Name: digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

A JAL foi apoiada pela concessão do NIH K08EY030923; A CMC foi apoiada por uma bolsa K01 (5K01AR060169) do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos do NIH e uma Nova Bolsa de Pesquisa (637405) da Lupus Research Alliance.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os camundongos C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira no Centro de Medicina Comparada da Universidade northwestern (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em ciclo claro/escuro de 12/12 h com livre acesso a alimentos e água.
1. Coleta de tecido ocular
<ol><li>Sacrificar ratos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade de ambos os sexos usando administra...

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. 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M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa de múltiplos tipos de células em um tecido complexo. Neste relatório, descrevemos a detecção citométrica de fluxo de populações de fagocitos mononucleares, incluindo monócitos, células dendríticas e subconjuntos de macrófagos, após lesão a laser no olho do rato. Liyanage et al relataram recentemente uma estratégia semelhante de gating para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, DCs, macrófagos, macrófagos infiltrados ...

O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)1. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular2. Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.
Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea4. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b5, F4/806,Cx3cr17e o marcador intracelular Iba18. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago6. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis3. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP9. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais11. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema12. Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD4513 e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo14. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado15 e O Tmem119 pode ser regulado3, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2+Ly6Caltabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2-Ly6CbaixoCX3CR1marcadores altos 5.
Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.
Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD16. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)17. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser18. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.
Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual21. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior22. Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

O sistema imunológico inato desempenha papéis importantes na fisiopatologia ocular, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. As células imunes inatas, especificamente os faócitos mononucleares, expressam marcadores de superfície celular sobrepostos, o que torna a identificação dessas populações um desafio. A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa simultânea de marcadores de superfície de múltiplas células, a fim de diferenciar monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas nos olhos do rato. Este protocolo descreve a enucleação de olhos inteiros do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular e coloração da suspensão de célula única para marcadores de células mielóides. Além disso, explicamos os métodos adequados para determinar tensões usando controles de cor única e para delinear portões positivos usando fluorescência menos um controles. A maior limitação da citometria de fluxo de vários parâmetros é a ausência de arquitetura tecidual. Essa limitação pode ser superada pela citometria de fluxo de vários parâmetros de compartimentos oculares individuais ou coloração de imunofluorescência complementar. No entanto, a imunofluorescência é limitada pela sua falta de análise quantitativa e pelo número reduzido de fluoroforos na maioria dos microscópios. Descrevemos o uso de citometria de fluxo multiparamétrico para fornecer análises altamente quantitativas de fagocitos mononucleares na neovascularização choroidal induzida por laser. Além disso, a citometria de fluxo de vários parâmetros pode ser usada para a identificação de subconjuntos de macrófagos, mapeamento de destinos e classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos.

A Figura 1 mostrou histogramas de frequência não compensados para os SCCs e células para o laser vermelho: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Na Figura 1A,a linha magenta retratou o pico do CCS para Alexa647, enquanto a linha ciano mostrou a diferença de log pretendida de 0,5. Observe que o pico em Alexa700 e APC-Cy7 foi à esquerda (menos brilhante) da linha ciano. Note também que as células estavam todas à esquerda da linha magenta. As células à direita do...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Imunologia e Infecção

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...