Name: digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

JAL была поддержана грантом NIH K08EY030923; CMC была поддержана грантом K01 (5K01AR060169) от Национального института артрита и болезней опорно-двигательного мозга и новым исследовательским грантом (637405) от Исследовательского альянса волчанки.

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета. C57BL/6 мышей были группы размещены на барьер объекта в Центре сравнительной медицины в Северо-Западном университете (Чикаго, Иллинойс). Все животные были размещены в 12/12 ч свет / темный ?...

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization.">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).</li><li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis.">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636 (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li><li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization.">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li><li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization.">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li><li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+CD11b++Monocytes+and+Anti&#8211;Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy.">Association of CD11b +Monocytes and Anti&#8211;Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li><li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Цитометрия многотехатрийного потока позволяет количественно провести количественный анализ нескольких типов клеток в сложной ткани. В этом докладе мы описываем цитометрическое обнаружение потока моноядерных популяций фагоцитов, включая моноциты, дендритные клетки и подмножества м...

Врожденная иммунная система включает в себя несколько типов клеток, которые стимулируют активацию дополнения и воспаление. Врожденные иммунные клетки включают естественные клетки убийцы (НК), тучные клетки, базофилы, эозинофилы, нейтрофилов и моноядерные фагоциты. Моноядерные фагоциты, которые состоят из моноцитов, макрофагов и дендритных клеток, были вовлечены в патофизиологию множественных офтальмологических состояний, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию (AMD)1. В этом протоколе мы сосредоточимся на выявлении моноядерных фагоцитов с использованием многотеатрического цитометрического анализа потока в мышиной модели неоваскулярной AMD2. Этот протокол адаптируется для мышиных моделей диабетической ретинопатии и/или увеита, но более обширное рассечение глаз рекомендуется из-за системного характера этих заболеваний.
Моноядерные фагоциты выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток. Долгосрочные ткани резидентов макрофагов и микроглии происходят из желточного мешка полученных эритромиелоидныхпрародителя 3, в то время как переработка макрофагов и дендритных клеток отличаются от костного мозга полученных макрофагов дендритных клетокпрародителя 4. Маркеры поверхности клеток мыши, общие для моноцитов, макрофагов и дендритных клеток включают CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, и внутриклеточный маркер Iba18. Для того, чтобы преодолеть эту проблему, транскриптомный анализ макрофагов, моноцитов и дендритных клеток из нескольких тканей определяет CD64 как макрофаг-специфический маркер поверхностиклеток 6. Макрофаги были описаны в радужной оболочке глаза, хороид, цилиарного тела, и зрительного нерва в здоровыхглазах 3. Кроме того, дендритная идентификация клеток является более сложной; наиболее специфический метод дендритной идентификации клеток требует картирования судьбы с помощью мыши репортера9. Независимо от этой линии репортера, выражение CD11c и MHCII в сочетании с отсутствием CD64 может определить потенциальные дендритныеклетки 6,10. Дендритные клетки были выявлены в роговицы, конъюнктивы, радужной оболочки глаза, и хороид в нормальныхглазах 11. Микроглии являются специализированными макрофагами, расположенными в сетчатке, защищенными гемово-сетчаткой барьером и полученными из клеток-предшественников желточногомешка 12. В результате, микроглии сетчатки могут быть дифференцированы от моноцитов полученных макрофагов их тусклый уровень экспрессии CD4513 и высокие уровни Tmem119, который доступен в качестве потока цитометрииантитела 14. После активации микроглии, однако, CD45 может быть до регулируемых15 и Tmem119 может быть внизрегулируется 3, демонстрируя сложность биологии микроглии, и это, вероятно, имеет отношение как в AMD и его мыши модели. Наконец, моноциты можно разделить по крайней мере на два подтипа, включая классический и неклассический. Классические моноциты отображаютCCR2 и Ly6C высокой CX3CR1 низкой экспрессии, и неклассических моноцитов продемонстрировать CCR2-Ly6CнизкийCX3CR1высокие маркеры 5.
В связи с необходимостью количественного анализа экспрессии маркеров, т.е. высоких и низких/димовых уровней, цитометрия многотеатрийного потока является идеальным методом для дискриминации моноцитов, макрофагов, микроглий и дендритных клеток в глазу и других тканях. Дополнительные преимущества включают идентификацию суб популяций, возможность использования флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для сортировки популяций клеток для транскриптомного или протеомного анализа, а также картирование судьбы. Основным недостатком цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это можно преодолеть путем офтальмологического вскрытия в различные глазные подкомпартии: роговицу, конъюнктиву, радужную оболочку, хрусталик, сетчатку и хороидно-склерический комплекс. Кроме того, может быть выполнена подтверждаемая иммунофлуоресценция, но ограниченная количеством маркеров и отсутствием надежной количественной оценки.
Геном широкий ассоциации исследования связаны несколько генов дополнения с AMD16. Активация дополнения приводит к выработке анафилактоксина, набору лейкоцитов и, как следствие, воспалению. В дополнение к рецептору недостаточно мышей, лазерная травма уменьшает моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированных хороидной неоваскуляризации (CNV)области 17. Аналогичным образом, C-C мотив хемокин рецептор 2 (CCR2) нокаут мыши, которая не хватает моноцитов набора в ткани, демонстрирует как снижение моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированной области CNV18. Эти данные связывают дополнение и моноядерные фагоциты с экспериментальным CNV и, возможно, неоваскулярной AMD. В поддержку этой ассоциации, дополнение рецепторов дисрегулируются на периферических моноцитов крови у пациентов с неоваскулярной AMD19,20. Эти данные свидетельствуют о сильной связи между AMD и моноядерными фагоцитами.
В этой рукописи мы будем использовать экспериментальную лазерную индуцированную модель CNV для характеристики моноядерных популяций фагоцитов в мышином глазу с использованием цитометрии многотактного потока. Лазерно-индуцированной CNV является стандартной моделью мыши неоваскулярной AMD, которая продемонстрировала эффективность текущей первой линии неоваскулярной терапии AMD21. Этот протокол будет описывать энуклеацию глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску, окрашивание антител, определение лазерных напряжений с использованием одного цветового контроля и стратегию фиксации с использованием флуоресценции минус один (FMO) управления. Для подробного описания лазерной индуцированной модели CNV, пожалуйста, смотрите предыдущую публикацию22. Используя этот протокол, мы определим микроглии, моноциты, дендритные клетки и популяции макрофагов. Кроме того, мы будем использовать MHCII и CD11c для дальнейшего определения подмножего макрофагов в лазерной индуцированной модели CNV.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Врожденная иммунная система играет важную роль в глазной патофизиологии, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию. Врожденные иммунные клетки, в частности моноядерные фагоциты, выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток, что делает идентификацию этих популяций сложной задачей. Цитометрия многотехатрийного потока позволяет проводить одновременный количественный анализ нескольких маркеров поверхности клеток, чтобы дифференцировать моноциты, макрофаги, микроглии и дендритные клетки в глазах мыши. Этот протокол описывает энуклеацию целых глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску и окрашивание одноклеточной суспензии для маркеров миелоидных клеток. Кроме того, мы объясняем правильные методы определения напряжения с помощью одного цветового управления и для разграничения положительных ворот с помощью флуоресценции минус один элемент управления. Основным ограничением цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это ограничение может быть преодолено с помощью мульти-параметра потока цитометрии отдельных глазных отсеков или бесплатного окрашивания иммунофлуоресценции. Тем не менее, иммунофлуоресценция ограничена отсутствием количественного анализа и сокращением количества флюорофоров на большинстве микроскопов. Мы описываем использование цитометрической цитометрии многопланетного потока для обеспечения высококоличего анализа моноядерных фагоцитов при лазерной хороидной неоваскуляризации. Кроме того, цитометрия многотравматического потока может быть использована для идентификации подмножества макрофагов, картирования судьбы и сортировки клеток для транскриптомических или протеомных исследований.

На рисунке 1 показаны некомпенсированные гистограммы частоты для SCC и клетки для красного лазера: Alexa647, Alexa700 и APC-Cy7. На рисунке 1A,пурпурная линия изображала пик SCC для Alexa647, в то время как циановая линия показала предназначенную разницу в 0,5 журнала. Обратит...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов

Этот протокол предоставляет метод переваривания цельных глаз в одноклеточную суспензию с целью многотехатрического цитометрического анализа потока с целью выявления специфических глазных моноядерных фагоцитных популяций, включая моноциты, микроглии, макрофаги и дендритные клетки.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...