Name: automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Yazarlar RASR için Vanderbilt Üniversitesi Start-up Fonları ve NIH ödülü (R01GM117191) kabul.

<ol>
	<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool:+opportunities+and+potential+limitations.">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li><li>Qian, W. -. J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications.">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li><li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics.">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry.">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMTpro:+Design,+Synthesis,+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set.">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li><li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics.">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging.">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+(cPILOT).">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).</li><li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer's+Disease.">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics &amp; Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+N,N-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach.">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver.">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

cPILOT, tek bir deneyde en fazla 24 örneği analiz edebilen gelişmiş bir çoklama stratejisidir. Çoklama kapasitesi kullanılabilir izotopik ve izobarik etiketleme kombinasyonlarının sayısına bağlıdır. Tek bir deneyde 16 numuneyi etiketleme yeteneğine sahip olan TMTpro7'nintanıtımı, cPILOT'un sınırlarını 32-plex'e itebilir. cPILOT birden fazla pipetleme adımlarından oluşur ve numune hazırlama sı için kapsamlı bakım ve kullanıcı becerileri gerektirir. Uzman bir kullanıcıda bile, cPILOT stratejisinde örnekleri işlemek için robotik platformların kullanılmasını davet eden manuel hatalar kaçınılmazdır. cPILOT peptidlerin pH bağımlı etiketlemesini kullandığından, pH'nın hafif ve ağır dimetillenmiş numune ler için korunması gerekir. Hafif asidik-bazik pH hem N-termini hem de lizin artıklarının dimetilasyonuna neden olabilir. CPILOT bir avantajı peptit N-termini dimetil grupları ile işgal beri izobarik etiketlerin sadece yarısını gerektirir. Bu, daha fazla sayıda numunenin yarı maliyetle etiketlenmesine neden olur. Daha büyük örnek numaraların işlenmesi, reaktif maruziyet sürelerinin bir toplu işteki ilk ve son örnek için benzer olduğunu gerektirir. 32 numuneyi paralel olarak barındırabilen bir pipet dağıtıcısı, robotik sıvı taşıma cihazlarının kullanımı yla en iyi şekilde elde edilebilir.
CPILOT tarafından birden fazla numunenin işlenmesi için, manuel iş akışı otomasyonu da dahil etmek üzere değiştirildi. Bu çalışmada kullanılan robotik sıvı işleyici 96 kanallı ve 8 kanallı pipetleme yeteneklerine sahip iki bölmeye sahiptir ve plakaları mevcut 28 güverte konumuna yerleştirmek için bir kavrayıcıya sahiptir. Sıvı işleyici, pozitif basınç aparatı, orbital shaker ve 96 kuyu plakasındaki numuneleri ısıtmak/soğutmak için bir cihazla entegre edilmiştir. Pozitif basınç aparatı temizlik sırasında SPE plakalarında tampon değişiminin olmasına yardımcı olurken, orbital shaker numuneleri girdap/karıştırmaya yardımcı olur. Robotik platform, tampon ve numuneleri 96 kuyulu plakalara, kuluçkaya, girdap örneklerine ve transfer plakalarına aspire etmek ve dağıtmak için programlanmıştır. Asetonitril ve su gibi farklı viskozitelere sahip sıvılar, yönteme programlanabilecek özel pipetleme hususları gerektirir.
BCA tarafından protein niceleminden başlayarak peptidlerin isobarik etiketlerle (yani TMT) etiketlenmesine kadar cPILOT iş akışı sıvı işleyici sistemi üzerinde gerçekleştirildi. Protokolün tamamı, kuyu başına 2 mL tutabilen 96 derin kuyu plakası kullanılacak şekilde ölçeklendirildi. Arabellekler deney başlamadan önce hazırlandı ve paralel numune işleme izin vermek için 96 kuyu plakası eklendi. Bu çalışmada, fare karaciğerhomojenate 22 iş akışı kopyaları derin kuyu plakaları eklendi ve cPILOT protokolü ile alınmıştır. Son olarak, 22-plekse equimolar fare karaciğer etiketli peptidler oluşan tek bir örnek kütle spektrometre enjekte edildi. Örneklerdeki peptit bolluğuna karşılık gelen muhabir iyon yoğunlukları, sıvı işleyicisi ile işlenen numunelerin manuel protokolden daha düşük CV'lere sahip olduğunu göstermiştir(veriler gösterilmemiştir). Robotik platform aynı zamanda numune işlemenin tekrarlanabilirliğini de büyük ölçüde artırdı. Çok sayıda numune işlenirken tekrarlanabilirlik ve sağlamlık çok önemli faktörlerdir. Pipetleme hataları verilerin tamamen yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve burada robotik platform düşük örnekler arası varyasyon sağladı. Ayrıca cPILOT için robot platformu kullanarak örnekleri hazırlamak için gerekli süreyi azalttı. Örneğin, otomatik yöntemi geliştirdikten sonra, 22 numunenin manuel cPILOT için 7,5 saate kıyasla işlenmesi için 2,5 saat gereklidir. El kitabı ve otomatik cPILOT iş akışlarının karşılaştırmalarını daha fazla değerlendirmek için laboratuvarımızda deneyler devam ediyor. Laboratuvarımızdan gelen önceki raporlara göre, manuel cPILOT protein muhabiri iyon yoğunluklarının CV% ortalama% 20 bu değeri12aşan bazı aykırı idi.
cPILOT, peptid düzeyinde hücreler, dokular ve vücut sıvıları gibi herhangi bir örneklem türü için kullanılabilen kimyasal bir türeçleştirme stratejisidir. cPILOT gelişmiş numune çoklama sunar ve otomasyonun dahil edilmesiyle proteomik lerde yüksek iş hacmi örnek çoklamayı kolaylaştırabilir. Bu iş, hastalık ve biyolojik anlayış ve biyomarker keşfini ilerletmek için gereklidir.

Kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik, hastalığa özgü biyobelirteçlerin belirlenmesinde, hastalığın ilerlemesini anlamada ve terapötik gelişime yol açan vazgeçilmez bir araştırma aracıdır. Bu kan serumu/ plazma, proksimal sıvılar ve dokular1gibi hastalıkla ilgili klinik örnekler bir dizi elde edilebilir,2. Proteomics biyomarker bulma ve doğrulama son zamanlarda örnek çoklama stratejileri nin gücü nedeniyle önemli dikkate kazanmıştır3,4. Örnek çoklama, tek bir MS enjeksiyonu içinde iki veya daha fazla örnek koşulun eşzamanlı olarak karşılaştırılmasını ve nicelemesini sağlayan bir tekniktir5,6. Numune çoklama, kimyasal, enzimatik veya metabolik etiketlerle birden fazla numuneden peptid veya proteinlerin barkodlanması ve tek bir MS veya MS/MS deneyindeki tüm örneklerden MS bilgisi alınması yla elde edilir. Mevcut izobarik etiketler ibarbarik etiketleme reaktifleri (iTRAQ), ticari tandem kitle etiketleri (TMT) ve evde sentezlenmiş izobarik N, N-dimethyl lösin (DiLeu) reaktifleri 16-pleks7 ve 21-pleks8yetenekleri vardır.
Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) gelişmiş bir örnek çoklama teknolojisidir. cPILOT, peptit N-termininizin izotopik etiketlemesini hafif [−(CH3)2] ve ağır [−(13C2H)2] izotopları düşük pH'da ([2,5) birleştirir ve bu da lizin kalıntısını sonraki yüksek pH (8.5) izobarik etiketleme için TMT kullanarak kullanılabilir tutar, DiLeu veya iTRAQ etiketleme3,9,10,11,12,13,14. cPILOT stratejisinin çift etiketleme şeması, örnek bir peptid kullanılarak iki örnekle Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. MS2 düzeyinde TMT tabanlı nicelemenin doğruluğu ve hassasiyeti, girişim etkisi15olarak nitelendirilen birlikte izole edilmiş ve birlikte parçalanmış iyonların kontamine olması nedeniyle tehlikeye atılabilir. Yanlış muhabir iyon oranlarındaki bu sınırlama tribrid Orbitrap kütle spektrometreleri yardımıyla aşılabilir. Örneğin, kütle spektrometresinde MS1 düzeyinde ki dimetil bir çiftteki tepeyi izole ederek, ışık veya ağır tepeyi doğrusal iyon tuzağındaki MS2 parçalanmasına maruz bırakarak ve daha sonra nicel bilgi elde etmek için HCD-MS3 için en yoğun MS2 parçasını maruz bırakarak girişim etkisi aşılabilir. Muhabir iyonları üretmek için mevcut olan lizin aminleri olmadan peptidseçme şansını artırmak için, y-1 parçasına dayalı seçici bir MS3 kazanımı da kullanılabilir ve cPILOT9ile ölçülebilen peptidlerin daha yüksek bir yüzdesi ile sonuçlanabilecek bir yaklaşımdır. Hafif ve ağır etiketlemenin birleşimi, numune çoklama yeteneklerini tek tek isobarik etiketlerle elde edilene 2 kat daha fazla dır. Biz son zamanlarda DiLeu reaktifler16ile tek bir deneyde en fazla 24 örnek birleştirmek için cPILOT kullandık. Ayrıca cPILOT oksidatif post-translational değişiklikler14 protein niterat17dahil çalışmak için kullanılmıştır , diğer küresel proteomlar9, ve bir Alzheimer hastalığı fare modelinde birden fazla doku örnekleri arasında uygulamaları göstermiştir11.
Sağlam numune hazırlama, bir cPILOT deneyinde kritik bir adımdır ve zaman alıcı, zahmetli ve kapsamlı olabilir. Gelişmiş numune çoklama kapsamlı pipetleme ve yüksek vasıflı laboratuvar personeli gerektirir ve deneyin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde etkileyebilen çeşitli faktörler vardır. Örneğin, numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi, tüm numuneler için benzer reaksiyon sürelerini sağlamak ve hafif ve ağır dimetillenmiş numuneler için uygun tampon pH'ı korumak için gereklidir. Ayrıca, onlarca ila yüzlerce numunenin manuel olarak hazırlanması yüksek deneysel hataya neden olabilir. Bu nedenle, numune hazırlama değişkenliğini azaltmak, nicel doğruluğu artırmak ve deneysel iş akışını artırmak için otomatik bir cPILOT iş akışı geliştirdik. Otomasyon, iş akışının birçok yönünü tamamlayabilen robotik bir sıvı işleme cihazı kullanılarak sağlanır(Şekil 1). Protein niceleminden peptit etiketlemeye kadar numune hazırlama otomatik sıvı işleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Otomatik sıvı işleyici, katı faz lı ekstraksiyon (SPE) plakaları, orbital shaker ve ısıtma/soğutma cihazı arasındaki tampon değişimleri için pozitif basınç aygıtı (PPA) ile entegre edilmiştir. Robotik platform plakave tamponlar karşılamak için 28 güverte yerleri içerir. Güverte konumları içinde plakaları aktarmak için bir kavrayıcı ile iki pod vardır: 96 kanallı sabit hacimli pipetleme kafası (5-1100 μL) ve 8 kanal değişken hacim probları (1-1000 μL). Robotik platform bir yazılım kullanılarak kontrol edilir. Kullanıcının robotik sıvı işleyicisini kullanmadan önce profesyonel olarak eğitilmesi gerekir. Bu çalışma, 12'den fazla numunenin tek bir toplu iş halinde işlenmesi için emek yoğun olabilecek manuel cPILOT iş akışını otomatikleştirmek üzerinde odaklanmıştır. cPILOTyaklaşımı11'inişbzinin arttırılabilmesi için cPILOT protokolünü 10'dan fazla numuneyi paralel olarak işlemek üzere robotik bir sıvı işleyicisine aktardık. Otomasyon aynı zamanda her örnek için benzer reaksiyonlara, numune hazırlama sürecinin çeşitli adımları sırasında paralel olarak izin verir ve bu da yüksek eğitimli kullanıcıların manuel cPILOT sırasında bunu başarmasını gerektirir. Bu protokol, cPILOT'u gerçekleştirmek için otomatik sıvı taşıma cihazının uygulanmasına odaklanır. Bu çalışma, bu otomatik sistemi kullanma protokolünü açıklar ve fare karaciğerhomojenlerinin 22-pleksli "kavram kanıtı" analizi kullanılarak performansını göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1651px;" width="1651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">04-408-120</td>
			<td style="width:923px;">Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.65 &#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml black deep well plate</td>
			<td>Analytical Sales and Services, Inc.</td>
			<td>59623-23BKGC</td>
			<td>Any brand of black 96-well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 ml clear deep well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75870-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 500&#181;L plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>203942-100</td>
			<td>Reagent plate for adding buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek i7 hybrid</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td></td>
			<td>Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C18 packing material (2.5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge with plate rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>5437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dionex 3000 UHPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fusion Lumos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of pH buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand pH buffer 7 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a pH meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reservior plate 200ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204017-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Targa 20 mg SPE plates</td>
			<td>Nest Group, Inc.</td>
			<td>HNS S18V</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td>
			<td>Beckmann</td>
			<td>373661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated sample multiplexing by using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

Biz yüksek iş akışı kantitatif proteomik iş akışı tanıttı, kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) tandem kitle etiketleri veya izobarik N, N-dimetil lösin izobaric etiketleri ile 22 veya 24 örnekleri çoklama yeteneğine sahip, sırasıyla, tek bir deneyde. Bu gelişmiş örnek çoklama önemli ölçüde kütle spektrometresi edinim sürelerini azaltır ve pahalı ticari izobarik reaktiflerin yarar artar. Ancak, stratejide numune işleme ve pipetleme adımlarının manuel süreci emek yoğun, zaman alıcı olabilir ve örnek kaybı ve nicel hata yada. Bu sınırlamalar otomasyon un dahil edilmesiyle aşılabilir. Burada manuel cPILOT protokolünü, paralel olarak büyük örnek numaraları (yani 96 örnek) hazırlayabilen otomatik bir sıvı işleme cihazına aktardık. Genel olarak otomasyon, cPILOT'un fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini artırır ve karşılaştırılabilir otomasyon cihazlarıyla diğer araştırmacılar tarafından geniş kullanıma olanak tanır.

Şekil 2, iş akışı çoğaltmaları da dahil olmak üzere 22 plekslik bir cPILOT deneyinden 22 muhabir iyon kanalının tümlerinde tanımlanan bir peptidin temsili MS verilerini gösterir. Şekil 2 (üstte), peptidin içine dahil edilmiş tek bir dimetil grubu gösteren 4 Da m/z aralığıile ayrılmış iki kat yüklü bir tepe çiftini gösterir. Hafif ve ağır dimetillenmiş tepe çiftleri izole edildi ve peptit dizisini vermek için bağımsız olarak parçalandı. Peptitin dizilimi G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) olup Betain-homosistein S-metil transferaz proteinine karşılık gelir. Hem hafif hem de ağır dimetillenmiş zirveler için en yoğun parça iyonları(gösterilmemiştir)MS3 parçalanması için daha fazla izole edildi ve muhabir iyonları(m/z 126-131) Şekil 2'de (altta) gösterilmiştir. Muhabir iyon yoğunlukları doğrudan örnekteki peptit bolluğu ile orantılıdır. Örneklerin peptit bolluğu, robotik platformun borulama yeteneğinin 22 örnekte oldukça düzgün olduğunu gösterir. Genel olarak, bu 22-pleksk cPILOT deney 1326 sonuçlandı (1209-ışık/1181-ağır) 3098 kaynaklanan protein tanımlamaları (6137-Light/5872-ağır) peptidler(Tablo 4). Şekil 3, daha az ara/örneksel değişkenlik gösteren tüm 22 kanalda log10 bolluğuna karşı toplam muhabir iyon yoğunluklarının kutu çizimini gösterir. Toplam otomasyonun değerlendirilmesi, 22 numunede her proteinde muhabir iyon bolluğundaki hata inceleyerek yapılmıştır. Şekil 4, robotik platform ile numune işlemenin cv değerlerinin çok düşük olduğunu göstermektedir. Özellikle, 3098 peptidler arasında muhabir iyon bolluğunda ortalama CV tespit 12.36 % ve 15.03% hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler için, sırasıyla. Bu peptidler arasında 2032 minimum eşik üzerinde muhabir iyon sinyali vardı ve ölçülebilir kabul edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> Şekil 1. Otomatik bir cPILOT protokolüne paralel olarak 22 numuneyi işlemek için deneysel iş akışı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> Şekil 2. 22 örnekte peptidlerin sayısallaştırılması. Örnek MS (üst) ve MS3 (alt) peptid G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) ışık dimetilleştirilmiş (sol altta) ve ağır dimetil (sağ alt) zirveleri için 22-pleks otomatik cPILOT deneyölçülen spektrumları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> Şekil 3. Toplam muhabir iyon yoğunlukları karşı proteome discoverer 2.3 kullanarak 22 örnek log10 bolluk kutu arsa. RAW dosyası, hafif ve ağır peptidler, proteinler tmt ile ayrı ayrı dinamik modifikasyon, ışık (+28.031 Da) ve statik modifikasyon olarak peptid N-termini'de ağır (+36.076 & +35.069 Da) dimetilasyon için iki kez arandı. Tüm kanallarda peptid yoğunlukları Log 10 Bolluk elde etmek için Proteome Discover 2.3 kullanılarak tüm yukarıdaki değişiklikler ile kombine bir arama yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> Şekil 4. 126-131 m/zkanalları arasında özetlenen muhabir iyon yoğunluklarından peptit bolluğu varyasyonu co-verimli Keman arsalar . Peptit, hafif (2373) ve ağır (2533) ölçülebilir peptidler için ortalama 12,36 ve 15,03 CV değeri ile ölçüldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1. Tek bir peptid ile cPILOT İllüstrasyon. İki farklı numunenin izotopik etiketlemesini ve TMT126ile izobarik etiketlemeyi gösteren karışım LC-MS3için MS'ye enjekte edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Değişken Adı</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>Tuz dansı adımı 1 için kullanılacak hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>Tuzdan arındırma adımı 2 için kullanılacak hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>Tuz dansı adım 3 için kullanılacak hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>False</td>
			<td>Yanlış 30sec için kuluçka süreleri kesecek- True protokolde kuluçka zamanlaması takip edecektir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>DTT hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filtre Plakası</td>
			<td>Targa</td>
			<td>Tuzsuzlama için kullanılan plaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filtre PlakasıVol</td>
			<td>600</td>
			<td>Tuzsuzlama için hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>HAWaterWashes</td>
			<td>False</td>
			<td>SPE plakası üzerindeki su yıkar sayısı</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>İyodoacetamid hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>TMT etiketleme için peptit hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Basınç</td>
			<td>100</td>
			<td>PPA'da mbar basıncı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempoffset</td>
			<td>1</td>
			<td>Sıcaklık değişimi</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>Eklenecek isobaric etiket hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>Sindirimi önce numune seyreltmek için hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>TripsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>Tripsin hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>PopTimer'ı Kullanma</td>
			<td>True</td>
			<td>True gerekirse plakaya basınç uygulama seçeneklerini görüntüler</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Otomatik cPILOT protokolünde kullanılan değişkenlerin listesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>DilSource</td>
			<td>Dilwell</td>
			<td>Dest</td>
			<td>DestWell</td>
			<td>DilVolume</td>
			<td>StockSource</td>
			<td>Stockwell</td>
			<td>ÖrnekVol</td>
			<td>ÖrnekID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Örnekleri</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2. Fare karaciğer homojenate ve 8 M üre hacmi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Kaynak Kuyusu</td>
			<td>Kaynak Kaynak 2</td>
			<td>Muhabir Ion</td>
			<td>DestWell1</td>
			<td>DestWell2</td>
			<td>Birim</td>
			<td>ÖrnekID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127 N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128 N 128 N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129 N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130 N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131 N1</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11 E-</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. Toplam peptid, protein ve peptit spektral eşleşme (PsM) sayısı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Otomatik cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ışık</td>
			<td>Ağır</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protein</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptidler</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4. Isobarik etiketleri hafif ve ağır etiketli örneklerle kodlama.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Otomatik cPILOT protokolümüz, araştırmacıların numuneleri yüksek bir veri elde etme yoluyla analiz etmesini kolaylaştırır. Bu önemlidir, çünkü hastalıklar veya farklı koşullar hakkında biyolojik bilgilere çok daha hızlı ulaşabilmek için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, birden çok örneği paralel olarak işlemeye yardımcı olması ve böylece yüksek iş gücü örneklerini kullanırken işlem yapılabilir hataları azaltmasıdır.Laboratuvarımız yaşlanma ve Alzheimer hastalığı ile ilgili uygulamalarla ilgilenmektedir. Ancak, bu teknik aynı zamanda herhangi bir hastalık veya biyolojik dokular dahil olduğu için sorun çalışma için kullanılabilir. Pozitif basınç aparatı, ısıtma ve soğutma cihazı ve vakum pompaları açarak başlayın.Bilgisayara bağlanıp çalışmaya hazır olduğunda mavi ışık gösteren sıvı işleyiciyle tüm aksesuarları bağlayın. Aliquot 300 karaciğer mikrolitre 500 mikrolitrelik bir tüp içine homojen ve iki mililitre derin kuyu plaka üzerine yerleştirin. Protokolün başlangıcına kadar numuneyi dört santigrat derecede saklayın.Yazılımdaki yöntemi açın ve gerekli ipuçlarını ve laboratuvar yazılımlarını konumlarına yerleştirin. Ardından son güverte düzenini çapraz olarak denetleyin ve protokolü devam etmek için İleri'yi tıklatın. Yük 230 mikrolitre ipuçları ve rezervuar sekiz molar üre 90 mikrolitre aspire.Sonra siyah iki mililitre derin derin plaka bir satır için dağıtın. TL1'in uçlarını boşaltın ve üre tüm kuyulara eklenene kadar bu adımı tekrarlayın. Denatürasyon tamponu ekledikten sonra, derin kuyu plakahomogenate fare karaciğer10 mikrolitre aktarmak için 90 mikrolitre ipuçları kullanın.İpuçlarını boşaltın, ardından bir sıra 90 mikrolitre uç yükleyin ve bir reaktif plakasından üç mikrolitre DTT aspire edin. DTT'yi derin kuyu plakasının bir ve iki sıralarına dağıtın. Numune plakasını alüminyum folyo ile kapatın ve 300 RPM'de dönerken 37 santigrat derecede 600 saniye kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, 90 mikrolitrelik bir sıra yükleyin, altı mikrolitre IAM IAM'ı üçüncü satırdaki reaktif plakasından aspire edin ve örnek plakadan birine verin. Numune plakasını kapatın ve soğutma cihazında 300 RPM'de dönerken 30 dakika boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra numune plakasının mührünü kapatın ve 90 mikrolitrelik bir sıra yükleyin.İkinci satırdaki reaktif plakadan beş mikrolitre sistin alın ve örnek plakanın bir ve iki sıralarına dağıtın. Tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 30 dakika boyunca 1800 RPM zamanında sallayın.Sonra 2 0 000 mm tris tampon 800 mikrolitre ekleyin 10 milimolar kalsiyum klorür her kuyuya iki azı laksetmek için üre konsantrasyonu seyreltmek için örnek plaka üzerinde. 96 kuyu plakasının ilk satırına 20 mikrolitre tripsin ekleyin ve plakayı güvertede belirli bir yere yerleştirin. Numune plakasına tripsin ihraci ekledikten sonra, onu kapatın ve ısıtma ve soğutma cihazında 37 santigrat derecede 15 saat kuluçkaya yatırın ve 600 RPM'ye yerleştirin.Formik asit plakasının üçüncü sırasından 150 mikrolitre 5 formik asit azarlayarak ve birinci ve ikinci satırdaki numune plakasına dağıtarak sindirimi durdurun. Peptidleri tuzdan arındırmaya devam edin. Aspire 600 mikrolitre asetonitril için 1070 mikrolitre ipuçları kullanın.Daha sonra C-18'i etkinleştirmek için katı faz ekstraksiyonunun veya SPE plakasının bir ve iki sırahalinde dağıtın. Daha sonra, sindirilmiş numuneyi iki geçişte SPE plakasına yükleyin. İki sıra ipucu yükleyin, sindirilmiş numunelerin 534 mikrolitresini aspire edin ve bunları SPE plakasının bir ve ikisine dağıtın.Plakaya basınç uygulayın ve tüm numuneler yüklenene kadar bu adımı tekrarlayın. Su ile yıkayarak peptidleri temizleyin ve peptidleri %0,1 formik asitte 60-40 asetonitil ile seyreltin. Daha sonra pozitif basınç aparatı kullanarak peptidler elite bir toplama plaka üstüne plaka yerleştirin.Akış aşağı çizin ve yazılım gerekli ipuçları ve labware kurmak, güverte düzeni ile çapraz kontrol ve dimetilasyon için protokol devam etmek için İleri'yi tıklatın. Peptidleri %1 asetik asitle yeniden oluşturur. Dimetilasyon etiketleme yapmak için, 90 mikrolitre uçları yükleyin ve reaktif plaka iki ikinci satırından 60 milimolar ışık formaldehit 16 mikrolitre aspire.Örnek plakadan birini sıraya dizmek için dağıtın ve ardından uçları boşaltın. 90 mikrolitre uçları bir satır yük ve reaktif plaka iki satır üç 60 milimolar ağır formaldehit 16 mikrolitre aspire. Örnek plakanın iki sırasını dağıtın ve uçları boşaltın.Yük 90 mikrolitre ipuçları ve aspire 16 mikrolitre 24 milimolar sodyum cyanoborohyride ve 24 milimolar sodyum cyanoborodeuteride satır bir ve iki reaktif plaka üç, sonra dimelasyon reaksiyonu başlatmak için örnek plaka bir ve iki reaktifdağıtmak. Uçları boşaltın ve 1800 RPM'de 15 dakika boyunca zamanlanmış bir sarsıntı gerçekleştirmek için orbital shaker kullanın. Daha sonra 90 mikrolitre uçtan oluşan iki sıra yükleyin ve 3.Reaksiyonu durdurmak için bir ve iki örnek plaka iki satır içine dağıtın. Tuzsuzluk için yeni bir iki mililitre derin kuyu plaka hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler eşit hacimlerde birleştirin. Kombine hafif ve ağır peptidler desalting sonra, peptidler aşağı kuru ve isobarik etiketleme gerçekleştirin.Bir orbital shaker üzerinde 100 milimolar triethylonnium bikarbonat tampon 100 mikrolitre ile peptidler yeniden. Daha sonra 90 mikrolitre uçlarını kullanarak 25 mikrolitre kombine dimetilpeptid'i aspire edin ve Bunları TMT işleme plakasının ilk satırına dağıtın. Bir sıra 90 mikrolitre uç yükleyin ve 10 mikrolitre TMT aspire edin.TMT işleme plakasının ilk satırında dağıtın, ipuçlarını boşaltın ve 1800 RPM'de bir saat boyunca zamanlanmış bir sarsıntı gerçekleştirin. TEAB plakasının ikinci sırasından sekiz mikrolitre hidroksilin aspire edin ve TMT işleme plakasından birine koyun. 1800 RPM'de 15 dakikalık bir sarsıntıdan sonra, TMT etiketli peptidlerin 30,5 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Daha sonra el yazması talimatlara göre veri toplama ve analiz ile devam edin. 22 Plex kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme deneyinden 22 muhabir iyon kanalının tümlerinde tanımlanan bir peptidin temsili MS verileri burada gösterilmiştir. Peptit dizilimi betain-homosistein S-metiltransferaz'a karşılık gelir.Hem hafif hem de ağır dimetillenmiş zirveler için en yoğun parça iyonları MS3 parçalanması için daha da izole edildi. Muhabir iyon yoğunlukları doğrudan örnekteki peptit bolluğu ile orantılıdır. Genel olarak, bu kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme deneyi numune işleme sürelerini kısaltarak protein ekspresyonunu birden fazla kanal veya koşulda görselleştirmeyi mümkün kılarak mümkün kalmıştır.Tüm 22 kanal boyunca toplam muhabir iyon yoğunlukları karşı günlük 10 bolluk kutu arsa daha az inter-well veya inter-sample değişkenlik gösterir. Toplam otomasyonun değerlendirilmesi, 22 numunede her proteinde muhabir iyon bolluğundaki hata inceleyerek yapılmıştır. Robotik platform ile örnek işleme varyasyon çok düşük katsayıları sonuçlandı.3098 peptidler arasında, muhabir iyon bolluğundaki ortalama değişim katsayısı hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler için sırasıyla %12.36 ve %15.03 idi. Bu protokol denerken, izotopik ve izobarik düzeylerin tek bir deneyde kullanıldığını göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu nedenle, denemede kullanılmak üzere tasarlanmış etiketleri ile her örnek belirlemek için dikkatli planlama yapılması gerekir.Bu yöntem diğer robotik sistemlere kolayca entegre edilebilir ve doku veya hücre likatları ve diğer biyoakışkanlar gibi çeşitli dokulara uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Fare Organlar Uygulanan Yüksek Hassasiyetli Çinko İzotopik Ölçümler

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterizasyon, benzen polikarboksilik asitler kullanılarak Pirojenik karbon miktarının ve Bileşik özgü izotopik Analizi (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Automated 90Sr Separation and Preconcentration in a Lab-on-Valve System at Ppq Level

Otomatik 90Sr ayrılık ve Preconcentration bir laboratuvar Vana sistemde Ppq düzeyinde

A quick, automated and portable system for the separation and determination of radiostrontium in aqueous samples, using Sr-resin and multi sequential flow ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

Yüzey Organometalik Kimya metodolojisini kullanan Silika Destekli Katalizörler tarafından Imine Metatez

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

Isotopic Effect in Double Proton Transfer Process of Porphycene Investigated by Enhanced QM/MM Method

Gelişmiş QM/MM yöntemi ile Incelenerek Porphycene çift proton transfer sürecinde izotopik etkisi

The single deuterium substitution in porphycene leads to an asymmetric molecular geometry, which may affect the double proton transfer process in the ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Protein Adsorpsiyon ve Polimer Mekaniğinin Kuvars Kristal Mikroterazi Ölçümlerinde Örnek Hazırlama

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...