Name: a pipeline using bilateral in utero electroporation to interrogate genetic influences on rodent behavior
Uploaded: 2020-05-21T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior at JoVE.com

Ringraziamo Lisa Kretsge per il feedback critico e la modifica del manoscritto. Ringraziamo tutti gli assistenti di ricerca del laboratorio Cruz-Martín che sono stati preziosi nell'aiutare con le perfusioni e il conteggio cellulare dei cervelli comportamentali. Ringraziamo Andrzej Cwetsch per l'input nella progettazione dell'elettrodo tripolare, e Todd Blute e il Boston University Biology Imaging Core per l'uso del microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da un NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), dal Brenton R. Lutz Award (ALC), dall'I. Alden Macchi Award (ALC), dal NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) e dal Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati condotti secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca sugli animali e sono stati approvati dal Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione della soluzione di DNA
<ol><li>Acquista un plasmide commerciale o un subclone un gene di interesse nel plasmide con il promotore desiderato. Qui è stato utilizzato un plasmide contenente EGFP sotto il promotore CAG (pCAG-EGFP). NOTA: ...

<ol>
	<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+association+and+meta-analysis+of+a+schizophrenia+GWAS+variant+rs10489202+in+East+Asian+populations.">Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations.</a> Translational Psychiatry. 8 (1), 144 (2018).</li><li>Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+insights+from+108+schizophrenia-associated+genetic+loci.">Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci.</a> Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).</li><li>Howard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+meta-analysis+of+depression+identifies+102+independent+variants+and+highlights+the+importance+of+the+prefrontal+brain+regions.">Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).</li><li>Grove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+common+genetic+risk+variants+for+autism+spectrum+disorder.">Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder.</a> Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).</li><li>Comer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+schizophrenia-associated+gene+C4+leads+to+hypoconnectivity+of+prefrontal+cortex+and+reduced+social+interaction.">Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction.</a> PLoS Biology. 18 (1), 3000604 (2020).</li><li>Chini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+and+Rescuing+Developmental+Miswiring+in+a+Mouse+Model+of+Cognitive+Impairment.">Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment.</a> Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).</li><li>Clifton, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+genes+associated+with+schizophrenia+and+bipolar+disorder+across+development.">Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development.</a> Translational Psychiatry. 9 (1), 74 (2019).</li><li>Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+dysfunction+of+prefrontal-hippocampal+networks+in+mouse+models+of+mental+illness.">Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness.</a> European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).</li><li>Batista-Brito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Dysfunction+of+VIP+Interneurons+Impairs+Cortical+Circuits.">Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits.</a> Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Dissection+of+Neural+Circuits:+A+Decade+of+Progress.">Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress.</a> Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).</li><li>DeNardo, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+strategies+to+access+activated+neurons.">Genetic strategies to access activated neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Circuit+Tracing+with+Glycoprotein-Deleted+Rabies+Viruses.">Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses.</a> Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).</li><li>Cruz-Mart&#237;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dedicated+circuit+links+direction-selective+retinal+ganglion+cells+to+the+primary+visual+cortex.">A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex.</a> Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Cruz-Mart&#237;n, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+genome+editing+through+CRISPR-Cas9+engineering.">Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering.</a> Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).</li><li>Strecker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+DNA+insertion+with+CRISPR-associated+transposases.">RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases.</a> Science. 365 (6448), 48-53 (2019).</li><li>Cruz-Mart&#237;n, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+the+elongation+of+early+dendritic+protrusions+via+mGluRs+in+wild+type+mice,+but+not+in+fragile+X+mice.">Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice.</a> PLoS One. 7 (2), 32446 (2012).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).</li><li>Szczurkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+vivo+genetic+manipulation+of+the+mouse+or+rat+brain+by+in+utero+electroporation+with+a+triple-electrode+probe.">Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe.</a> Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Mathis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeepLabCut:+markerless+pose+estimation+of+user-defined+body+parts+with+deep+learning.">DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning.</a> Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).</li><li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transportable,+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation.">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+30+new+susceptibility+loci+for+schizophrenia.">Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).</li><li>Ripke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+13+new+risk+loci+for+schizophrenia.">Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons.">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Soma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+mouse+amygdala+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).</li></ol>

Qui viene descritta una pipeline che combina la manipolazione di nuovi geni di interesse in grandi popolazioni di neuroni corticali frontali con saggi comportamentali nei topi. Inoltre, questa pipeline consente lo studio longitudinale del comportamento negli stessi topi sia durante lo sviluppo postnatale precoce che in età adulta. Questa tecnica ignora la necessità di fare affidamento su modelli genetici di animali che possono essere costosi in termini di tempo e spese. Il punto di forza di questo protocollo è che pu?...

Studi di associazione a livello genomico (GWAS) hanno guidato la scoperta di nuovi geni candidati associati a patologiecerebrali 1,2,3,4. Questi studi sono stati particolarmente utili nella comprensione di devastanti disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia (SCZ), dove l'indagine di nuovi geni è servita come punto di partenza per nuove linee di ricerca e intervento terapeutico5,6. I geni che ospitano il rischio per la SCZ mostrano un'espressione distorta nella corteccia prefrontale (PFC) durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce, una regione implicata nella patologia di diversi disturbi neuropsichiatrici7. Inoltre, i modelli di topo dei disturbi psichiatrici mostrano attività anomala nellereti PFC 6,8,9. Questi risultati suggeriscono che i geni associati alla SZC potrebbero svolgere un ruolo nel cablaggio dello sviluppo di questa regione. Ulteriori indagini utilizzando modelli animali sono necessarie per comprendere il contributo di questi geni candidati alla creazione di connessioni nel PFC e per determinare se questi geni hanno un ruolo causale nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici. Le tecniche di manipolazione genetica nei topi che consentono lo studio dei cambiamenti di espressione genica su specifici circuiti neuronali durante lo sviluppo postnatale prenatale e precoce sono un metodo promettente per comprendere i meccanismi molecolari che collegano i cambiamenti di espressione genica alla disfunzione PFC.
Le linee genetiche del topo offrono un metodo per studiare l'impatto di particolari geni sullo sviluppo e sulla funzione cerebrale. Tuttavia, affidarsi a topi transgenici può essere limitante poiché non ci sono sempre linee disponibili in commercio per esaminare gli effetti di specifici geni sullo sviluppo di circuiti neurali. Inoltre, può essere estremamente costoso e dispendioso in termini di tempo sviluppare linee di mouse personalizzate. L'uso di strategie di manipolazione genetica intersezionale che combinano topi transgenici con approcci virali harivoluzionato la comprensione del cervello 10,11,12. Nonostante molti progressi, le strategie virali hanno alcune limitazioni a seconda del tipo di vettore virale, inclusi limiti nella capacità di confezionamento che possono limitarel'espressione virale 13 e la tossicità cellulare associata all'espressionevirale 14. Inoltre, nella maggior parte delle condizioni sperimentali, l'espressione genica robusta che utilizza virus adeno-associato (AAV) richiede circa 2-4 settimane15, rendendo le strategie virali di routine irrealizzabili per manipolare i geni durante lo sviluppo postnatale precoce.
In utero l'elettroporazione (IUE) è un approccio alternativo che consente un rapido ed economico trasferimento genico16,17 che, se abbinato all'etichettatura fluorescente e agli approcci farmacogenetici o optogenetici, fornisce una potente piattaforma per sezionare la funzione dei circuiti neuronali. Inoltre, con lo sviluppo di geni di editing del genoma CRISPR-Cas9 possono essere sovraespressi o alterati con precisione attraverso il knock-down specifico di tipo cellulare o il knock-out di geni specifici o attraverso lamodulazione dei promotori 18,19. Gli approcci di manipolazione genica che utilizzano iUE sono particolarmente vantaggiosi quando l'effetto dei geni sui circuiti neuronali deve essere testato durante le strette finestre disviluppo 20. IUE è una tecnica versatile e l'iperespressione può essere facilmente realizzata inserendo un gene in un vettore di espressione sotto uno specifico promotore. Un ulteriore controllo dell'espressione genica può essere ottenuto guidando l'espressione utilizzando promotori di diversi punti di forza o utilizzando promotori inducibili in grado di controllare temporaneamentel'espressione genica 21,22. Inoltre, IUE consente il targeting di cellule all'interno di specifici strati corticali, tipi di cellule e regioni cerebrali, il che non è sempre fattibileutilizzando altri approcci 5,17. Recenti progressi nella configurazione IUE basati sull'uso di tre elettrodi, che generano una distribuzione del campo elettrico più efficiente, hanno ampliato il repertorio funzionale di questo metodo e permesso agli scienziati di indirizzare nuovi tipi di cellule e aumentare l'efficienza, la precisione e il numero di cellule che possono essere prese dimira 23,24. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per determinare il ruolo causale della componente complementare 4A (C4A), un gene legato alla SCZ, nella funzione PFC e nella cognizioneprecoce 5.
Qui è presentata una pipeline sperimentale che combina approcci di trasferimento genico per colpire grandi popolazioni di neuroni eccitatori nella corteccia frontale, incluso il PFC, con paradigmi comportamentali che non solo consentono lo studio dei cambiamenti cellulari e a livello di circuito, ma consentono anche di monitorare il comportamento durante lo sviluppo postnatale precoce e l'età adulta. Il primo descritto è un metodo per trasfetto bilateralmente grandi popolazioni di neuroni piramidali di livello (L) 2/3 nelle regioni corticali frontali. Successivamente, vengono delineati i compiti per saggiare il comportamento sociale nei topi giovani e adulti. Il conteggio delle cellule può essere ottenuto al completamento delle attività comportamentali per quantificare l'estensione e la posizione della trasfezione cellulare. Inoltre, il numero di cellule trasfette può essere correlato con i dati comportamentali per determinare se un maggior numero di cellule trasfette porta a maggiori perturbazioni nel comportamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="663">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">13mm Silk Black Braided Suture</td>
			<td style="width:121px;">Havel&#39;s</td>
			<td style="width:161px;">SB77D</td>
			<td style="width:167px;">Suture skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adson Forceps</td>
			<td style="width:121px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:161px;">11006-12</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">C270 Webcam</td>
			<td style="width:121px;">Logitech</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Record behavior</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Electroporator</td>
			<td style="width:121px;">Custom-built</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">BS466</td>
			<td>Pladmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td>Dye for DNA solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine scissors- sharp</td>
			<td style="width:121px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:161px;">14060-09</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Gauze Sponges</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1376152</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gaymar Heating/Cooling</td>
			<td style="width:121px;">Braintree</td>
			<td style="width:161px;">TP-700</td>
			<td style="width:167px;">Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument,</td>
			<td style="width:161px;">P-97</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass pipettes</td>
			<td>Sutter Instrument,</td>
			<td>BF150-117-10</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hair Removal Lotion</td>
			<td style="width:121px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>Hair removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td style="width:121px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:161px;">13002-10</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Open field maze- homemade acrylic arena</td>
			<td style="width:121px;">Custom-built</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>50 &#215; 50 &#215; 30 cm length-width-height</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">pCAG-GFP</td>
			<td style="width:121px;">Addgene</td>
			<td>11150</td>
			<td>Mammalian expression vector for expression of GFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Picospritzer III</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td>pressure injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retractor - 2 Pronged Blunt</td>
			<td style="width:121px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:161px;">17023-13</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ring forceps</td>
			<td style="width:121px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:161px;">11103-09</td>
			<td>IUE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sterilizer, dry bead</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td>sterelize surgical tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY</td>
			<td>Havel&#39;s</td>
			<td>HJ398</td>
			<td>Suture muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:121px;">Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12105-84</td>
			<td style="width:167px;">warming sterile saline</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline using bilateral in utero electroporation to interrogate genetic influences on rodent behavior

Poiché gli studi di associazione a livello genomico fanno luce sulle basi genetiche eterogenee di molte malattie neurologiche, aumenta la necessità di studiare il contributo di specifici geni allo sviluppo cerebrale e alla funzione. Affidarsi a modelli di topi per studiare il ruolo di manipolazioni genetiche specifiche non è sempre fattibile poiché le linee transgeniche del topo sono piuttosto costose e molti nuovi geni associati alle malattie non hanno ancora linee genetiche disponibili in commercio. Inoltre, possono essere necessario anni di sviluppo e convalida per creare una linea del mouse. In utero l'elettroporazione offre un metodo relativamente semplice e veloce per manipolare l'espressione genica in un modo specifico di tipo cellulare in vivo che richiede solo lo sviluppo di un plasmide di DNA per ottenere una particolare manipolazione genetica. L'elettroporazione bilaterale in utero può essere utilizzata per colpire grandi popolazioni di neuroni piramidali della corteccia frontale. La combinazione di questo metodo di trasferimento genico con approcci comportamentali consente di studiare gli effetti delle manipolazioni genetiche sulla funzione delle reti di corteccia prefrontale e il comportamento sociale dei topi giovani e adulti.

Sviluppo e implementazione di successo di un elettroporatore su misura e di tre elettrodi a prong. Per le IUE, è stato costruito un elettroporatore su misura economico basato su un progetto27 descritto in precedenza (Figura 1A e Figura 2). Un elettrodo a tre punte èstato realizzato 23,24 utilizzando pini di plastica con 2 elettrodi negativi attaccati alle pun...

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A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l'esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di embrioni di ratto E16

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Ricerca

Biologia

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...