11cPILOT мы передали протокол cPILOT роботизированному обработчику жидкости для параллельной обработки более 10 образцов. Автоматизация также позволяет проводить аналогичные реакции для каждой выборки параллельно на различных этапах процесса подготовки выборки, что требовало от высококвалифицированных пользователей достижения в ходе ручного cPILOT. Этот протокол фокусируется на внедрении автоматизированного устройства обработки жидкости для проведения cPILOT. Настоящее исследование описывает протокол использования этой автоматизированной системы и демонстрирует ее производительность с помощью 22-plex "доказательство концепции" анализ однородности печени мыши.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Мы ввели высокую пропускную способность количественного рабочего процесса протеомика, комбинированные изотопной маркировки прекурсоров и изобаричной пометки (cPILOT), способные мультиплексирования до 22 или 24 образцов с тандемной массы метки или изобарик N,N-диметил лейцин изобарические метки, соответственно, в одном эксперименте. Это усовершенствование мультиплексирования образцов значительно сокращает время приобретения масс-спектрометрии и увеличивает полезность дорогих коммерческих изобаричных реагентов. Тем не менее, ручной процесс обработки образцов и трубопроводов шаги в стратегии может быть трудоемким, трудоемким, и ввести потери выборки и количественные ошибки. Эти ограничения можно преодолеть путем включения автоматизации. Здесь мы передали ручной протокол cPILOT автоматизированному устройству обработки жидкостей, которое может параллельно готовить большие выборочных номера (т.е. 96 образцов). В целом автоматизация повышает осуществимость и воспроизводимость cPILOT и позволяет широко использовать другие исследователи с сопоставимыми устройствами автоматизации.

На рисунке 2 показаны репрезентативные данные MS пептида, идентифицированные во всех 22 ионных каналах репортеров из 22-плексного эксперимента cPILOT, включая репликацию рабочего процесса. На рисунке 2 (вверху) изображена вдвойне заряженная пиковая пара, разделенная интервалом 4 Da m/z с указанием одной диметиловой группы, включенной в пептид. Легкие и тяжелые диметилированные пиковые пары были изолированы и фрагментированы независимо, чтобы дать последовательность пептида. Последовательность пептида G(диметил)ААЕЛМЗК (ТМТ-11плекс) и соответствует белку бетаин-гомоцистеин S-метилэстазы. Наиболее интенсивные ионы фрагментов как для легких, так и для тяжелых диметилированныхпиков (не показанных) были дополнительно изолированы для фрагментации MS3, а ионы репортеров(m/z 126-131) показаны на рисунке 2 (внизу). Ионные интенсивности репортера прямо пропорциональны изобилию пептидов в образце. Пептидное изобилие образцов подразумевает, что способность роботизированной платформы достаточно однородна в 22 образцах. В целом, этот 22-плексный эксперимент cPILOT привел к 1326 (1209-легкий/1181-тяжелый) белков идентификации в результате 3098 (6137-легкий/5872-тяжелый) пептиды (Таблица 4). Рисунок 3 показывает поле участок log10 изобилие по сравнению с общей интенсивности ионов репортера во всех 22 каналов, показывающих меньшие меж-хорошо / между образцами изменчивости. Оценка общей автоматизации была сделана путем изучения ошибки в изобилии ионов репортера по каждому белку в 22 образцах. На рисунке 4 показано, что обработка образцов с помощью роботизированной платформы привела к очень низким значениям резюме. В частности, по 3098 пептидов определены средние резюме в репортер ион изобилие было 12,36% и 15,03% для легких и тяжелых dimethylated пептидов, соответственно. Среди этих пептидов 2032 из этих пептидов был репортер ионный сигнал выше минимального порога и были признаны количественно.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Рисунок 1. Экспериментальный рабочий процесс для обработки 22 образцов параллельно с автоматизированным протоколом cPILOT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Рисунок 2. Количественная оценка пептидов в 22 образцах. Пример MS (вверху) и MS3 (внизу) спектра пептида G(диметил)ААЕЛМЗК (TMT-11plex) количественно в 22-plex автоматизированного эксперимента cPILOT для легкого диметилированного (внизу слева) и тяжелых dimethylated (внизу справа) пиков. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Рисунок 3. Коробка участок общего репортера ионных интенсивностей по сравнению с log10 обилие 22 образцов с использованием протеом первооткрыватель 2.3. Файл RAW дважды искал легкие и тяжелые пептиды, белки СВУ отдельно с TMT в качестве динамической модификации, свет (28,031 да) и тяжелый (36,076 евро и 35,069 да) диметиляция на пептид N-термини в качестве статической модификации. Комбинированный поиск со всеми вышеперечисленными модификациями был запущен с помощью Proteome Discover 2.3 для получения log 10 Обилие пептидной интенсивности по всем каналам. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Рисунок 4. Скрипичные сюжеты соэфлитного вариации пептидного изобилия от суммированы репортерской ионные интенсивности по каналам 126-131 м/z. Пептид был количественно со средним значением CV 12,36 и 15,03 для света (2373) и тяжелых (2533) поддающихся количественной оценке пептидов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная цифра 1. Иллюстрация cPILOT с одним пептидом. Показаны изотопные маркировки двух различных образцов и изобарик пометки с TMT126, в результате смесь была введена в MS для LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Переменное имя</td>
			<td>Значение</td>
			<td>Описание</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>Ложных</td>
			<td>Ложные сократит инкубацио время до 30sec- Правда будет следовать инкубации времени в протоколе.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Объем DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>ФильтрПлате</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Плита, используемая для дезавуирования</td>
		</tr>
<tr>
<td>ФильтрПлатеВол</td>
			<td>600</td>
			<td>Объем для дезавуирования</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>Ложных</td>
			<td>Количество промывок воды на плите SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Объем иодоацетамида</td>
		</tr>
<tr>
<td>ПептидTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Объем пептида для маркировки TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Давления</td>
			<td>100</td>
			<td>давление мбара в PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ТемпОффСет</td>
			<td>1</td>
			<td>Изменение температуры</td>
		</tr>
<tr>
<td>ТМТВол</td>
			<td>10</td>
			<td>Исобарический объем тегов, который будет добавлен</td>
		</tr>
<tr>
<td>ТрисВол</td>
			<td>800</td>
			<td>Объем для разбавления образца до пищеварения</td>
		</tr>
<tr>
<td>ТрипсинВол</td>
			<td>2</td>
			<td>Объем трипсина</td>
		</tr>
<tr>
<td>ИспользованиеPopTimer</td>
			<td>Истинный</td>
			<td>Правда отображает варианты для оказания давления на пластину, если это необходимо</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Список переменных, используемых в автоматизированном протоколе CPILOT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>ДилИсточник</td>
			<td>ДилУэлл</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>ДилВум</td>
			<td>СтокИсточник</td>
			<td>Стоквелл</td>
			<td>ОбразецВол</td>
			<td>ОбразецID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Образцы</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 2. Объем гомогената печени мыши и 8 М мочевины.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ИсточникУэлл</td>
			<td>ИсточникWell2</td>
			<td>Репортер Ион</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Объем</td>
			<td>ОбразецID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3. Общее количество пептидов, белков и пептидных спектральных совпадений (PSMs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Автоматизированный cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Свет</td>
			<td>Тяжелых</td>
		</tr>
<tr>
<td>Белки</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пептиды</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSMs</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4. Баркодирование изобарических тегов с легкими и тяжелыми маркированными образцами.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Комбинированная изотопная маркировка прекурсоров и изобарическая маркировка (cPILOT) — это усовершенствованная стратегия мультиплексирования образцов, способная увеличить количество образцов, которые могут быть проанализированы одновременно с доступными изобарическими тегами. Включение роботизированной платформы значительно увеличило экспериментальную пропускную способность, воспроизводимость и количественную точность.

Автоматизированная мультиплексирование образцов с помощью комбинированной изотопной маркировки прекурсоров и исобарической маркировки (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Наш автоматизированный протокол cPILOT упрощает для исследователей анализ образцов с высокой пропускной способностью. Это важно, потому что позволяет нам получить биологическую информацию о заболеваниях или различных условиях намного быстрее. Основным преимуществом этого метода является то, что он помогает обрабатывать несколько образцов параллельно, тем самым уменьшая действия ошибок при использовании высокой пропускной способности образцов.Наша лаборатория заинтересована в приложениях, связанных со старением и болезнью Альцгеймера. Тем не менее, этот метод также может быть использован для изучения любого заболевания или вызов, где Есть биологические ткани участие. Начните с включением аппарата положительного давления, нагревательного и охлаждающего устройства, а также вакуумных насосов.Соедините все аксессуары с жидким обработчиком, который покажет синий свет, как только он подключен к компьютеру и готов к работе. Aliquot 300 микролитров однородной печени в 500 микролитровую трубку и поместите его на две миллилитровые глубокие пластины хорошо. Храните образец при четырех градусах Цельсия до начала протокола.Откройте метод в программном обеспечении и поместите необходимые советы и лабораторные программы в свои позиции. Затем перепроверьте окончательный макет колоды и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол. Загрузите 230 микролитровых наконечников и аспиратор 90 микролитров восьми молярных мочевины из резервуара.Затем обойтись его грести один из черных двух миллилитров глубокой пластины хорошо. Разгрузите кончики TL1 и повторите этот шаг до тех пор, пока мочевина не будет добавлена во все скважины. После добавления буфера денатурации, используйте 90 советов микролитров для передачи 10 микролитров гомогената печени мыши в глубокую пластину хорошо.Разгрузите наконечники, затем загрузите один ряд из 90 микролитров и аспирировать три микролитров DTT из реагентной пластины один. Обойти DTT для строк один и два из глубокой пластины хорошо. Печать образца пластины с алюминиевой фольгой и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 600 секунд при повороте при 300 об/мин.После инкубации загрузите один ряд из 90 наконечников микролитров, аспирировать шесть микролитров IAM из реагентной пластины один на третий ряд, и раздать его грести один из образца пластины. Печать образца пластины и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут при повороте при 300 об/мин на охлаждающем устройстве. Затем распечатать образец пластины и загрузить один ряд из 90 микролитров советы.Аспират пять микролитров цистина из реагентной пластины один на ряд два и обойтись его в ряды один и два образца пластины. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации выполните приуми время встряхивания 1800 об/мин в течение 30 минут.Затем добавьте 800 микролитров 20 миллимолярный буфер Tris с 10 миллимолярный хлорид кальция в каждую хорошо на образца пластины, чтобы разбавить концентрацию мочевины до двух моляров. Добавьте 20 микролитров трипсина в первый ряд пластины из 96 колодцев и поместите пластину в указанное место на палубе. После добавления трипсина в образец пластины, запечатать его и инкубировать его в течение 15 часов при 37 градусов по Цельсию и 600 об /мин на нагревательное и охлаждающее устройство.Остановите пищеварение, аспирируя 150 микролитров 5%-кремовой кислоты из строки три из пластины formic кислоты и распределяя его в образец пластины на ряды один и два. Приступайте к опреснетию пептидов. Используйте 1070 микролитров советы аспирировать 600 микролитров ацетонитрила.Затем раздай его рядами один и два из твердой фазы извлечения, или SPE пластины, чтобы активировать C-18. Затем загрузите переваренный образец на пластину SPE в два прохода. Загрузите два ряда наконечников, аспиратор 534 микролитров переваренных образцов, и раздайте их в ряды один и два из пластины SPE.Нанесите давление на пластину и повторите этот шаг до тех пор, пока все образцы не будут загружены. Очистите пептиды, промыв воду и разбавьте пептиды от 60 до 40 ацетонитриле в 0,1% кремной кислоты. Затем поместите пластину поверх пластины коллекции, чтобы утаить пептиды с помощью аппарата положительного давления.Нарисуйте поток через и настроить необходимые советы и labware в программном обеспечении, перепроверить с макетом палубы, и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол для диметиляции. Восстановить пептиды в 1%acetic кислоты. Для выполнения маркировки диметилирования загрузите 90 наконечников микролитров и оспиратив 16 микролитров 60 миллимолярный световой формальдегид из второго ряда реагентной пластины.Выгрузите его, чтобы грести один из образца пластины, а затем выгрузить советы. Загрузите один ряд из 90 микролитровых наконечников и аспират 16 микролитров 60 миллимолярный тяжелый формальдегид из ряда три реагентной пластины два. Выгрузите его строку два образца пластины и выгрузить советы.Загрузите два ряда из 90 микролитров наконечников и аспират 16 микролитров 24 миллимолярный цианоборогидрид натрия и 24 миллимолярный цыанобородегид из рядов один и два реагентов пластины три, а затем обойтись реагентов строк один и два образца пластины, чтобы начать реакцию диметиляции. Разгрузите кончики и используйте орбитальный шейкер для выполнения приурочных встряхивания в течение 15 минут при 1800 об/мин. Затем загрузите два ряда из 90 микролитров и аспирировать 32 микролитера по 1%аммиака из рядов три и четыре реагентной пластины три.Раздай его в ряды один и два образца пластины два, чтобы остановить реакцию. Объедините равные объемы легких и тяжелых диметилированных пептидов в новой двухми миллилитр глубокой пластине хорошо для опреснительного. После опреснивания комбинированных легких и тяжелых пептидов высушите пептиды и выполните изобариковые пометки.Восстановить пептиды с 100 микролитров 100 миллимолярный буфер триэтилмония бикарбоната на орбитальном шейкере. Затем используйте 90 микролитров, чтобы аспирировать 25 микролитров комбинированных диметилированных пептидов и выдать их в первый ряд перерабатывающей пластины TMT. Загрузите один ряд из 90 микролитровых наконечников и аспирировать 10 микролитров TMT.Разгрузите его в первом ряду перерабатывающей пластины TMT, разгрузите кончики, затем выполните тайминговый коктейль в течение одного часа при 1800 об/мин. Аспирировать восемь микролитров гидроксиламина из второго ряда пластины TEAB и раздать его грести один из TMT обработки пластины. После 15-минутного встряхивания при 1800 об/мин перенесите 30,5 микролитров пептидов СМТ в 1,5 миллилитровую трубку.Затем приступайте к сбору и анализу данных в соответствии с рукописными указаниями. Здесь показаны репрезентативные данные MS пептида, идентифицированные во всех 22 ионных каналах репортера из изотопной маркировки 22 Plex. Последовательность пептида соответствует бетаин-гомоцистеин S-метилтрансферазе.Наиболее интенсивные ионы фрагментов как для легких, так и для тяжелых диметилированных пиков были дополнительно изолированы для фрагментации MS3. Ионные интенсивности репортера прямо пропорциональны изобилию пептидов в образце. В целом, этот комбинированный изотопной маркировки прекурсоров и изотопных пометки эксперимент сократил время обработки образца и сделал возможным визуализировать выражение белка через несколько каналов или условий.Коробка участок журнала 10 изобилия по сравнению с общей интенсивности ионов репортера во всех 22 каналов показывает меньшей межуголовной или меж образец изменчивости. Оценка общей автоматизации была сделана путем изучения ошибки в изобилии ионов репортера по каждому белку в 22 образцах. Обработка образцов с помощью роботизированной платформы привела к очень низким коэффициентам вариации.По 3098 пептидам средний коэффициент вариации в изобилии ионов репортеров составил 12,36 и 15,03% для легких и тяжелых диметилированных пептидов соответственно. При попытке этого протокола важно иметь в виду, что изотопные и изобарические уровни используются в одном эксперименте. Таким образом, необходимо тщательное планирование для обозначения каждого образца с тегами, предназначенными для использования в эксперименте.Этот метод может быть легко интегрирован в другие роботизированные системы, и он может быть применен к различным тканям, таким как ткани или клетки лисаты и другие биофлюиды.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Высокоточных измерений Цинк Изотопные Применительно к мыши органов

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Количественный Glycomics и протеомикс Комбинированная стратегия очистки

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Характеристика, Количественное и соединение конкретных изотопный анализ пирогенного углерода с использованием Бензол поликарбоновых кислот (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Пептидов и белков количественной оценки с использованием автоматизированных иммуно-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Автоматизированный 90Sr разделения и кислотоупоров в лаборатории на клапан системы на уровне Ppq

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Имин Метатез с помощью поддерживаемых Силикой катализаторов с использованием методологии поверхностной органометрической химии

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Изотопный эффект в двойном процессе передачи протона порфицена, исследованного расширенным методом ЗМ/ММ

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Подготовка образцов в кварцевом кристалле Измерение микробаланса белковой адсорбции и полимерной механики

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...