Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Los autores reconocen los Fondos de Puesta en marcha de la Universidad Vanderbilt y el premio NIH (R01GM117191) a RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

cPILOT es una estrategia de multiplexación mejorada que puede analizar hasta 24 muestras en un solo experimento. La capacidad de multiplexación depende del número de combinaciones de etiquetado isotópica e isobárica disponibles. La introducción del TMTpro7,que es capaz de etiquetar 16 muestras en un solo experimento, puede empujar los límites de cPILOT a 32-plex. cPILOT consta de múltiples pasos de pipeteo y requiere un cuidado extenso y habilidades del usuario para realizar la preparación de la muestra. Incluso con un usuario experto, los errores manuales son inevitables, lo que invita al uso de plataformas robóticas para procesar muestras en la estrategia cPILOT. Dado que cPILOT utiliza el etiquetado dependiente del pH de los péptidos, el pH debe mantenerse para la luz y el conjunto pesado dimetilado de muestras. El pH levemente ácido-básico puede resultar en dimetilización de residuos de N-termini y lisina. Una ventaja de cPILOT es que requiere sólo la mitad de las etiquetas isobáricas ya que el péptido N-termini está ocupado con los grupos dimetilos. Esto permite etiquetar un mayor número de muestras a la mitad del costo. El manejo de números de muestra más grandes requiere que los tiempos de exposición de los reactivos sean similares para la primera y la última muestra de un lote. Un dispensador de pipetas que puede acomodar hasta 32 muestras en paralelo se puede lograr mejor con el uso de dispositivos robóticos de manipulación de líquidos.
Con el fin de procesar varias muestras por cPILOT, el flujo de trabajo manual se modificó para incorporar la automatización. El manipulador de líquidos robótico utilizado en este estudio tiene dos vainas con capacidades de pipeteo de 96 canales y 8 canales, con una pinza para colocar las placas en las 28 ubicaciones disponibles de la cubierta. El manipulador de líquidos está integrado con un aparato de presión positiva, agitador orbital y un dispositivo para calentar/enfriar muestras en la placa de 96 pozos. El aparato de presión positiva ayuda a realizar intercambios de búferes en las placas SPE durante la limpieza, mientras que el agitador orbital ayuda a vórtice/mezcla las muestras. La plataforma robótica fue programada para aspirar y dispensar tampones y muestras a placas de 96 pozos, incubación, muestras de vórtice y placas de transferencia. Los líquidos con diferentes viscosidades, como el acetonitrilo y el agua, requieren consideraciones específicas de pipeteo que también se pueden programar en el método.
El flujo de trabajo de cPILOT, desde la cuantificación de proteínas por BCA hasta el etiquetado de los péptidos con etiquetas isobáricas (es decir, TMT), se realizó en el sistema de manipulador de líquidos. El protocolo completo se a escala para utilizar 96 placas de pozos profundos que pueden contener 2 ml por pozo. Los buffers se prepararon antes del inicio del experimento y se agregaron a la placa de 96 pozos para permitir el procesamiento paralelo de la muestra. En el presente estudio, se añadieron 22 réplicas de flujo de trabajo de homogeneización hepática de ratón a las placas de pozos profundos y se llevaron a través del protocolo cPILOT. Finalmente, se inyectó una sola muestra compuesta por los péptidos etiquetados con ratón equimolar 22-plex etiquetados al espectrómetro de masas. Las intensidades de iones del reportero correspondientes a las abundancias de péptidos en las muestras demostraron que las muestras procesadas con el manipulador de líquidos tienen CV más bajos que el protocolo manual(datos no mostrados). La plataforma robótica también mejoró en gran medida la reproducibilidad del procesamiento de muestras. La reproducibilidad y la robustez son factores muy importantes durante el procesamiento de un gran número de muestras. Los errores de pipeteo pueden conducir a una interpretación errónea completa de los datos y aquí la plataforma robótica proporcionó una baja variación entre muestras. También el uso de la plataforma robótica para cPILOT redujo el tiempo necesario para preparar muestras. Por ejemplo, después de desarrollar el método automatizado, requirió 2,5 h para procesar 22 muestras en comparación con 7,5 h para cPILOT manual. Los experimentos están en marcha en nuestro laboratorio para evaluar aún más las comparaciones de los flujos de trabajo manuales y automatizados de cPILOT. Basándose en informes anteriores de nuestro laboratorio, el CV% de las intensidades de iones de reportero de proteínas en el manual cPILOT fueron en promedio 20% con algunos valores atípicos que superan este valor12.
cPILOT es una estrategia de derivación química a nivel de péptido, que se puede utilizar para cualquier tipo de muestra como células, tejidos y fluidos corporales. cPILOT ofrece multiplexación de muestras mejorada y con la incorporación de automatización puede facilitar la multiplexación de muestras de alto rendimiento en proteómica. Este rendimiento es necesario para avanzar aún más en la comprensión de la enfermedad y la comprensión biológica y el descubrimiento de biomarcadores.

La proteómica basada en espectrometría de masas (MS) es una herramienta de investigación indispensable para identificar biomarcadores específicos de la enfermedad, comprender la progresión de la enfermedad y crear líderes para el desarrollo terapéutico. Esto se puede lograr a partir de una gama de muestras clínicas relacionadas con la enfermedad, como suero sanguíneo/plasma, fluidos proximales y tejidos1,2. El descubrimiento y validación de biomarcadores proteómicos recientemente han ganado una consideración significativa debido al poder de las estrategias de multiplexación de muestras3,4. La multiplexación de muestras es una técnica que permite la comparación y cuantificación simultáneas de dos o más condiciones de muestra dentro de una sola inyección de MS5,6. La multiplexación de muestras se logra mediante la codificación de códigos de barras o proteínas a partir de múltiples muestras con etiquetas químicas, enzimáticas o metabólicas y la obtención de información sobre la E.M. de todas las muestras en un solo experimento de MS o MS/MS. Entre las etiquetas isobáricas disponibles se encuentran reactivos de etiquetado isobárico (iTRAQ), etiquetas de masa en tándem comercial (TMT) y reactivos isobáricos N,N-dimetil leucina (DiLeu) sintetizados con capacidades de hasta 16-plex7 y 21-plex8,respectivamente.
El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una tecnología de multiplexación de muestra mejorada. cPILOT combina el etiquetado isotópico del péptido N-termini con la luz [-(CH3)2] y los hiótopos pesados [-(13C2H3)2] a pH bajo (∼2.5), lo que mantiene el residuo de lisina disponible para el posterior etiquetado isobárico de pH alto (8.5) utilizando TMT, Etiquetado DiLeu, o iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. El esquema de etiquetado dual de la estrategia cPILOT se describe en la Figura Suplementaria 1 con dos muestras utilizando un péptido de ejemplo. La precisión y la precisión de la cuantificación basada en TMT a nivel MS2 pueden verse comprometidas debido a la presencia de iones coaislados y co-fragmentados contaminantes llamados efecto de interferencia15. Esta limitación en las relaciones iónicas de reporteros inexactas se puede superar con la ayuda de espectrómetros de masas Orbitrap tribridos. Por ejemplo, el efecto de interferencia se puede superar aislando un pico en un par dimetilado en el nivel de MS1 en el espectrómetro de masas, sometiendo la luz o el pico pesado a la fragmentación de MS2 en la trampa de iones lineales y luego sometiendo el fragmento de MS2 más intenso para HCD-MS3 para obtener información cuantitativa. Con el fin de aumentar las posibilidades de seleccionar los péptidos sin aminas de lisina disponibles para la generación de iones de reportero, también se puede utilizar una adquisición selectiva de MS3 basada en el fragmento y-1 y es un enfoque que puede dar lugar a un mayor porcentaje de péptidos cuantificables con cPILOT9. La combinación de etiquetado ligero y pesado aumenta las capacidades de multiplexación de muestras en un factor de 2x a la lograda con etiquetas isobáricas individuales. Recientemente hemos utilizado cPILOT para combinar hasta 24 muestras en un solo experimento con reactivos DiLeu16. Además cPILOT se ha utilizado para estudiar las modificaciones oxidativas post-traduccionales14 incluyendo la nitración de proteínas17, otros proteomas globales9, y ha demostrado aplicaciones a través de múltiples muestras de tejido en un ratón de la enfermedad de Alzheimer modelo11.
La preparación robusta de muestras es un paso crítico en un experimento cPILOT y puede ser lenta, laboriosa y extensa. La multiplexación de muestras mejorada requiere pipeteo extenso y personal de laboratorio altamente calificado, y hay varios factores que pueden influir en gran medida en la reproducibilidad del experimento. Por ejemplo, es necesario un manejo cuidadoso de las muestras para garantizar tiempos de reacción similares para todas las muestras y para mantener el pH tampón adecuado para muestras de dimetilado ligeros y pesados. Además, la preparación manual de decenas a cientos de muestras puede introducir un alto error experimental. Por lo tanto, para reducir la variabilidad de la preparación de muestras, mejorar la precisión cuantitativa y aumentar el rendimiento experimental, desarrollamos un flujo de trabajo automatizado de cPILOT. La automatización se logra mediante un dispositivo robótico de manipulación de líquidos que puede completar muchos aspectos del flujo de trabajo (Figura 1). La preparación de muestras desde la cuantificación de proteínas hasta el etiquetado de péptidos se realizó en un manipulador de líquidos automatizado. El manipulador de líquido automatizado está integrado con un aparato de presión positiva (PPA) para intercambios de búferes entre las placas de extracción de fase sólida (SPE), el agitador orbital y un dispositivo de calefacción/refrigeración. La plataforma robótica contiene 28 ubicaciones de cubierta para acomodar placas y tampones. Hay dos vainas con una pinza para transferir las placas dentro de las ubicaciones de la cubierta: un cabezal de pipeteo de volumen fijo de 96 canales (5-1100 l) y sondas de volumen variable de 8 canales (1-1000 l). La plataforma robótica se controla mediante un software. El usuario debe ser entrenado profesionalmente antes de usar el manipulador de líquidos robótico. El presente estudio se centra en la automatización del flujo de trabajo manual de cPILOT, que puede ser intensivo en mano de obra para procesar más de 12 muestras en un solo lote. Con el fin de aumentar el rendimiento del enfoque11de cPILOT, transferimos el protocolo cPILOT a un manipulador de líquidos robótico para procesar más de 10 muestras en paralelo. La automatización también permite reacciones similares para cada muestra en paralelo durante varios pasos del proceso de preparación de la muestra, lo que requería que los usuarios altamente capacitados lo lograran durante el cPILOT manual. Este protocolo se centra en la implementación del dispositivo automatizado de manipulación de líquidos para llevar a cabo cPILOT. El presente estudio describe el protocolo para el uso de este sistema automatizado y demuestra su rendimiento utilizando un análisis de 22 plex "prueba de concepto" de homogeneizatos hepáticos de ratón.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Hemos introducido un flujo de trabajo proteómico cuantitativo de alto rendimiento, etiquetado isotópico precursor combinado y etiquetado isobárico (cPILOT) capaz de multiplexar hasta 22 o 24 muestras con etiquetas de masa en tándem o etiquetas isobáricas isobáricas de leucina N,N-dimetil, respectivamente, en un solo experimento. Esta multiplexación de muestras mejorada reduce considerablemente los tiempos de adquisición de espectrometría de masas y aumenta la utilidad de los costosos reactivos isobáricos comerciales. Sin embargo, el proceso manual de los pasos de manipulación y pipeteo de muestras en la estrategia puede ser intensivo en mano de obra, consumir mucho tiempo e introducir la pérdida de muestra y el error cuantitativo. Estas limitaciones se pueden superar mediante la incorporación de la automatización. Aquí transferimos el protocolo cPILOT manual a un dispositivo automatizado de manipulación de líquidos que puede preparar grandes números de muestra (es decir, 96 muestras) en paralelo. En general, la automatización aumenta la viabilidad y reproducibilidad de cPILOT y permite un uso amplio por parte de otros investigadores con dispositivos de automatización comparables.

La Figura 2 muestra los datos representativos de la MS de un péptido identificado en los 22 canales iónicos de reportero de un experimento cPILOT de 22 plex, incluidas las réplicas del flujo de trabajo. La Figura 2 (superior) representa un par de picos doblemente cargado separado por un espaciado de 4 Da m/z que indica un único grupo dimetil incorporado en el péptido. Los pares de picos dimetilados ligeros y pesados fueron aislados y fragmentados independientemente para producir la secuencia del péptido. La secuencia del péptido es G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) y corresponde a la proteína Betaína-homocisteína S-metiltransferasa. Los iones de fragmento más intensos para los picos dimetilados ligeros y pesados(no mostrados)se aislaron aún más para la fragmentación de la MS 3 y losiones del reportero (m/z 126-131) se muestran en la Figura 2 (abajo). Las intensidades de iones del reportero son directamente proporcionales a la abundancia de péptidos en la muestra. La abundancia de péptidos de las muestras implica que la capacidad de pipeteo de la plataforma robótica es bastante uniforme en las 22 muestras. En general, este experimento cPILOT de 22 plexos dio como resultado 1326 (1209-light/1181-heavy) identificaciones de péptidos(Tabla 4). La Figura 3 muestra la gráfica de caja de abundancia log10 frente a las intensidades totales de iones de reportero en todos los 22 canales que muestran una menor variabilidad entre pozos/entre muestras. La evaluación de la automatización total se realizó examinando el error en la abundancia de iones de reportero en cada proteína en las 22 muestras. La Figura 4 muestra que el procesamiento de muestras con la plataforma robótica dio lugar a valores de CV muy bajos. Concretamente, en los 3098 los péptidos identificaron que el CV medio en abundancia de iones de reportero era del 12,36 % y del 15,03 % para los péptidos dimetilados ligeros y pesados, respectivamente. Entre estos péptidos 2032 de estos péptidos tenía señal de iones reportero por encima del umbral mínimo y se consideraron cuantificables.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Figura 1. Flujo de trabajo experimental para procesar 22 muestras en paralelo con un protocolo cPILOT automatizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Figura 2. Cuantificación de péptidos en 22 muestras. Ejemplo de MS (arriba) y MS3 (abajo) espectros del péptido G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) cuantificados en 22-plex experimento automatizado cPILOT para picos dimetilados ligeros (abajo a la izquierda) y dimetilados pesados (abajo a la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Figura 3. Gráfica de caja de intensidades de iones de reportero totales frente a abundancia de log10 de 22 muestras utilizando el descubridor de proteome 2.3. El archivo RAW se buscó dos veces para péptidos ligeros y pesados, los PÉPTIDOs de proteínas por separado con TMT como modificación dinámica, la luz (+28.031 Da) y la pesada (+36.076 y +35.069 Da) dimetilación en el péptido N-termini como modificación estática. Una búsqueda combinada con todas las modificaciones anteriores se ejecutó utilizando Proteome Discover 2.3 para obtener el Registro 10 Abundancia de Intensidads de péptidos en todos los canales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Figura 4. Gráficas de violín de coeficiente de variación de la abundancia de péptidos de intensidades de iones de reportero sumadas a través de canales 126-131 m/z. El péptido se cuantificó con un valor medio de CV de 12,36 y 15,03 para péptidos cuantificables ligeros (2373) y pesados (2533). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1. Ilustración del cPILOT con un solo péptido. Mostrando el etiquetado isotópico de dos muestras diferentes y el etiquetado isobárico con TMT126,la mezcla resultante se inyectó a MS para LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nombre de la variable</td>
			<td>Valor</td>
			<td>Descripción</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volumen que se utilizará para desalto paso 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volumen que se utilizará para desalto paso 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volumen que se utilizará para el paso 3 de desalto</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>Falso</td>
			<td>False reducirá los tiempos de incubación a 30 segundos- True seguirá el tiempo de incubación en el protocolo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Volumen de TDT</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlate</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Placa utilizada para la desaladuración</td>
		</tr>
<tr>
<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volumen para desalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>Falso</td>
			<td>Número de lavados de agua en la placa SPE</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volumen de iodoacetamida</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Volumen de péptido para etiquetado TMT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Presión</td>
			<td>100</td>
			<td>presión mbar en PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Cambio de temperatura</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Volumen de etiquetas isobáricas que se añadirán</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volumen para diluir la muestra antes de la digestión</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volumen de la trippsina</td>
		</tr>
<tr>
<td>UsePopTimer</td>
			<td>Verdad</td>
			<td>True muestra las opciones para aplicar presión sobre la placa si es necesario</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Lista de variables utilizadas en el protocolo automatizado cPILOT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilSource</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Muestras</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Cuadro 2. Volumen de homogenerato de hígado de ratón y 8 M de urea.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>SourceWell</td>
			<td>SourceWell2</td>
			<td>Reportero Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 3. Número total de péptidos, proteínas y coincidencias espectrales de péptidos (PMP).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">cPILOT automatizado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Luz</td>
			<td>Pesado</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteínas</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Péptidos</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 4. Barras de barras las etiquetas isobáricas con las muestras etiquetadas ligeras y pesadas.

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Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Nuestro protocolo automatizado cPILOT facilita a los investigadores el análisis de muestras de una manera de alto rendimiento. Esto es significativo porque nos permite llegar a la información biológica sobre enfermedades o diferentes condiciones mucho más rápido. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a procesar varias muestras en paralelo, reduciendo así los errores procesables mientras se utilizan muestras de alto rendimiento.Nuestro laboratorio está interesado en aplicaciones relacionadas con el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, esta técnica también se puede utilizar para estudiar cualquier enfermedad o desafío para donde hay tejidos biológicos involucrados. Comience por encender el aparato de presión positiva, el dispositivo de calefacción y refrigeración y las bombas de vacío.Conecte todos los accesorios con el manipulador de líquidos, que mostrará una luz azul una vez que esté conectado al ordenador y listo para funcionar. Aliquot 300 microlitros del hígado homogeneizan en un tubo de 500 microlitros y colóquelo en una placa de pozo de dos mililitros de profundidad. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados hasta el inicio del protocolo.Abra el método en el software y coloque los consejos y el material de laboratorio necesarios en sus posiciones. A continuación, coteje con el diseño final del mazo y haga clic en Siguiente para continuar con el protocolo. Cargue 230 puntas de microlitro y aspire 90 microlitros de ocho urea molares del depósito.A continuación, prescinda para remar una de las placas negras de dos mililitros de profundidad. Descargue las puntas del TL1 y repita este paso hasta que se haya añadido urea a todos los pozos. Después de añadir el tampón de desnaturalización, utilice 90 puntas de microlitros para transferir 10 microlitros de homogeneización hepática de ratón a la placa de pozo profundo.Descargue las puntas, luego cargue una fila de 90 puntas de microlitros y aspire tres microlitros de TDT de la placa de reactivo uno. Dispensar la TDT a las filas uno y dos de la placa de pozo profundo. Selle la placa de muestra con papel de aluminio e i incuba a 37 grados Centígrados durante 600 segundos mientras gira a 300 RPM.Después de la incubación, cargue una fila de 90 puntas de microlitros, aspire seis microlitros de IAM de la placa de reactivo uno en la fila tres y dispensúe para remar una de la placa de muestra. Selle la placa de muestra e iine a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras gira a 300 RPM en el dispositivo de refrigeración. A continuación, despreomine la placa de muestra y cargue una fila de 90 puntas de microlitrotro.Aspirar cinco microlitros de cistina de la placa de reactivo uno en la fila dos y dispensarlo a las filas uno y dos de la placa de muestra. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, realice un batido cronometrete de 1800 RPM durante 30 minutos.A continuación, añada 800 microlitros de 20 tampones Tris mililares con cloruro de calcio 10 mililitros a cada pozo en la placa de muestra para diluir la concentración de urea a dos molares. Agregue 20 microlitros de trippsina a la primera fila de una placa de 96 pozos y coloque la placa en un lugar específico en la cubierta. Después de añadir la tripina a la placa de muestra, sellarla e incubar durante 15 horas a 37 grados Celsius y 600 RPM en el dispositivo de calefacción y refrigeración.Detenga la digestión aspirando 150 microlitros de 5% de ácido fórmico de la fila tres de la placa de ácido fórmico y distribuyéndola a la placa de muestra en las filas uno y dos. Proceda a desalar los péptidos. Utilice 1070 puntas de microlitros para aspirar 600 microlitros de acetonitrilo.A continuación, prescinda en las filas uno y dos de la extracción de fase sólida, o placa SPE, para activar C-18. A continuación, cargue la muestra digerida en la placa SPE en dos pasadas. Cargue dos filas de puntas, aspire 534 microlitros de las muestras digeridas y dispensúelas en las filas una y dos de la placa SPE.Aplique presión a la placa y repita este paso hasta que se carguen todas las muestras. Limpiar los péptidos lavando con agua y diluir los péptidos con 60 a 40 acetonitrilo en 0,1%ácido fórmico. A continuación, coloque la placa encima de una placa de recogida para eluir los péptidos utilizando el aparato de presión positiva.Dibuje el flujo a través y configure las puntas y el material de laboratorio requeridos en el software, coteje con el diseño de la cubierta, y haga clic en Siguiente para continuar el protocolo para la dimetilación. Reconstituir los péptidos en 1%ácido acético. Para realizar el etiquetado de dimetilación, cargue 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de 60 formaldehídos de luz milimolar de la segunda fila de la placa de reactivo dos.Dispérselo para remar una de la placa de muestra y, a continuación, descargar las puntas. Cargue una fila de 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de formaldehído pesado de 60 mililitros de la fila tres de la placa de reactivo dos. Dispárelo en la fila dos de la placa de muestra y descargue las puntas.Cargue dos hileras de 90 puntas de microlitro y aspire 16 microlitros de 24 cianoboroticidas de sodio milimolar y 24 cianoborodo uterino de sodio mililitro de las filas uno y dos de la placa de reactivo tres, luego dispense los reactivos a las filas uno y dos de la muestra de la placa para iniciar la reacción de dimetilación. Descargue las puntas y utilice el agitador orbital para realizar un batido cronometreado durante 15 minutos a 1800 RPM. A continuación, cargue dos filas de 90 puntas de microlitros y aspire 32 microlitros de 1% de amoníaco de las filas tres y cuatro de la placa de reactivo tres.Dispérselo en las filas uno y dos de la placa de muestra dos para detener la reacción. Combine volúmenes iguales de péptidos dimetilados ligeros y pesados en una nueva placa de pozo profundo de dos mililitros para desalar. Después de desalar los péptidos ligeros y pesados combinados, seque los péptidos y realice el etiquetado isobárico.Reconstituir los péptidos con 100 microlitros de 100 mililares trietilomonio bicarbonato en un agitador orbital. A continuación, utilice 90 puntas de microlitros para aspirar 25 microlitros de los péptidos dimetilados combinados y dispensarlos a la primera fila de la placa de procesamiento TMT. Cargue una fila de 90 puntas de microlitros y aspire 10 microlitros de TMT.Dispérse en la primera fila de la placa de procesamiento TMT, descargue las puntas y, a continuación, realice un batido cronometreado durante una hora a 1800 RPM. Aspirar ocho microlitros de hidroxiilamina de la fila dos de la placa TEAB y dispensarlo para remar una de las placas de procesamiento TMT. Después de un batido de 15 minutos a 1800 RPM, transfiera 30,5 microlitros de los péptidos etiquetados TMT a un tubo de 1,5 mililitros.A continuación, proceda con la adquisición y análisis de datos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Aquí se muestran datos representativos de la INFORMACIÓN de un péptido identificado en los 22 canales iónicos de reporteros de un experimento de etiquetado isotópico de precursor combinado de 22 Plex y un experimento de etiquetado isobárico. La secuencia del péptido corresponde a betaína-homocisteína S-metiltransferasa.Los iones de fragmento más intensos para los picos dimetilados ligeros y pesados se aislaron aún más para la fragmentación de MS3. Las intensidades de iones del reportero son directamente proporcionales a la abundancia de péptidos en la muestra. En general, este experimento combinado de etiquetado isotópico y etiquetado isobárico redujo los tiempos de procesamiento de la muestra y hizo posible visualizar la expresión de proteínas a través de múltiples canales o condiciones.La gráfica de caja de abundancia de registro 10 frente a intensidades totales de iones de reportero en todos los 22 canales muestra menor variabilidad entre pozos o entre muestras. La evaluación de la automatización total se realizó examinando el error en la abundancia de iones de reportero en cada proteína en las 22 muestras. El procesamiento de muestras con la plataforma robótica dio como resultado coeficientes de variación muy bajos.A lo largo de los péptidos 3098, el coeficiente medio de variación en la abundancia de iones de reportero fue de 12,36 y 15,03% para péptidos dimetilados ligeros y pesados, respectivamente. Al intentar este protocolo, es importante tener en cuenta que los niveles isotópicos e isobáricos se utilizan en un solo experimento. Por lo tanto, se debe realizar una planificación cuidadosa para designar cada muestra con las etiquetas destinadas a usarse en el experimento.Este método se puede integrar fácilmente en otros sistemas robóticos, y se puede aplicar a una variedad de tejidos, como tesatos de tejidos o células y otros biofluidos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Investigación

Química

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Altas medidas de precisión de zinc isotópicos aplicados a Ratón Órganos

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Caracterización, cuantificación y compuesto específico análisis isotópico de carbono Pirogenica utilizando benceno policarboxílicos (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automatizado de 90Sr separación y preconcentración en un sistema de laboratorio-en-válvula de nivel de Ppq

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine Metathesis de Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Efecto isotópico en el proceso de transferencia de doble protones de porficeno investigado por el método QM/MM mejorado

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Preparación de muestras en Mediciones de microbalance de cristal de cuarzo de adsorción de proteínas y mecánica de polímeros

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...