Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Författarna erkänner Vanderbilt University Start-up Fonder och NIH tilldelning (R01GM117191) till RASR.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

cPILOT är en förbättrad multiplexeringsstrategi som kan analysera upp till 24 prover i ett enda experiment. Multiplexeringskapaciteten beror på antalet tillgängliga isotopiska och isobaric taggning kombinationer. Införande av TMTpro7, som kan märka 16 prover i enstaka experiment, kan tänja på gränserna för cPILOT till 32-plex. cPILOT består av flera pipetting steg och kräver omfattande vård och användarkunskaper för att utföra provberedning. Även med en expertanvändare är manuella fel oundvikliga, vilket inbjuder till användning av robotplattformar för att bearbeta prover i cPILOT-strategin. Eftersom cPILOT utnyttjar pH-beroende märkning av peptiderna behöver pH-värdet bibehållas för ljuset och den tunga dimetylerade uppsättningen prover. Milt surt-grundläggande pH-värde kan resultera i dimetylering av både N-termini och lysinrester. En fördel med cPILOT är att det kräver bara hälften av de isobaric taggarna sedan peptid N-termini är upptagna med dimetylgrupperna. Detta ger ett större antal prover som ska märkas till halva kostnaden. Hantering av större provnummer kräver att reagensexponeringstiderna är liknande för det första och det sista provet i en sats. En pipettdispenser som kan rymma upp till 32 prover parallellt kan bäst uppnås med hjälp av anordningar för hantering av robotteknik flytande.
För att kunna bearbeta flera prover genom cPILOT ändrades det manuella arbetsflödet så att det införlivade automatiseringen. Den robotflytande hanterare som används i denna studie har två skida med 96-kanaliga och 8-kanaliga pipetting förmågor, med en gripare för att placera plattorna i de tillgängliga 28 däck platser. Vätskehanteraren är integrerad med en positiv tryckapparat, orbital shaker, och en anordning för att värma / kyla prover i 96 brunnsplattan. Den positiva tryckapparaten hjälper till att utföra buffertutbyten i SPE-plattorna under sanering, medan orbitalskakapparaten hjälper till att virvel/blanda proverna. Robotplattformen programmerades att aspirera och dosera buffertar och prover till 96-brunnsplattor, inkubera, virvelprover och överföringsplattor. Vätskor med olika viskositeter, såsom acetonitril och vatten, kräver specifika pipettering överväganden som också kan programmeras in i metoden.
CPILOT-arbetsflödet, med början från proteinkvantifiering av BCA till att märka peptiderna med isobaric-taggar (dvs. TMT), utfördes på vätskehanterarsystemet. Det kompletta protokollet skalades för att använda 96 djupa brunnsplattor som kan hålla 2 mL per brunn. Buffertarna utarbetades före början av experimentet och lades till 96 brunnsplattan så att parallell provbearbetning tilläts. I den föreliggande studien, 22 arbetsflöde replikat av mus lever homogenate lades till den djupa väl plattor och tas genom cPILOT protokollet. Slutligen, ett enda prov som består av 22-plex equimolar mus levern taggade peptider injicerades till masspektrometern. Reporterjonintensiteter som motsvarar peptidöverflöd i proverna visade att prover som bearbetas med vätskehanteraren har lägre CV än det manuella protokollet (data som inte visas). Robotplattformen förbättrade också i högdet reproducerbarheten av provbearbetning. Reproducerbarhet och robusthet är mycket viktiga faktorer samtidigt som man bearbetar stora antal prover. Pipetting fel kan leda till fullständig felaktig tolkning av data och här robotplattformen som låg inter-prov variation. Även med hjälp av robotplattformen för cPILOT minskade den tid som krävs för att förbereda prover. Till exempel, efter att ha utvecklat den automatiserade metoden, krävs det 2,5 h för att bearbeta 22 prover i jämförelse med 7,5 h för manuell cPILOT. Experiment pågår i vårt laboratorium för att ytterligare utvärdera jämförelser av de manuella och automatiserade cPILOT-arbetsflödena. Baserat på tidigare rapporter från vårt laboratorium, CV% s av protein reporter jonintensiteter i den manuella cPILOT var i genomsnitt 20% med vissa extremvärden överstiger detta värde12.
cPILOT är en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidnivå, som kan användas för alla provtyp såsom celler, vävnader och kroppsvätskor. cPILOT erbjuder förbättrad prov-multiplexering och med införlivandet av automatisering kan underlätta prov med hög genomströmning av multiplexering i proteomik. Denna genomströmning är nödvändig för att ytterligare främja sjukdom och biologisk förståelse och biomarkör upptäckt.

Masspektrometri (MS)-baserade proteomik är ett oumbärligt forskningsverktyg för att identifiera sjukdomsspecifika biomarkörer, förstå sjukdomsprogression, och skapa leads för terapeutisk utveckling. Detta kan uppnås från en rad sjukdomsrelaterade kliniska prover såsom blodserum/plasma, proximala vätskor, och vävnader1,2. Proteomics biomarkör upptäckt och validering har nyligen fått betydande övervägande på grund av kraften i prov multiplexering strategier3,4. Prov multiplexing är en teknik som möjliggör samtidig jämförelse och kvantifiering av två eller flera prov villkor inom en enda MS injektion5,6. Prov multiplexering uppnås genom barcoding peptider eller proteiner från flera prover med kemiska, enzymatiska eller metaboliska taggar och erhålla MS information från alla prover i en enda MS eller MS / MS experiment. Bland de tillgängliga isobaric taggar är isobaric taggning reagenser (iTRAQ), kommersiell tandem massa taggar (TMT), och i huset syntetiserade isobaric N,N-dimetyl leucin (DiLeu) reagenser med kapacitet upp till 16-plex7 och 21-plex8, respektive.
Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förbättrad prov multiplexing teknik. cPILOT kombinerar isotopisk märkning av peptid N-termini med ljus [−(CH3)2] och tung [−(13C2H3)2] isotoper vid lågt pH (∼2,5), som håller lysinresterna tillgängliga för efterföljande högt pH (8,5) isobaricmärkning med hjälp av TMT, DiLeu, eller iTRAQ-märkning3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategins dubbla märkningsschema avbildas i Supplemental Figure 1 med två prover med hjälp av en exempelpeptid. Noggrannheten och precisionen i den TMT baserade kvantifieringen på MS2-nivån kan äventyras på grund av förekomsten av förorenande samisolade och co-fragmenterade joner som benämns som störningseffekten15. Denna begränsning i felaktiga reporterjonsförhållanden kan övervinnas med hjälp av tribrid Orbitrap masspektrometrar. Till exempel kan interferenseffekten övervinnas genom att isolera en topp i ett dimetylerat par på MS1-nivå i masspektrometern, utsätta den lätta eller tunga toppen för MS2-fragmentering i den linjära jonfällan och sedan utsätta det mest intensiva MS2-fragmentet för HCD-MS3 för att erhålla kvantitativ information. För att öka chanserna att välja peptiderna utan lysinaminer som finns för att generera reporterjoner, kan ett selektivt MS3-förvärv baserat på y-1-fragmentet också användas och är ett tillvägagångssätt som kan resultera i en högre andel peptider som är kvantifierbara med cPILOT9. Kombinationen av lätta och tunga märkning ökar prov multiplexing kapacitet med en faktor 2x till som uppnås med enskilda isobaric taggar. Vi har nyligen använt cPILOT för att kombinera upp till 24 prover i ett enda experiment med DiLeu reagenser16. Dessutom cPILOT har använts för att studera oxidativa post-translationella modifieringar14 inklusive protein nitration17, andra globala proteomer9, och har visat applikationer över flera vävnadsprover i en Alzheimers sjukdom mus modell11.
Robust provberedning är ett kritiskt steg i ett cPILOT-experiment och kan vara tidskrävande, mödosamt och omfattande. Förstärkt provpleducering kräver omfattande pipettering och högkvalificerad laboratoriepersonal, och det finns flera faktorer som starkt kan påverka reproducerbarheten av experimentet. Till exempel är noggrann hantering av prover nödvändig för att säkerställa liknande reaktionstider för alla prover och för att upprätthålla lämpligt buffert pH för lätta och tunga dimetylerade prover. Vidare kan manuell beredning av tiotals till hundratals prover införa hög experimentell fel. Därför, för att minska prov beredning variabilitet, förbättra kvantitativ noggrannhet, och öka experimentella genomströmningen, vi utvecklat en automatiserad cPILOT arbetsflöde. Automatisering uppnås med hjälp av en enhet för hantering av robotteknikvätska som kan slutföra många aspekter av arbetsflödet (Bild 1). Provberedning från proteinkvantifiering till peptidmärkning utfördes på en automatiserad vätskehanterare. Den automatiserade vätskehanteraren är integrerad med en PPA (positive pressure apparatus) för buffertutbyten mellan SPE-plattorna (solid-phase extraction), orbital shaker och en uppvärmnings-/kylanordning. Robotplattformen innehåller 28 däcksplatser för att rymma tallrikar och buffertar. Det finns två pods med en gripare för att överföra plattorna inom däcksplatserna: ett 96-kanals fast volym pipetteringshuvud (5-1100 μL) och 8 kanals variabla volymsonder (1-1000 μL). Robotplattformen styrs med hjälp av en programvara. Användaren måste vara professionellt utbildad innan du använder den robotliknande vätskehanteraren. Den föreliggande studien fokuserar på att automatisera det manuella cPILOT-arbetsflödet, som kan vara arbetskrävande för bearbetning av mer än 12 prover i en enda sats. För att öka genomströmningen avcPILOT-inflygningen 11, överförde vi cPILOT-protokollet till en robotflytande hanterare för att bearbeta mer än 10 prover parallellt. Automatiseringen tillåter också liknande reaktioner för varje prov parallellt under olika steg av provberedningsprocessen, vilket krävde att mycket utbildade användare skulle uppnå under manuell cPILOT. Detta protokoll fokuserar på genomförandet av den automatiserade vätskehanteringsanordningen för att utföra cPILOT. Den föreliggande studien beskriver protokollet för att använda detta automatiserade system och visar dess prestanda med hjälp av en 22-plex "proof-of-concept" analys av muslever homogenates.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Vi har infört en hög genomströmning kvantitativa proteomik arbetsflöde, kombinerade föregångare isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) kan multiplexera upp till 22 eller 24 prover med tandem massa taggar eller isobaric N,N-dimetyl leucin isobaric taggar, respektive, i ett enda experiment. Detta förbättrade prov multiplexing avsevärt minskar massa spektrometri förvärv gånger och ökar nyttan av de dyra kommersiella isobaric reagenser. Den manuella processen för provhantering och pipetteringssteg i strategin kan dock vara arbetsintensiv, tidskrävande och införa provförlust och kvantitativt fel. Dessa begränsningar kan övervinnas genom införlivandet av automatisering. Här överförde vi det manuella cPILOT-protokollet till en automatiserad vätskehanteringsanordning som kan förbereda stora provnummer (dvs. 96 prover) parallellt. Sammantaget ökar automatiseringen genomförbarheten och reproducerbarheten av cPILOT och möjliggör bred användning av andra forskare med jämförbara automationsenheter.

Figur 2 visar representativa MS-data av en peptid som identifierats i alla 22 reporterjonkanaler från ett 22-plex cPILOT-experiment, inklusive arbetsflödesreplikat. Bild 2 (överst) avbildar ett dubbelt laddat topppar som åtskiljs med 4 Da m/z mellanrum som anger en enda dimetylgrupp som ingår i peptiden. De lätta och tunga dimetylerade toppparen isolerades och fragmenterades oberoende av varandra för att ge peptidens sekvens. Sekvensen av peptiden är G(dimetyl)AAELMQQK(TMT-11plex) och motsvarar proteinet Betaine-homocystein S-metyltransas. De mest intensiva fragmentjonerna för både de lätta och tunga dimetylerade topparna (visas inte) isolerades ytterligare för MS3-fragmentering och reporterjonerna (m/z 126-131) visas i figur 2 (nederst). Reporterjonintensiteterna står i direkt proportion till peptidöverflödet i provet. Peptidöverflödet av proverna innebär att robotplattformens pipettförmåga är ganska enhetlig över de 22 proverna. Sammantaget resulterade detta 22-plex cPILOT experiment i 1326 (1209-light/1181-tung) identifieringar proteiner till följd av 3098 (6137-light/5872-tung) peptider (Tabell 4). Figur 3 visar rutan tomt av log10 överflöd kontra totalt reporter jonintensiteter över alla de 22 kanaler som visar mindre inter-well/inter-sample variabilitet. Utvärdering av den totala automatiseringen gjordes genom att undersöka felet i reporterjonöverflöd över varje protein i de 22 proverna. Figur 4 visar att provbearbetning med robotplattformen resulterade i mycket låga CV-värden. Specifikt var över 3098 peptider identifierade den genomsnittliga CV i reporter jon överflöd 12,36 % och 15,03 % för lätta och tunga dimetylerade peptider, respektive. Bland dessa peptider 2032 av dessa peptider hade reporter jonsignal över minimitröskeln och ansågs kvantifierbara.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Bild 1. Experimentellt arbetsflöde för att bearbeta 22-prov parallellt med ett automatiserat cPILOT-protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Bild 2. Kvantifiering av peptider över 22 prover. Exempel MS (överst) och MS3 (botten) spektra av peptiden G(dimetyl)AAELMQQK(TMT-11plex) kvantifieras i 22-plex automatiserat cPILOT experiment för ljus dimetylerat (nederst till vänster) och tunga dimetylerade (nederst till höger) toppar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Bild 3. Box tomt av totala reporter jonintensiteter kontra log10 överflöd av 22 prover med proteome discoverer 2,3. DEN RAW-fil söktes två gånger för lätta och tunga peptider, proteiner ID separat med TMT som dynamisk modifiering, ljus (+28.031 Da) och tunga (+36.076 & +35.069 Da) dimetylation peptid ate N-termini som statisk modifiering. En kombinerad sökning med alla ovanstående ändringar gjordes med hjälp av Proteome Discover 2.3 för att få Log 10 Överflöd av peptidintensiteter över alla kanaler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Bild 4. Violin tomter av co-effektiv av variation av peptid överflöd från summed reporter jonintensiteter över kanalerna 126-131 m/z. Peptiden kvantifierades med ett genomsnittligt CV-värde på 12,36 och 15,03 för lätta (2373) och tunga (2533) kvantifierbara peptider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur 1. Illustration av cPILOTen med en enda peptid. Visar isotopiken märkning av två olika prover och isobaric märkning med TMT126, den resulterande blandningen injicerades till MS för LC-MS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Variabelt namn</td>
			<td>Värde</td>
			<td>Beskrivning</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Volym som ska användas för desaltsteg 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Volym som ska användas för desalt steg 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Volym som ska användas för desaltsteg 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DevMode</td>
			<td>Falska</td>
			<td>Falskt kommer att skära ner inkubationstiderna till 30sec- True kommer att följa inkubationstidsinställningen i protokollet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>Volym på DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filtrerasläp</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Platta som används för avsaltning</td>
		</tr>
<tr>
<td>FiltreraPlattaVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Volym för avsaltning</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAVattentvättar</td>
			<td>Falska</td>
			<td>Antal vattentvättar på SPE-plattan</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volym av iodoacetamid</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptidTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>Peptidens volym för TMT-märkning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryck</td>
			<td>100</td>
			<td>mbar tryck vid PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>Förändring av temperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Isobaric taggvolym som ska läggas till</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Volym för att späda prov före matsmältningen</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Volym av trypsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>AnvändPopTimer</td>
			<td>Sant</td>
			<td>True visar alternativen att applicera tryck på platta om det krävs</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Lista över variabler som används i automatiserat cPILOT-protokoll.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilKälla</td>
			<td>DilWell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolym</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>SampleVol</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Prover</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2. Volym av mus lever homogenat och 8 M urea.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>KällaWell</td>
			<td>KällaWell2</td>
			<td>Reporter Jon</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Volym</td>
			<td>SampleID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3. Totalt antal peptider, proteiner och peptidspektrala matchningar (PSM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Automatiserad cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ljus</td>
			<td>Tunga</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteiner</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptider</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PsM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4. Barcoding den isobaric taggar med lätta och tunga märkta prover.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förstärkt prov multiplexing strategi som är kapabel att öka antalet prover som kan analyseras samtidigt med tillgängliga isobaric taggar. Införlivandet av en robotplattform har kraftigt ökat experimentell genomströmning, reproducerbarhet och kvantitativ noggrannhet.

Automatiserat prov Multiplexing genom att använda Kombinerad Prekursor Isotopisk märkning och Isobaric Märkning (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Vårt automatiserade cPILOT-protokoll gör det lättare för forskare att analysera prover på ett högt genomströmningssätt. Detta är viktigt eftersom det gör att vi kan komma till biologisk information om sjukdomar eller olika förhållanden mycket snabbare. Den största fördelen med denna teknik är att den hjälper till att bearbeta flera prover parallellt, och därigenom minska antebara fel medan du använder prover med hög genomströmning.Vårt laboratorium är intressera i applikationer som har med åldrande och Alzheimers sjukdom att göra. Emellertid, denna teknik kan också användas för att studera någon sjukdom eller utmaning för där det finns biologiska vävnader inblandade. Börja med att slå på den positiva tryckapparaten, värme- och kylanordningen och vakuumpumparna.Anslut alla tillbehör med vätskehanteraren, som kommer att visa ett blått ljus när det är anslutet till datorn och redo att fungera. Aliquot 300 mikroliter av levern homogenate till en 500 mikroliter rör och placera den på en två milliliter djup brunn platta. Förvara provet vid fyra grader Celsius tills protokollet börjar.Öppna metoden i programvaran och placera de nödvändiga tipsen och labware i sina positioner. Dubbelkola sedan med den slutliga däckslayouten och klicka på Nästa för att fortsätta protokollet. Ladda 230 mikroliterspetsar och aspirera 90 mikroliter av åtta molarurea från reservoaren.Sedan dispensera den till rad en av de svarta två milliliter djup brunn plattan. Lossa spetsarna på TL1 och upprepa detta steg tills urea har lagts till alla brunnar. Efter att lägga denaturering buffert, använd 90 mikroliter tips för att överföra 10 mikroliter av mus lever homogenate till den djupa väl plattan.Lossa spetsarna, ladda sedan en rad med 90 mikroliterspetsar och aspirera tre mikroliter av DTT från reagensplatta ett. Dispensera DTT till rad ett och två av den djupa brunnsplattan. Täta provplattan med aluminiumfolie och inkubera den i 37 grader Celsius i 600 sekunder medan du roterar vid 300 RPM.Efter inkubationen, ladda en rad av 90 mikroliterspetsar, aspirera sex mikroliter av IAM från reagensplatta en på rad tre, och dosera den för att ro en av provplattan. Täta provplattan och inkubera den i fyra grader Celsius i 30 minuter medan du roterar vid 300 RPM på kylanordningen. Sedan unseal provet plattan och ladda en rad av 90 microliter tips.Aspirera fem mikroliter av cystin från reagensplåt en på rad två och dispensera den till raderna ett och två av provplattan. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubationen, utför en tidsenad skakning på 1800 RPM i 30 minuter.Tillsätt sedan 800 mikroliter på 20 millimol tris buffert med 10 millimolar kalciumklorid till varje brunn på provplattan för att späda ut ureakoncentrationen till två molar. Lägg till 20 mikroliter trypsin till den första raden i en 96 brunnsplatta och placera plattan på en angiven plats på däck. Efter att ha lagt trypsin till provplattan, försegla den och inkubera den i 15 timmar vid 37 grader Celsius och 600 RPM på värme- och kylanordningen.Stoppa matsmältningen genom att aspirera 150 mikroliter av 5%myrsyra från rad tre av myrsyraplattan och dispensera den till provplattan vid raderna ett och två. Fortsätt att desalta peptiderna. Använd 1070 mikroliter tips för att aspirera 600 mikroliter acetonitril.Sedan dispensera den i rad ett och två av den fasta fasen extraktion, eller SPE-plattan, för att aktivera C-18. Därefter laddar du det smälta provet på SPE-plattan i två pass. Ladda två rader med spetsar, aspirera 534 mikroliter av de rötade proverna och dosera dem till raderna ett och två av SPE-plattan.Applicera tryck på plattan och upprepa detta steg tills alla provexemplar är laddade. Rengör peptiderna genom att tvätta med vatten och späd peptiderna med 60 till 40 acetonitril i 0,1%myrsyra. Placera sedan plattan ovanpå en uppsamlingsplatta för att elera peptiderna med hjälp av den positiva tryckapparaten.Dra ner genomflödet och ställ in nödvändiga tips och labware i programvaran, crosscheck med däckslayouten och klicka på Nästa för att fortsätta protokollet för dimetylering. Rekonstruera peptiderna i 1%ättiksyra. För att utföra dimetylationsmärkning, ladda 90 mikroliterspetsar och aspirera 16 mikroliter på 60 millimolar ljusformyd från den andra reagensplattans andra rad.Dispensera den till ro en av provplattan, sedan lossa spetsarna. Ladda en rad med 90 mikroliterspetsar och aspirera 16 mikroliter på 60 millimolar tung formaldehyd från rad tre av reagensplåt två. Dispensera den rad två av provplattan och lossa spetsarna.Ladda två rader med 90 mikroliterspetsar och aspirera 16 mikroliter på 24 millimolarnatriumcyanoborohydrid och 24 millimolarnatriumcyanoborodeuterid från rad ett och två av reagensplåt tre, därefter dispensera reagenserna till raderna ett och två av provplattan för att starta dimetylationsreaktionen. Lossa spetsarna och använd orbital shaker för att utföra en tidsenlig skaka i 15 minuter vid 1800 RPM. Ladda sedan två rader med 90 mikroliterspetsar och aspirera 32 mikroliter med 1%ammoniak från raderna tre och fyra av reagensplåt tre.Fördela den i rad ett och två av provplatta två för att stoppa reaktionen. Kombinera lika stora volymer av lätta och tunga dimetylerade peptider i en ny två milliliter djup brunnsplatta för avsaltning. Efter desalting den kombinerade lätta och tunga peptider, torka ner peptiderna och utföra isobaric märkning.Rekonstituera peptiderna med 100 mikroliter av 100 millimoltrietylmoniumbikarbonatbuffert på en orbitalskak. Använd sedan 90 mikroliterspetsar för att aspirera 25 mikroliter av de kombinerade dimetylerade peptiderna och dosera dem till den första raden i TMT-bearbetningsplattan. Ladda en rad med 90 mikroliterspetsar och aspirera 10 mikroliter av TMT.Dispensera den i den första raden av TMT-bearbetningsplattan, lossa spetsarna och utför sedan en tidsad skakning i en timme vid 1800 RPM. Aspirera åtta mikroliter av hydroxylamin från rad två av TEAB-plattan och dispensera den till rad en av TMT-bearbetningsplattan. Efter en 15 minuters skakning vid 1800 RPM, överför 30,5 mikroliter av TMT-märkta peptider till ett 1,5 milliliter rör.Fortsätt sedan med datainsamling och analys enligt manuskriptriktningarna. Representativa MS-data av en peptid som identifierats i alla 22 reporterjonkanaler från en 22 Plex kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric taggning experiment visas här. Sekvensen av peptiden motsvarar betain-homocystein S-metyltransferas.De mest intensiva fragmentjonerna för både de lätta och tunga dimetylerade topparna isolerades ytterligare för MS3-fragmentering. Reporterjonintensiteterna står i direkt proportion till peptidöverflödet i provet. Sammantaget minskade denna kombinerade föregångare isotopisk märkning och isobaric taggning experiment provet bearbetning gånger och gjorde det möjligt att visualisera proteinuttrycket över flera kanaler eller villkor.Rutan tomt log 10 överflöd kontra totalt reporter jonintensiteter över alla 22 kanaler visar mindre inter-well eller inter-sample variabilitet. Utvärdering av den totala automatiseringen gjordes genom att undersöka felet i reporterjonöverflöd över varje protein i de 22 proverna. Provbearbetning med robotplattformen resulterade i mycket låga variationskoefficienter.Över de 3098 peptider, den genomsnittliga variationskoefficienten i reporter jon överflöd var 12.36 och 15.03%för lätta och tunga dimethyllated peptider respektive. När du försöker detta protokoll, Det är viktigt att tänka på att isotopiska och isobaric nivåer används i ett enda experiment. Därför måste noggrann planering utföras för att utse varje prov med de taggar som är avsedda att användas i experimentet.Denna metod kan lätt integreras i andra robotsystem, och den kan appliceras på en mängd olika vävnader, såsom vävnads- eller cellt lysater och andra biofluider.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitativa Proteomics Använda Reduktiv dimetylering för Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

High Precision Zink isotopmätningar Tillämpad Mus Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

En kvantitativ glycomics och Proteomics kombinerade reningsstrategi

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, kvantifiering och förening specifik isotopanalys av Pyrogen Carbon användning av bensen polykarboxylsyror (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Sätesriktad Spin Labeling och EPR Spektroskopiska studier av pentamer ligandreglerade jonkanaler

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptid och Protein kvantifiering med automatiserad Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automatiserad 90Sr Separation och uppkoncentrering i ett labb-på-ventil System på Ppq nivå

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Imine Metathesis av kiseldioxid-stödda katalysatorer med hjälp av metoden för Ytorganometallic kemi

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Isotopisk effekt i dubbel Protonöverföringsprocess av Porfycene undersökt genom förbättrad QM/MM-metod

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Provberedning i kvartskristall Microbalance mätningar av Proteinadsorption och Polymermekanik

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...