Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Science Foundation grant 1739308, NSF CAREER grant 1944130 en door het Air Force Office of Science Research subsidienummer FA9550-18-1-0199. γPNA sequenties waren een genereus geschenk van Dr Tumul Srivastava van Trucode Gene Repair, Inc. We willen dr. Erik Winfree en Dr. Rizal Hariadi bedanken voor hun nuttige gesprekken over DNA Design Toolbox MATLAB code. We willen ook Joseph Suhan, Mara Sullivan en het Center for Biological Imaging bedanken voor hun hulp bij het verzamelen van TEM-gegevens.

1. γPNA-sequentieontwerp
<ol><li>Download de DNA Design Toolbox22 ontwikkeld door het Winfree Lab op Caltech23 in de map met programmeerscripts voor het ontwerpen van sequenties.</li>
	<li>Open in die map met het ontwerp van de reeks een programmeertaal van de vierde generatie die compatibel is met de bestandsextensie ".m", en voeg vervolgens de eerder gedownloade map 'DNAdesign' toe aan het pad met de volgende opdracht: >> addpath DNAdesign</li>
	<li>Voer vervolgens ...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Dit artikel richt zich op het aanpassen en verbeteren van bestaande nucleïnezuur nanotechnologie protocollen ten opzichte van organische oplosmiddel mengsels. De hier beschreven methoden richten zich op modificaties en probleemoplossing binnen een gedefinieerde experimentele ruimte van geselecteerde polaire aprotische organische oplosmiddelen. Er is nog onontgonnen potentieel voor andere gevestigde nucleïnezuur nanotechnologie protocollen worden aangepast in deze ruimte. Dit zou potentiële toepassingen kunnen verbeter...

Succesvolle bouw van talrijke complexe nanostructuren1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in waterige of substantieel gehydrateerde media gemaakt met behulp van nucleïnezuren zoals DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 en RNA11,12 zijn in eerdere werken getoond. Natuurlijk voorkomende nucleïnezuren ondergaan echter duplexsyletische conformatieveranderingen of hebben verminderde thermische stabiliteiten in organische oplosmiddelmengsels13,14.
Eerder heeft ons lab gemeld een methode voor de bouw van 3-helix nanovezels met behulp van gamma-positie gemodificeerde synthetische nucleïnezuur bootst genaamd gamma-peptide nucleïnezuren (γPNA)15 (Figuur 1A). De noodzaak van een dergelijke ontwikkeling en potentiële toepassingen van het synthetische nucleïnezuur bootsen PNA na in het veld16,17. We hebben aangetoond, door middel van een aanpassing van de single-stranded tile (SST) strategie gepresenteerd voor DNA nanostructuren18,19,20, dat 9 sequentieel onderscheiden γPNA oligomers kunnen worden ontworpen om 3-helix nanofibers vormen in geselecteerde polaire aprotische organische oplosmiddel mengsels zoals DMSO en DMF. De γPNA oligomers werden commercieel besteld met wijzigingen van (R)-diethyleenglycol (mini-PEG) op drie γ-posities (1, 4 en 8 basisposities) langs elke 12-base oligomer op basis van methoden gepubliceerd door Sahu et al.. 21 Deze gamma-wijzigingen veroorzaken de spiraalvormige pre-organisatie die wordt geassocieerd met de hogere bindende affiniteit en thermische stabiliteit van γPNA ten opzichte van ongewijzigde PNA.
Dit artikel is een aanpassing van ons gerapporteerde werk waarin we de effecten van oplosmiddeloplossing en substitutie met DNA op de vorming van γPNA-gebaseerde nanostructuren15onderzoeken. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde beschrijvingen van het ontwerp te geven, evenals gedetailleerde protocollen voor oplosmiddel-aangepaste methoden die zijn ontwikkeld voor de zelfassemblage en karakterisering van γPNA nanofiber. Zo introduceren we eerst de modulaire SST-strategie, een algemeen platform voor nanostructuurontwerp met behulp van het synthetische nucleïnezuur nabootst PNA.
De spiraalvormige toonhoogte voor PNA duplexen is gemeld te zijn 18 bases per beurt in vergelijking met DNA duplexen, die ondergaan een beurt per 10,5 bases (Figuur 1B). Daarom werd de domeinlengte van de aangetoonde γPNA SST's vastgesteld op 6 basissen voor een derde van een volledige draai of 120° rotatie om interactie tussen drie driehoekige arrayed helices mogelijk te maken. Ook, in tegenstelling tot eerdere SST motieven, elke SST bevat slechts 2 domeinen, effectief het creëren van een 1-dimensionale lint-achtige structuur die wraps tot een drie-helix bundel(Figuur 1C) vormen. Elke 12-base γPNA oligomer is gamma aangepast op de 1, 4 en 8 posities om een gelijkmatig verdeelde verdeling van mini-PEG groepen over het totale SST-motief te garanderen. Bovendien, binnen het motief, zijn er twee soorten oligomers: "aaneengesloten" strengen die bestaan op een enkele helix en helix-spanning "crossover" strengen (Figuur 1D). Bovendien zijn oligomers P8 en P6 geëtiketteerd met fluorescerende Cy3 (groene ster) en biotine (geel ovaal), respectievelijk(figuur 1D),om detectie van structuurvorming met behulp van fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken. In totaal is het SST-motief gemaakt van 9 totale oligomeren om de vorming van 3-helix nanovezels mogelijk te maken door geprogrammeerde complementariteit van elk individueel domein aan het overeenkomstige domein op een naburige oligomer (Figuur 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

De huidige strategieën in DNA en RNA nanotechnologie maken het mogelijk om een verscheidenheid aan nucleïnezuur nanostructuren in waterige of substantieel gehydrateerde media te assembleren. In dit artikel beschrijven we gedetailleerde protocollen die de bouw van nanovezelarchitecturen in organische oplosmiddelmengsels mogelijk maken door de zelfassemblage van uniek adresseerbare, enkelstrengse, gamma-gemodificeerde peptidenacleïnezuur (γPNA) tegels. Elke single-stranded tile (SST) is een 12-base γPNA oligomer bestaande uit twee samengevoegde modulaire domeinen van elk 6 basissen. Elk domein kan binden aan een wederzijds gratis domein aanwezig op naburige strengen met behulp van geprogrammeerde complementariteit om nanovezels te vormen die kunnen groeien tot micron in lengte. Het SST-motief is gemaakt van 9 totale oligomeren om de vorming van 3-helix nanovezels mogelijk te maken. In tegenstelling tot analoge DNA-nanostructuren, die diameter-monodispersestructuren vormen, vormen deze γPNA-systemen nanovezels die tijdens zelfassemblage in organische oplosmiddelmengsels langs hun breedtes bundelen. Zelfassemblageprotocollen die hier worden beschreven, omvatten daarom ook een conventionele oppervlakteactieve werking, Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS), om bundelingseffecten te verminderen.

De protocollen besproken in de bovenstaande secties beschrijven het ontwerp van een aangepast SST motief van DNA nanovezels voor de robuuste generatie van zelf geassembleerde nanovezels structuren met behulp van meerdere, verschillende γPNA oligomers. Deze sectie beschrijft de interpretatie van gegevens verkregen uit de succesvolle recreatie van de beschreven protocollen.
Naar aanleiding van het protocol beschreven in punt 5 voor TIRF-beeldvorming van monsters van γPNA-oligomers die in 75% D...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Dit artikel bevat protocollen voor het ontwerp en de zelfassemblage van nanostructuren van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuur oligomeren in organische oplosmiddelmengsels.

Zelfassemblage van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuren in complexe nanostructuren in organische oplosmiddelmengsels

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Dit nieuwe protocol beschrijft het gebruik van meerdere verschillende sequenties van het synthetische nucleïnezuur bootsen gamma PNA na om nanostructuren te vormen in specifieke organische oplosmiddelmengsels. De hier beschreven tests tonen de noodzaak aan om bestaande nucleïnezuurnanotechnologieprotocollen aan te passen aan organische oplosmiddelen waar weinig tot geen protocollen zijn gepubliceerd. Beoefenaars die nieuw zijn voor deze techniek kunnen het moeilijk vinden om bestaande protocollen die voor waterrijke omgevingen zijn ontwikkeld aan te passen aan organische oplosmiddelrijke omgevingen vanwege de neiging van het nanomateriaal PNA om samen te voegen.Begin met het voorbereiden van de gamma PNA-voorraden. Na het verkrijgen van HPLC-kwaliteit gezuiverde gamma PNA-strengen van een commerciële fabrikant, resuspend elke streng in gedeïmiseerd water tot 300 micromolarconcentraties. Bewaar de gamma-azi's tot min 20 graden Celsius gedurende maximaal enkele maanden.Wanneer u klaar bent om zelfassemblage uit te voeren, bereidt u anneale batchmonsters voor in 75%DMSO, 75%DMF en 40%1, 4-dioxaan. Bereid eerst 20 micromolar-subvoorraden van elke oligomer voor door 0,67 microliter uit de hoofdvoorraad te drinken en gedeïmiseerd water toe te voegen voor een eindvolume van 10 microliters. Voeg een microliter van elke oligomer van de 20 micromolar substocks aan een 200 microliter PCR buis, die zal komen tot een totaal volume van negen microliters voor negen oligomers.Voeg 30 microliter water zonder water of DMF toe met een extra microliter gedeïmiseerd water voor een eindvolume van 40 microliters. Voeg 16 microliter van 1, 4-dioxaan en breng het volume met gedeïsized water naar 40 microliter en voeg 16 microliter van 1, 4-dioxaan, toe en breng het volume op 40 microliter met gedeïioniseerd water. Anneal de monsters voor 22,5 uur in een thermische cycler koeling van 90 tot 20 graden Celsius.Typisch, smeltende temperaturen verkregen voor twee oligomer en drie oligomer gamma PNA subsets liggen in het bereik van 40 tot 70 graden Celsius voor verschillende oplosmiddel voorwaarden. Programmeer de thermische cycler volgens manuscriptaanwijzingen. Zodra annealing is voltooid, kunnen monsters worden opgeslagen op vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur voor karakterisering.Maak een vochtigheidskamer van een lege pipettipsdoos door de doos te vullen met ongeveer vijf milliliter water. Bereid een 20-voudige verdunning van commercieel beschikbare 2%collodion in amylacetaat met isoamyas acetaat oplosmiddel om de nitrocelluloseoplossing te creëren. Gebruik een pincet om een coverslip in de nitrocellulose-oplossing te dompelen en laat het aan lucht-droog, dan maakt een stroomkamer uit een microscoopdia, twee dubbelzijdige bandstroken, en nitrocellulose-gecoate coverslip.Bereid de biotine BSA-oplossing voor door een gewicht van één milligram biotine BSA en los deze op in één milliliter PBS. Pipette 15 microliters van de biotine BSA in het stroomkanaal onder een hoek en uitbroeden gedurende twee tot vier minuten bij kamertemperatuur in de bevochtigde kamer. Blaas 15 microliters van de wasbuffer, die bestaat uit een milligram BSA in één milliliter PBS, in het kanaal om overtollige biotine BSA weg te wassen en vervolgens het oppervlak te passeren door het stroomkanaal twee tot vier minuten in de bevochtigde kamer uit te broeden.Meet 0,5 milligram streptavidin en een milligram BSA en los vervolgens beide op in één milliliter PBS. Pipette 15 microliters van de streptavidin oplossing in het stroomkanaal en plaats het in de bevochtigde kamer gedurende twee tot vier minuten en was het kanaal door 15 microliters van wasbuffer. Vervolgens stroom 15 microliters van de geannealed batch van gamma PNA oligomeren in de bevochtigde kamer, dan was de ongebonden nanostructuren door stromende 15 microliters van een millimolar Trolox in dezelfde oplosmiddel samenstelling als de nanostructuren.Breng het stroomkanaal naar de schuifhouder en beeld het met een fluorescentie microscoop uitgerust met TIRF imaging, een 60X olie onderdompeling doelstelling, en een 1.5X vergrootglas. Scan het stroomkanaal bij 60 of 90X vergroting terwijl u het Cy3-kanaal bewaakt. Bereid 20 en 6% SDS-voorraden volgens manuscriptaanwijzingen en trek vervolgens de gamma PNA-oligomers door één microliter van elke 20 micromolar oligomer toe te voegen aan een 200 microliter PCR-buis.Voeg 30 microliter watervrije DMSO en één microliter van 6% of 20% SDS toe aan de PCR-buizen voor een eindvolume van 40 microliters, wat resulteert in een uiteindelijke SDS-concentratie van respectievelijk 5,25 of 17,5 millimolar. Anneal de gamma-AZI's in de thermocycler zoals eerder beschreven. Karakteriseer gamma PNA nanostructuren in aanwezigheid van SDS met behulp van het TIRF- of TEM-protocol.TIRF beeldvorming van gamma PNA oligomers geannealed in 75%DMSO toonde goed georganiseerde architecturen, terwijl annealing in 75%DMF resulteerde in spicule-vormige of naald-achtige nanostructuren. De 40%1, 4-dioxane aandoening produceerde een schaarse decoratie van filamenteuze nanostructuren. Bovendien toonden de monsters van gamma PNA nanobuisjes gevormd in 75%DMSO aan dat nanovezels bij hoge vergroting of nanoscopische resoluties tijdens TEM-beeldvorming bundelden.Kwantitatieve analyse van de breedte van de nanostructuren toonde een mediane breedte van 16,3 nanometer met maximale waarden van meer dan 80 nanometer. Isosequential DNA oligomeren die aaneengesloten gamma-PNO's vervingen, vormden rechte filamenteuze structuren, terwijl vervanging van crossover gamma PNAs resulteert in stellate structuren. De nanostructuren die werden vervangen door aaneengesloten DNA-oligomeren hadden een gemiddelde breedte van ongeveer 19 nanometer.Bij hoge SDS-concentraties nemen gamma PNA-nanovezels ook sterk genetwerkte morfologieën aan in vergelijking met de kritische micelleconcentraties wanneer ze worden bekeken met TIRF-beeldvorming. TEM imaging geeft aan dat gamma PNA assemblage in 5,25 millimolar SDS heeft de meest substantiële vermindering van de structurele bundeling. Bij een poging tot dit protocol, is het belangrijk om te onthouden om de oplosmiddel samenstellingen zoals vermeld te handhaven vanwege de neiging van de nanostructuren om te aggregaat.Deze methoden moedigen beoefenaars aan om andere onontgonnen wegen van verschillende oplosmiddelsamenstellingen, oppervlakteactieve stoffen en andere PNA DNA-nanostructuren na te streven.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Continu-geroerd anaërobe vergister om organisch afval omzetten in biogas: Systeemconfiguratie en Basisbediening

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Een injecteerbare en-Drug geladen Supramoleculaire Hydrogel voor Local Catheter injectie in de Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...