Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af National Science Foundation-bevillingen 1739308, NSF CAREER-bevillingen 1944130 og af Air Force Office of Science Research-tilskudsnummeret FA9550-18-1-0199. γPNA sekvenser var en generøs gave fra Dr. Tumul Srivastava af Trucode Gene Repair, Inc. Vi vil gerne takke Dr. Erik Winfree og Dr. Rizal Hariadi for deres nyttige samtaler om DNA Design Toolbox MATLAB kode. Vi vil også gerne takke Joseph Suhan, Mara Sullivan og Center for Biological Imaging for deres hjælp i indsamlingen af TEM data.

1. γPNA sekvens design
<ol><li>Download DNA Design Toolbox22 udviklet af Winfree Lab på Caltech23 i mappen, der indeholder programmering scripts til at designe sekvenser.</li>
	<li>Åbn et fjerde generations programmeringssprog, der er kompatibelt med filtypenavnet ".m", i denne sekvensdesignmappe, og føj derefter mappen "DNAdesign" til stien ved hjælp af følgende kommando: >> addpath DNAdesign</li>
	<li>Kør derefter følgende script med navnet "PNA3nanofiber.m" ...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Denne artikel fokuserer på tilpasning og forbedring af eksisterende nukleinsyre nanoteknologi protokoller mod organiske opløsningsmiddel blandinger. De metoder, der er beskrevet her, fokuserer på modifikationer og fejlfinding inden for et defineret eksperimentelt rum af udvalgte polare aprotiske organiske opløsningsmidler. Der er endnu et uudforsket potentiale for, at andre etablerede nukleinsyrenanoteknologiske protokoller kan tilpasses inden for dette rum. Dette kunne forbedre potentielle anvendelser gennem integra...

Vellykket opførelse af en lang række komplekse nanostrukturer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 i vandige eller væsentligt hydrerede medier fremstillet ved hjælp af naturlige forekommende nukleinsyrer som DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 og RNA11,12 er blevet vist i tidligere værker. Naturligt forekommende nukleinsyrer undergår dog duplex-spiralformede konformationelle ændringer eller har reduceret termiske stabiliteter i organiske opløsningsmiddelblandinger13,14.
Tidligere har vores laboratorium rapporteret en metode til opførelse af 3-helix nanofibers ved hjælp af gamma-position modificeret syntetisk nukleinsyre efterligner kaldet gamma-peptid nukleinsyrer (γPNA)15 (Figur 1A). Behovet for en sådan udvikling og potentielle anvendelser af den syntetiske nukleinsyre efterligne PNA er blevet drøftet inden for feltet16,17. Vi har gennem en tilpasning af den enkeltstrengede flisestrategi (SST), der præsenteres for DNA-nanostrukturer18,19,20, vist, at 9 sekventielt adskilte γPNA oligomerer kan designes til at danne 3-helix nanofibers i udvalgte polaraprotiske organiske opløsningsmiddelblandinger som DMSO og DMF. ΓPNA oligomererne blev kommercielt bestilt med ændringer af (R)-diethylenglycol (mini-PEG) ved tre γ-positioner (1, 4 og 8 basispositioner) langs hver 12-base oligomer baseret på metoder offentliggjort af Sahu et al. 21 Disse gamma-modifikationer forårsager den spiralformede præorganisation, der er forbundet med γPNA's højere bindende affinitet og termiske stabilitet i forhold til uændret PNA.
Denne artikel er en tilpasning af vores rapporterede arbejde, hvor vi undersøger virkningerne af opløsningsmiddelopløsning og substitution med DNA på dannelsen af γPNA-baserede nanostrukturer15. Formålet med denne artikel er at give detaljerede beskrivelser af designet samt detaljerede protokoller for opløsningsmiddel-tilpassede metoder, der blev udviklet til selvsamling og karakterisering af γPNA nanofiber. Således introducerer vi først den modulære SST-strategi, en generel platform for nanostrukturdesign ved hjælp af den syntetiske nukleinsyre efterligneR PNA.
Den spiralformede tonehøjde for PNA-duplexer er blevet rapporteret til at være 18 baser pr. tur i forhold til DNA-duplexer, der gennemgår en drejning pr. 10,5 baser (Figur 1B). Derfor blev domænelængden af de demonstrerede γPNA SST'er sat til 6 baser for at rumme en tredjedel af en fuld drejning eller 120° rotation for at muliggøre interaktion mellem tre trekantede helices. Også, i modsætning til tidligere SST motiver, hver SST indeholder kun 2 domæner, effektivt at skabe en 1-dimensionel bånd-lignende struktur, der ombrydes til at danne en tre-helix bundt (Figur 1C). Hver 12-base γPNA oligomer er gamma modificeret på 1, 4 og 8 positioner for at sikre ensartet afstand fordeling af mini-PEG grupper på tværs af den samlede SST motiv. Derudover er der inden for motivet to typer af oligomerer: "sammenhængende" tråde, der findes på en enkelt helix og helix-spænder "crossover" tråde (Figur 1D). Desuden er oligomerer P8 og P6 mærket med fluorescerende Cy3 (grøn stjerne) og biotin (gul oval), henholdsvis (Figur 1D), for at gøre det muligt at detektion af strukturdannelse ved hjælp af fluorescensmikroskopi. I alt er SST-motivet lavet af 9 i alt oligomerer for at muliggøre dannelsen af 3-helix nanofibers gennem programmeret komplementaritet af hvert enkelt domæne til det tilsvarende domæne på en nærliggende oligomer (Figur 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Nuværende strategier inden for DNA og RNA nanoteknologi muliggør selvsamling af en række nukleinsyrenanostrukturer i vandige eller væsentligt hydrerede medier. I denne artikel beskriver vi detaljerede protokoller, der muliggør konstruktion af nanofiberarkitekturer i organiske opløsningsmiddelblandinger gennem selvsamling af entydigt adresserbare, enkeltstrengede, gamma-modificerede peptidkernesyre (γPNA) fliser. Hver enkeltstrengede flise (SST) er en 12-base γPNA oligomer bestående af to sammenkædede modulære domæner på 6 baser hver. Hvert domæne kan binde sig til et gensidigt gratis domæne til stede på tilstødende tråde ved hjælp af programmeret komplementaritet til at danne nanofibers, der kan vokse til mikron i længden. SST motivet er lavet af 9 i alt oligomerer for at muliggøre dannelsen af 3-helix nanofibers. I modsætning til analoge DNA nanostrukturer, som danner diameter-monodisperse strukturer, disse γPNA systemer danner nanofibers, der bundt langs deres bredder under selvsamling i organiske opløsningsmiddel blandinger. Selvsamlingsprotokoller, der er beskrevet her, omfatter derfor også et konventionelt overfladeaktivt stof, Natriumdycylsulfat (SDS), for at reducere bundlingeffekter.

De protokoller, der diskuteres i afsnittene ovenfor, beskriver udformningen af et tilpasset SST-motiv fra DNA-nanofibers til den robuste generation af selvsamlede nanofibers strukturer ved hjælp af flere, forskellige γPNA oligomerer. I dette afsnit beskrives fortolkningen af data fra en vellykket gengivelse af de beskrevne protokoller.
Efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 5 for TIRF-billeddannelse af prøver af γPNA oligomerer, der er udgød i 75 % DMSO: H2O (v/v) giver ...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Denne artikel indeholder protokoller for design og selvsamling af nanostrukturer fra gammamod modificerede peptidkernesyre oligomerer i organiske opløsningsmiddelblandinger.

Selvsamling af gammamodet peptid nukleinsyrer i komplekse nanostrukturer i organiske opløsningsmiddelblandinger

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Denne nye protokol beskriver brugen af flere forskellige sekvenser af den syntetiske nukleinsyre efterligne gamma PNA til at danne nanostrukturer i specifikke organiske opløsningsmiddel blandinger. De analyser, der er beskrevet her, viser behovet for at tilpasse eksisterende nukleinsyrenanoteknologiske protokoller til organiske opløsningsmidler, hvor der kun er offentliggjort få eller ingen protokoller. Udøvere nye til denne teknik kan finde det vanskeligt at tilpasse eksisterende protokoller udviklet til vandige-rige miljøer i organiske opløsningsmiddel-rige miljøer på grund af tilbøjeligheden i nanomateriale PNA at samle.Begynd med at forberede gamma PNA bestande. Efter at have fået HPLC-kvalitet renset gamma PNA tråde fra en kommerciel producent, resuspend hver streng i deioniseret vand til 300 mikromolar koncentrationer. Opbevar gamma-PNA'erne på minus 20 grader Celsius i op til flere måneder.Når du er klar til at udføre selvmontering, skal du forberede glødebatchprøver i 75% DMSO, 75% DMF og 40%1, 4-dioxan. Først forberede 20 mikromolar substocks af hver oligomer ved at aliquoting 0,67 mikroliter fra hovedbestanden og tilføje deioniseret vand til et endeligt volumen på 10 mikroliter. Tilføj en mikroliter af hver oligomer fra de 20 mikromolar substocks til en 200 microliter PCR rør, som vil komme til et samlet volumen på ni mikroliter for ni oligomerer.Der tilsættes 30 mikroliter vandfri DMSO eller DMF med yderligere en mikroliter deioniseret vand til et endeligt volumen på 40 mikroliter. For at forberede 40%1, 4-dioxan parti, tilsættes 16 mikroliter af 1, 4-dioxan og bringe volumen til 40 mikroliter med deioniseret vand. Anneal prøverne i 22,5 timer i en termisk cycler køling fra 90 til 20 grader Celsius.Typisk, smeltetemperaturer opnået for to oligomer og tre oligomer gamma PNA delmængder ligger i intervallet 40 til 70 grader Celsius for forskellige opløsningsmiddel betingelser. Program den termiske cycler i henhold til manuskript retninger. Når udglødning er færdig, kan prøver opbevares ved fire grader Celsius i 12 til 24 timer før karakterisering.Lav et fugtighedskammer fra en tom pipettespidsboks ved at fylde kassen med ca. fem milliliter vand. Forbered en 20-fold fortynding af kommercielt tilgængelige 2% collodion i amylacetat med isoamylacetat opløsningsmiddel til at skabe nitrocellulose opløsning. Brug en pincet til at dyppe en dæksling i nitrocellulose opløsning og lad det lufttørre, derefter lave et flow kammer ud af et mikroskop dias, to dobbeltsidet tape strimler, og nitrocellulose-belagt coverslip.Biotin BSA-opløsningen klargøres ved at veje et milligram biotin BSA og opløse den i en milliliter PBS. Pipette 15 mikroliter af biotin BSA ind i flowkanalen i en vinkel og inkubere den i to til fire minutter ved stuetemperatur i det befugtede kammer. Blæs 15 mikroliter af vaskebufferen, som består af et milligram BSA i en milliliter PBS, ind i kanalen for at vaske overskydende biotin BSA væk, hvorefter overfladen ikke kan insendes ved at inkubere flowkanalen i to til fire minutter i det befugtede kammer.Mål 0,5 milligram streptavidin og et milligram BSA, derefter opløses både i en milliliter PBS. Pipette 15 mikroliter af streptavidin opløsningen ind i flowkanalen og placere den i befugtningskammeret i to til fire minutter og vaske kanalen ved at flyde 15 mikroliter vaskebuffer. Dernæst flow 15 mikroliter af den udglødede parti gamma PNA oligomerer i det befugtede kammer, og vask derefter de ubundne nanostrukturer ved at flyde 15 mikroliter af en millimolar Trolox i samme opløsningsmiddelsammensætning som nanostrukturerne.Overfør flowkanalen til diasholderen, og afbild den med et fluorescensmikroskop udstyret med TIRF-billeddannelse, et 60X-mål for nedsænkning af olie og en 1,5 X forstørrelsesglas. Scan flowkanalen ved enten 60- eller 90X-forstørrelse, mens cy3-kanalen overvåges. Forbered 20 og 6% SDS bestande i henhold til manuskript retninger, derefter udgløde gamma PNA oligomers ved at tilføje en mikroliter af hver 20 mikromolar oligomer til en 200 microliter PCR rør.Der tilsættes 30 mikroliter vandfri DMSO og en mikroliter på henholdsvis 6 % eller 20 % SDS til PCR-rørene for et endeligt volumen på 40 mikroliter, hvilket vil resultere i en endelig SDS-koncentration på henholdsvis 5,25 eller 17,5 millimolar. Anneal gamma PNA'erne i termocymanen som tidligere beskrevet. Karakterisere gamma PNA nanostrukturer i overværelse af SDS ved hjælp af TIRF eller TEM-protokollen.TIRF billeddannelse af gamma PNA oligomerer udglødet i 75% DMSO viste velorganiserede arkitekturer, mens glødning i 75% DMF resulterede i spicule-formet eller nål-lignende nanostrukturer. Den 40% 1, 4-dioxan tilstand produceret en sparsom dekoration af glødetråde nanostrukturer. Desuden viste prøverne af gamma PNA nanorør dannet i 75% DMSO bundling af nanofibers ved høj forstørrelse eller nanoskopisk opløsninger under TEM billeddannelse.Kvantitativ analyse af bredden af nanostrukturerne viste en medianbredde på 16,3 nanometer med maksimale værdier ud over 80 nanometer. Isosequential DNA oligomerer, der erstattede sammenhængende gamma PNAs dannet lige glødeformede strukturer, mens udskiftning af crossover gamma PNAs resultere i stellate strukturer. De nanostrukturer, der blev erstattet med sammenhængende DNA-oligomerer, havde medianbredder på omkring 19 nanometer.Ved høje SDS-koncentrationer anvender gamma-PNA-nanofibre også højt netværksbaserede morfologier i forhold til de kritiske micellekoncentrationer, når de ses med TIRF-billeddannelse. TEM-billeddannelse indikerer, at gamma PNA-montering i 5,25 millimolar SDS har de største reduktioner i strukturel bundling. Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at huske at bevare opløsningsmiddel sammensætninger som nævnt på grund af tilbøjeligheden af nanostrukturer til at samle.Disse metoder tilskynder udøvere til at forfølge andre uudforskede veje af forskellige opløsningsmiddelsammensætninger, overfladeaktive stoffer og andre PNA DNA nanostrukturer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Fast-fase Submonomer Syntese af Peptoid polymerer og deres saml-selv i Meget-Bestilt Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophoresis til adskillelse af ioner og oprensning af nukleinsyrer

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug-loaded Supramolekylær Hydrogel for Local kateter injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolyt kompleks for heparinbindende område osteogent vækstfaktor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet Kemi og peptid Immobilisering på Polytetrafluorethylen for Forbedret Cell-vedhæftning

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Opdigte nedbrydelige Thermoresponsive Hydrogels på flere længdeskalaer via reaktive ekstrudering, mikrofluidik, samlesæt, og Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...