Name: dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions at JoVE.com

Мы благодарим Моргана Псеницку за редактирование и обсуждение рукописи и доктора Грэма Кидда за помощь в форматировании рисунков. Эта работа была поддержана NIAID K22 AI125466 (JLW).

<ol>
	<li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Biology+in+Learning+and+Cognition.">Glial Biology in Learning and Cognition.</a> The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Nuriya, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+astrocytes+in+neurovascular+communication.">Involvement of astrocytes in neurovascular communication.</a> Progress in Brain Research. 225, 41-62 (2016).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).</li><li>Kierdorf, K., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+steady+state.">Microglia in steady state.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3201-3209 (2017).</li><li>Hertz, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+astrocytes+for+potassium+ion+(K(+))+homeostasis+in+brain+and+glial+effects+of+K(+)+and+its+transporters+on+learning.">Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning.</a> Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).</li><li>Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Blood+Flow+by+Astrocytes:+A+Role+for+Tissue+Oxygen+and+Other+Metabolic+Factors.">Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).</li><li>Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Astrocytes+in+the+Neurogenic+Niches.">Role of Astrocytes in the Neurogenic Niches.</a> Methods Mol Biol. 1938, 19-33 (2019).</li><li>Sharif, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier:+A+review+of+its+anatomy+and+physiology+in+health+and+disease.">Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease.</a> Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).</li><li>von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Cells+and+Integrity+of+the+Nervous+System.">Glial Cells and Integrity of the Nervous System.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+development+and+heterogeneity.">Astrocyte development and heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020362 (2015).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+and+stage-dependent+regulation+of+Olig+gene+expression+and+oligodendrogenesis+by+Nkx6.1+homeodomain+transcription+factor.">Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor.</a> Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Witting, A., Moller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+cell+culture:+a+primer+for+the+novice.">Microglia cell culture: a primer for the novice.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).</li><li>Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CXCR7/ACKR3+as+a+therapeutic+strategy+to+promote+remyelination+in+the+adult+central+nervous+system.">Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+progenitors+reversibly+exit+the+cell+cycle+and+give+rise+to+astrocytes+in+response+to+interferon-gamma.">Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma.</a> Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).</li><li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer's+disease.">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+in+vitro+Methods+to+Study+Microglia.">An Overview of in vitro Methods to Study Microglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).</li><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia:+much+more+than+the+neuron's+side-kick.">Glia: much more than the neuron's side-kick.</a> Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).</li><li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+biology+in+learning+and+cognition.">Glial biology in learning and cognition.</a> Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+primary+roles+of+glial+cells+in+the+mechanisms+of+psychiatric+disorders.">Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).</li><li>Hartenstein, V., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nervous+and+the+immune+systems+in+evolution.">Connecting the nervous and the immune systems in evolution.</a> Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).</li><li>Emsley, J. G., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+heterogeneity+closely+reflects+the+neuronal-defined+anatomy+of+the+adult+murine+CNS.">Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS.</a> Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).</li><li>Chaboub, L. S., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Origins+of+Astrocyte+Heterogeneity:+The+Final+Frontier+of+CNS+Development.">Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development.</a> Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Bottcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Marques, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+heterogeneity+in+the+mouse+juvenile+and+adult+central+nervous+system.">Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system.</a> Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).</li></ol>

У авторов есть конфликт интересов для раскрытия.

В этом протоколе мы описываем выделение трех основных субпопуляций глиальных клеток из ЦНС мыши: микроглии, OPC и астроцитов. Основным препятствием для исследования нейродегенеративных и нейровоспалительных заболеваний ЦНС является отсутствие первичных клеток и тканей человека, особенно тех, которые являются региональными и от одного и того же пациента. В большинстве случаев клеточные линии ЦНС человека получены из трансформированных, увековеченных раковых клеток, которые могут не быть точными представлениями об их нормальном физиологическом поведении 20,21,22. Таким образом, альтернативные методы необходимы для контролируемого изучения фенотипов клеток ЦНС. Кроме того, разнообразие неврологических популяций глиальных клеток делает необходимым исследовать каждый подтип как независимо друг от друга, так и в условиях кокультуры, чтобы повторить как их клеточные автономные, так и неавтономные функции. Глиальные клетки имеют широкий спектр критических функций в ЦНС, начиная от нейронной поддержки23, обучения / познания 24,25 и иммунологических ответов ЦНС26. Таким образом, необходимо понимать молекулярные и клеточные функции каждой глиальной субпопуляции в физиологическом и патологическом контексте. Для этого мы предоставляем здесь надежный метод экстракции и выделения жизнеспособных подтипов глии. Из-за практических и этических ограничений в исследованиях человека, животные модели в настоящее время являются наиболее актуальными суррогатами биологии глиальных клеток человека. В частности, мыши являются идеальными модельными животными, поскольку их геномом можно манипулировать и анализировать для дальнейшего анализа определенных молекулярных механизмов, лежащих в основе здоровья и болезней. Таким образом, успешное удаление и разделение мышиной микроглии, OPC и астроцитов является ключевым инструментом для исследования функций глии во время физиологических, нейродегенеративных или нейровоспалительных состояний.
Этот протокол может быть оптимизирован для изучения региональной гетерогенности клеток ЦНС. Становится все более очевидным, что глия проявляет региональную неоднородность по форме и функциям. Астроциты регионально разнообразны и демонстрируют различную морфологию в зависимости от их расположения в ЦНС27. Кроме того, плотность астроцитов и их митотический индекс могут определять анатомические области, поддерживая гипотезу о том, что региональная гетерогенность астроцитов может отражать молекулярные и функциональные различия, основанные на их расположении в ЦНС28. Микроглиальная региональная гетерогенность также активно исследуется, хотя основные механизмы и функциональные последствия разнообразия микроглии в развитии или поведении ЦНС в настоящее время неясны. Однако известно, что взрослые микроглии демонстрируют разнообразие в клеточном количестве, клеточных и субклеточных структурах и молекулярных сигнатурах29. Кроме того, последние достижения в мультиплексированной массовой цитометрии дополнительно определили региональную гетерогенность микроглии, проанализировав клеточный фенотип из пяти различных областей ЦНС девяти доноров человека, что позволило провести крупномасштабное иммунофенотипирование микроглии человека30. В настоящее время такие подходы находятся в зачаточной стадии, что делает исследования на животных жизнеспособным решением для изучения регионарной глии в развитии заболеваний ЦНС. Наконец, региональная гетерогенность также недавно была описана в олигодендроцитах. Секвенирование одноклеточной РНК на 5072 отдельных клетках из 10 областей ювенильной и взрослой ЦНС выявило 13 различных субпопуляций на разных стадиях дифференцировки31. Важно отметить, что также было обнаружено, что по мере созревания олигодендроцитов из OPC их транскрипционные профили расходились, а их функциональные фенотипы изменялись, подчеркивая гетерогенность олигодендроцитов в ЦНС31.
Таким образом, понимание региональной гетерогенности различных резидентных клеток ЦНС в контексте их разнообразных соседних нейронов и других глий может обеспечить важное обоснование для будущей разработки новых методов лечения нейровоспалительных и нейродегенеративных расстройств. Хотя этот протокол фокусируется на извлечении, изоляции и идентификации глиальных субпопуляций, он обеспечивает удобную отправную точку для изучения их функции. Кроме того, он может быть адаптирован и объединен с трансгенными моделями мышей для изучения генетических механизмов, связанных с биологией глиальных клеток. Он также может быть использован для изучения реакций глиальных клеток друг на друга в анализах совместной культуры. Описанные этапы представляют собой экономически эффективный и высокопроизводительный метод извлечения и выделения различных глиальных популяций ЦНС, который затем может быть адаптирован к широкому спектру экспериментальных параметров. Следует отметить, что; однако, что метод, описанный здесь, использует новорожденных из-за более низких уровней миелинизации и высокой плотности размножающейся глии. По этим причинам технически более целесообразно изолировать жизнеспособную глию от новорожденных по сравнению со взрослыми животными. Таким образом, фенотипические различия в неонатальной глии по сравнению со взрослой глией должны учитываться при экспериментальном проектировании и интерпретации данных.

Глии необходимы для правильной функции нейронов в ЦНС. Они состоят из трех основных субпопуляций: астроцитов, олигодендроцитов и микроглий, каждая из которых играет свою, но незаменимую роль1. Без надлежащего разнообразия и активности глиальных клеток функция нейронов будет серьезно затронута, что приведет к нарушению ЦНС. Глия способна влиять на нейротрансмиссию, и каждый тип клеток делает это по-своему. Глиальные клетки в мозге обладают способностью общаться между собой, а также с нейронными клетками, чтобы облегчить правильную функцию ЦНС2. Олигодендроциты увеличивают скорость электрической передачи за счет формирования миелиновой оболочки, что облегчает кластеризацию ионных каналов в узлах Ранвье, местах генерации потенциала нейронного действия3. Микроглия имеет решающее значение для обрезки синапсов путем мониторинга синаптической передачи и «перенастройки» нейронных связей после травмы4. Кроме того, микроглии являются наиболее распространенной резидентной иммунной клеткой ЦНС, выступающей в качестве основной формы защиты хозяина от патогенов5. Астроциты могут регулировать синаптическую передачу между нейронами, изменяя концентрацию внеклеточного калия6. Они также играют роль в контроле местного кровотока7, высвобождении и поглощении нейромодулирующих элементов8 и играют ключевую роль в поддержании гематоэнцефалического барьера9. Таким образом, каждый глиальный подтип имеет решающее значение для функции ЦНС, так как дефекты любого типа уже давно связаны с широким спектром патологических состояний, включая психические заболевания, эпилепсию и нейродегенеративные состояния10.
Наибольшим препятствием в изучении патобиологии ЦНС является невозможность исследовать клетки человека в контексте их микроокружательной ниши. Биопсийная ткань человека в основном собирается посмертно, и клетки могут быть легко повреждены или потеряны во время экстракции и обработки. Кроме того, трудно поддерживать человеческие клетки живыми и жизнеспособными in vitro в течение любого периода времени, не получая увековеченных клеточных линий из опухолей, и в этот момент они больше не точно отражают свои нормальные физиологические свойства11,12. Кроме того, существует значительное количество региональной гетерогенности среди отдельных типов клеток глии 13,14,15, и получение региональных образцов ЦНС от отдельных пациентов практически невозможно. Таким образом, необходимо разработать альтернативные модели для изучения вклада регионарной глии в конкретные расстройства ЦНС.
Здесь мы описываем систему in vitro с использованием специфической для области ЦНС мыши изоляции нескольких глиальных субпопуляций, позволяющей манипулировать и количественно оценивать микроглию, клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC), которые дают начало зрелым олигодендроцитам и астроцитам. Каждая популяция может быть независимо выделена и подвергнута широкому спектру экспериментальных методов, включая медикаментозное или молекулярное лечение, иммуноцитохимию, экстракцию и анализ белка / РНК и другие системы кокультуры в зависимости от экспериментальной необходимости. Кроме того, этот метод изоляции дает большое количество клеток, что позволяет характеризовать и исследовать каждую глиальную популяцию с высокой пропускной способностью. Это также позволяет изучать дифференцировку, рост и пролиферацию клеток ЦНС в ответ на широкий спектр микроокружающих стимулов контролируемым образом, чтобы избежать смешивания факторов, которые обычно присутствуют в условиях in vivo. Наконец, этот метод изоляции клеток облегчает манипулирование популяциями глиальных клеток в разных областях ЦНС, чтобы исследовать, как региональная глия взаимодействует друг с другом и реагирует на различные стимулы, обеспечивая точность и воспроизводимость.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Представленные здесь методы демонстрируют лабораторные процедуры рассечения четырех различных областей центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных мышей для выделения глиальных субпопуляций. Целью процедуры является диссоциация микроглии, клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) и астроцитов из кортикальной, мозжечковой, ствола мозга и спинного мозга для облегчения дальнейшего анализа in vitro. Процедуры изоляции области ЦНС позволяют определить региональную гетерогенность между глиями в системах множественных клеточных культур. Выполняется быстрая изоляция области ЦНС с последующим механическим удалением мозговых оболочек для предотвращения заражения менингеальных клеток глии. Этот протокол сочетает в себе мягкую диссоциацию тканей и покрытие на определенной матрице, предназначенной для сохранения целостности и приверженности клеток. Выделение смешанной глии из нескольких областей ЦНС обеспечивает всесторонний анализ потенциально гетерогенной глии при максимальном использовании отдельных экспериментальных животных. Кроме того, после диссоциации региональной ткани смешанная глия дополнительно разделяется на несколько типов клеток, включая микроглию, OPC и астроциты для использования в одном типе клеток, вставках пластин клеточных культур или системах кокультуры. В целом, продемонстрированные методы обеспечивают комплексный протокол широкого применения для тщательного рассечения четырех отдельных областей ЦНС у новорожденных мышей и включают методы выделения трех отдельных типов клеток глии для изучения региональной гетерогенности в любом количестве систем или анализов клеточных культур in vitro.

Репрезентативные данные, показанные ниже, иллюстрируют, что передача сигналов IFNγ влияет на дифференциацию и созревание OPC. Без присутствия рецептора IFNγ (IFNγR) корковые OPC не дифференцируются в зрелые миелинизирующие олигодендроциты так же легко, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания MBP (рисунок 1). Поскольку олигодендроциты и астроциты получены от общего прародителя, мы проанализировали экспрессию GFAP, которая маркирует астроциты. Мы обнаружили, что IFNγR-дефицитные клетки сильно экспрессируют GFAP, предполагая, что они могут принимать астроцитарный фенотип, подтверждая более ранние сообщения19.
Дополнительные доказательства региональной гетерогенности в клетках ЦНС подтверждаются различной морфологией астроцитов, наблюдаемой в астроцитах коры, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга (рисунок 2). Следует отметить, что астроциты из той же области могут также проявлять морфологическую гетерогенность, подтверждая представление о том, что этот глиальный подтип очень динамичен. Различия в клеточной архитектуре наводят на мысль о функциональном разнообразии, и, таким образом, способность изолировать глиальные популяции необходима для изучения фенотипических реакций при отсутствии и наличии микроокружных стимулов.
Олигодендроциты имеют решающее значение для миелинизации нейронных аксонов и необходимы для правильного восстановления и функционирования ЦНС. OPC порождают своих зрелых коллег, что делает критически важным понимание биологии, стоящей за их способностью дифференцироваться. Передача сигналов цитокинов значительно влияет на поведение стволовых и иммунных клеток. Таким образом, важно понять, как региональные реакции ОПК могут варьироваться на дифференциальную стимуляцию цитокинов (рисунок 3), что может повлиять на их способность дифференцироваться в зрелые миелинизирующие олигодендроциты.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативные данные, показывающие дифференциацию OPC у мышей WT и IFNγR-/- в присутствии экзогенного IFNγ. Кортикальные OPC были выделены из (A) WT и (B) IFNγR-/- P4 мышиных детенышей в соответствии с процедурой, описанной выше. Клетки обрабатывали 1 нг/мл IFNγ в течение 48 ч, затем фиксировали и окрашивали для очерчивания дифференцировки клеток. OPC были помечены для NG2 и GFAP для идентификации тех, кто принимал астроцитарный фенотип. Аналогичным образом, OPC также были помечены для NG2 и MBP для идентификации тех, которые дифференцировались в зрелые олигодендроциты. Шкала = 20 мкМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные данные, демонстрирующие региональную гетерогенность в морфологии астроцитов. Астроциты из коры, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга были выделены из щенков мыши P4 с использованием протокола, описанного выше, и помечены для GFAP (зеленый) иммуноцитохимией после 48 ч в культуре. Шкала = 20 мкМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные данные, демонстрирующие дифференциальные реакции региональных OPC на цитокины. OPC были выделены из ствола мозга и спинного мозга щенков мыши P4 с использованием протокола, описанного выше. Клетки обрабатывали повышенными концентрациями (1-10 нг/мл) (А) ИФНγ или (В) интерлейкина (IL)-17 с целью исследования дифференциального влияния цитокина на способность региональных ОПК дифференцироваться в миелинирующие олигодендроциты. После 48-часовой инкубации с указанными цитокинами OPC были зафиксированы и помечены для NG2 (зеленый) и MBP (красный). Шкала = 20 мкМ. Представление данных означает ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 2-полосным ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Раствор антибиотика (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1,0 мл</td>
			<td colspan="2">100X антибиотик / антимикотический, содержащий 10 000 единиц / мл пенициллина и 10 000 мг / мл стрептомицина</td>
		</tr><tr><td>25 мг/мл</td>
			<td colspan="2">Амфотерицин B</td>
		</tr><tr><td>99 мл</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Смешанная Глия Медиа (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 мл</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (высокий уровень глюкозы, с L-глютамином, с пируватом Na)</td>
		</tr><tr><td>10 мл</td>
			<td colspan="2">Термоинактивированный FBS</td>
		</tr><tr><td>1,0 мл</td>
			<td colspan="2">L-глютамин (100X)</td>
		</tr><tr><td>1,0 мл</td>
			<td colspan="2">Антибиотик/Антимикотический</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPC Медиа (50 мл)</td>
		</tr><tr><td>49 мл</td>
			<td colspan="2">Нейробазальные среды</td>
		</tr><tr><td>1,0 мл</td>
			<td colspan="2">Добавка B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 нг/мл</td>
			<td colspan="2">ППГФ-АА</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ПРИМЕЧАНИЕ: PDGF-AA добавляется свежим перед каждым изменением носителя.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Среда астроцитов (1 л)</td>
		</tr><tr><td>764 мл</td>
			<td colspan="2">MEM с солями Эрла, содержащими глютамин</td>
		</tr><tr><td>36 мл</td>
			<td colspan="2">Глюкоза (используйте запас 100 мг/мл для окончательного концентрирования 20 мМ)</td>
		</tr><tr><td>100 мл</td>
			<td colspan="2">Термоинактивированный FBS</td>
		</tr><tr><td>100 мл</td>
			<td colspan="2">Термоинактивированная конская сыворотка</td>
		</tr><tr><td>10 мл</td>
			<td colspan="2">Глютамин (используйте запас 200 мМ, если он не включен в стоковую среду)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">ДОПОЛНИТЕЛЬНО: 10 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста мыши</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная фильтрация всех сред и хранение при температуре 4°C до использования.</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Буферные и мультимедийные рецепты.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions at JoVE.com

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Здесь мы представляем протокол выделения in vitro множественных популяций глиальных клеток из ЦНС мыши. Этот метод позволяет проводить сегрегацию регионарной микроглии, клеток-предшественников олигодендроцитов и астроцитов для изучения фенотипов каждого из них в различных культуральных системах.

Рассечение и выделение мышиной глии из нескольких областей центральной нервной системы

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Системное и местное доставки лекарств для лечения заболеваний центральной нервной системы у грызунов Модели

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Травма Paradigm по расследованию центральной нервной системы в ремонт<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Прямая Внутрижелудочковая поставке лекарственных препаратов грызунов центральной нервной системы

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

В естественных условиях допроса центральной нервной системы Translatome по Polyribosome фракционирования

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...