Name: digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

وكان دعم JAL من قبل منحة المعاهد القومية للصحة K08EY030923; تم دعم CMC بمنحة K01 (5K01AR060169) من المعهد الوطني للتشاتيم القومي للأمراض العضلية والعظام ومنحة أبحاث جديدة (637405) من تحالف أبحاث الذئبة.

وقد وافقت على جميع الإجراءات من قبل جامعة نورث وسترن لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها. تم إيواء الفئران C57BL/6 في منشأة حاجز في مركز الطب المقارن في جامعة نورث وسترن (شيكاغو، إلينوي). تم إيواء جميع الحيوانات في دورة 12/12 ساعة خفيفة / داكنة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.
<p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization.">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).</li><li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis.">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636 (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li><li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization.">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li><li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization.">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li><li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+CD11b++Monocytes+and+Anti&#8211;Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy.">Association of CD11b +Monocytes and Anti&#8211;Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li><li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل الكمي لأنواع الخلايا المتعددة في الأنسجة المعقدة. في هذا التقرير، نحن وصف الكشف عن تدفق الخلايا من السكان البلعميات أحادية النواة، بما في ذلك أحادية الخلايا، والخلايا التشعبية، ومجاميع الضامة، بعد إصابة الليزر في عين الماوس. Liyanage وآخرون ذكرت مؤخرا ا?...

يتضمن الجهاز المناعي الفطري أنواع خلايا متعددة تحفز التنشيط والالتهاب. وتشمل الخلايا المناعية الفطرية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الصاري ، والبصلات ، واليوزنوفيليات ، والعدلات ، والبلعات أحادية النوى. وقد تورطت في الفعات أحادية النوى، والتي تتكون من أحادية الخلايا، الضامة، والخلايا التشعبية، في الفيزيولوجيا المرضية من حالات العيون متعددة بما في ذلك التهاب القزحية، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)1. في هذا البروتوكول، وسوف نركز على تحديد البلعات أحادية النواة باستخدام تحليل cytometric تدفق متعددة المعلمة في نموذج الماوس من أيه أمد neovascular2. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع نماذج الماوس من اعتلال الشبكية السكري و / أو التهاب القزحية ، ولكن من المستحسن تشريح العين أكثر شمولا بسبب الطبيعة الجهازية لهذه الأمراض.
تعبر البالعات أحادية النوى عن علامات سطح الخلية المتداخلة. خلايا الضامة المقيمة الأنسجة طويلة الأمد وmicroglia تنشأ من صفار ساك المستمدة من السلف 3 erythromyeloid3، في حين إعادة تدوير الضامة والخلايا التشعبة التمييز من النخاع العظمي التكخير الخلايا التكهنة4. علامات سطح الخلية الماوس المشتركة monocytes، الضامة، وخلايا التشعب تشمل CD45، CD11b5،F4/806،Cx3cr17،وعلامة Iba18داخل الخلية. من أجل التغلب على هذا التحدي ، تحليل النسخ من الضامة ، monocytes ، والخلايا التشعب من أنسجة متعددة يعرف CD64 باعتبارها علامة سطح الخلية الضامة الخاصة6. وقد وصفت الضامة في القزحية، المشيمية، الجسم الهدّاج، والعصب البصري في عيون صحية3. وبدلاً من ذلك، فإن تحديد هوية الخلية التشعبية أكثر صعوبة؛ الأسلوب الأكثر تحديدا لتحديد الخلية dendritic يتطلب رسم خرائط مصير باستخدام Zbtb46-GFP مراسل الماوس9. مستقلة عن هذا الخط مراسل، والتعبير عن CD11c وMHCII بالتزامن مع عدم وجود CD64 يمكن تحديد الخلايا التشجر المحتملة6،10. وقد تم تحديد الخلايا التشعبية في القرنية، الملتحمة، القزحية، والمشيمية في عيون طبيعية11. Microglia هي الضامة المتخصصة الموجودة في شبكية العين، محمية من قبل حاجز الدم الشبكية، ومستمدة من صفار كيس الخلايا السلف12. ونتيجة لذلك، يمكن تمييز ميكروجليا الشبكية من الضامة المشتقة من أحادية الخلايا من خلال مستوياتها الخافتة من التعبير CD4513 ومستويات عالية من Tmem119، والذي يتوفر كآلية مضادة مضادة للتدفق14. على microglia التنشيط ، ومع ذلك ، يمكن أن يكون CD45 حتى المنظمة15 و Tmem119 قد تكون أسفل المنظمة3، مما يدل على تعقيد البيولوجيا microglia وهذا من المرجح أن تكون ذات الصلة في كل من AMD ونموذج الماوس. وأخيراً، يمكن تقسيم أحاديات إلى نوعين فرعيين على الأقل، بما في ذلك الكلاسيكية وغير الكلاسيكية. الكلاسيكية monocytes عرض CCR2+Ly6CعاليةCX3CR1 التعبيرالمنخفض، وغير الكلاسيكية monocytes شرح CCR2-Ly6CمنخفضةCX3CR1 علاماتعالية 5.
نظرا لضرورة التحليل الكمي للتعبير علامة، أي، مستويات عالية مقابل منخفضة / خافتة، multi-parameter تدفق قياس الخلايا هو الطريقة المثلى للتمييز بين monocytes، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في العين والأنسجة الأخرى. وتشمل المزايا الإضافية تحديد مجموعات فرعية، والقدرة على استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لفرز مجموعات الخلايا لتحليل النسخ أو البروتيوم، ورسم خرائط المصير. العيب الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا عن طريق تشريح العيون في مختلف subcompartmentments العين: القرنية، الملتحمة، قزحية العين، العدسة، شبكية العين، ومجمع المشيمية Sclera. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تصوير المناعة الواعنية، ولكن محدود بعدد العلامات وعدم وجود كمية قوية.
وقد ربطت دراسات الرابطة واسعة الجينوم الجينات تكمل متعددة مع AMD16. تنشيط مكمل يؤدي إلى إنتاج الحساسية, تجنيد الكريات البيض, والتهاب الناتجة. في مستقبلات مكملة ناقص الفئران، إصابة الليزر يقلل من أحادية النوى الفيتويتي تجنيد وneovascularization المشيمية التي يسببها الليزر (CNV) منطقة17. وبالمثل، فإن C-C chemokine مستقبلات 2 (CCR2) ماوس بالضربة القاضية، والذي هو نقص في التوظيف أحادية إلى الأنسجة، ويوضح كلا من تجنيد البليغسيت أحادية النواة وأشعة الليزر التي يسببها CNV المنطقة18. هذه البيانات وصلة تكملة ومونية البلعومات مع CNV التجريبية وربما NEOVASCULAR AMD. دعما لهذا الارتباط، و dysregulated مستقبلات تكملة على monocytes الدم الطرفية في المرضى الذين يعانون من أيه ام دي neovascular19،20. وتبين هذه البيانات وجود ارتباط قوي بين AMD والبلعات أحادية النوى.
في هذه المخطوطة، سوف نستخدم نموذج CNV المستحث بالليزر التجريبي لتوصيف مجموعات البلعومات أحادية النوى في عين الماوس باستخدام عملية تدفق التدفقات متعددة المعالم. بالليزر التي يسببها CNV هو نموذج الماوس القياسية من أيه امد neovascular، والتي أظهرت فعالية العلاج الحالي الخط الأول NEOVASCULAR21. هذا البروتوكول سوف يصف enucleation من عيون الماوس، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ الأجسام المضادة، وتحديد الفولتية الليزر باستخدام ضوابط لون واحد، واستراتيجية الغاء باستخدام الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) الضوابط. للحصول على وصف مفصل لنموذج CNV الذي يسببه الليزر، يرجى الاطلاع على منشور سابق22. باستخدام هذا البروتوكول، سوف نحدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الخلايا التكجرية، والسّكان الضامة. وعلاوة على ذلك، سوف نستخدم MHCII و CD11c لمزيد من تحديد مجموعات فرعية الضامة داخل نموذج CNV الليزر التي يسببها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

يلعب الجهاز المناعي الفطري أدوارًا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية العينية بما في ذلك التهاب القزحي واعتلال الشبكية السكري والتنكس البقعي المرتبط بالعمر. الخلايا المناعية الفطرية، على وجه التحديد البلعات أحادية النوى، تعبر عن علامات سطح الخلايا المتداخلة، مما يجعل تحديد هذه التجمعات السكانية تحدياً. متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل المتزامن، الكمي لعلامات سطح الخلية متعددة من أجل التفريق أحادية، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في عيون الماوس. يصف هذا البروتوكول enucleation عيون الماوس كله، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ تعليق خلية واحدة لعلامات الخلية النخاعية. بالإضافة إلى ذلك، نحن شرح الطرق المناسبة لتحديد الفولتية باستخدام ضوابط لون واحد ولضبط البوابات الإيجابية باستخدام الفلوريسنس ناقص ضوابط واحدة. القيد الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا القيد من خلال متعدد المعلمة تدفق قياس الخلايا من مقصورات العين الفردية أو لطخة المناعة المجانية. ومع ذلك، فإن الفلوروس المناعي محدود بسبب افتقاره إلى التحليل الكمي والعدد المخفض من الفلوروفورات على معظم المجاهر. نحن نصف استخدام المناظير الخلوية التدفق متعدد الحساسية لتوفير تحليل كمي للغاية من البلعات أحادية النوى في neovascularization المشيمية التي يسببها الليزر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياس تدفق متعدد المعلمة لتحديد مجموعات فرعية للغة الضامة، ورسم خرائط للمصير، وفرز الخلايا للدراسات النسخية أو البروتيومية.

أظهر الشكل 1 مدرجات التكرار غير المُؤسَّر لـ SCCs والخلايا بالليزر الأحمر: Alexa647 و Alexa700 و APC-Cy7. في الشكل 1A، يصور الخط الأرجواني ذروة SCC ل Alexa647 ، في حين أظهر الخط السماوي الفرق المقصود 0.5 Log. لاحظ أن الذروة في Alexa700 و APC-Cy7 كانت إلى اليسار (أقل إشراقا) من الخط السماوي. ل...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

يوفر هذا البروتوكول طريقة لهضم العينين بالكامل في تعليق خلية واحدة لغرض تحليل cytometric تدفق متعدد المعلمة من أجل تحديد مجموعات ب والدمغة أحادية النواة العينية المحددة، بما في ذلك أحادية الخلايا، microglia، الضامة، والخلايا المتجّنة.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...