Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus en partie par la subvention de la National Science Foundation 1739308, la subvention carrière du FNS en 1944130 et par le numéro de subvention fa9550-18-1-0199 de l’Office of Science de la Force aérienne. γPNA séquences ont été un don généreux du Dr Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nous tenons à remercier le Dr Erik Winfree et le Dr Rizal Hariadi pour leurs conversations utiles sur le code MATLAB de la boîte à outils de conception d’ADN. Nous tenons également à remercier Joseph Suhan, Mara Sullivan et le Center for Biological Imaging pour leur aide dans la collecte de données TEM.

1. conception de séquence γPNA
<ol><li>Téléchargez la boîte à outils dna design22 développée par le Winfree Lab chez Caltech23 dans le dossier contenant des scripts de programmation pour la conception de séquences.</li>
	<li>Dans ce dossier de conception de séquence, ouvrez un langage de programmation de quatrième génération compatible avec l’extension de fichier « .m », puis ajoutez le dossier « DNAdesign » précédemment téléchargé au chemin en...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Cet article met l’accent sur l’adaptation et l’amélioration des protocoles existants de nanotechnologie de l’acide nucléique vers les mélanges de solvants organiques. Les méthodes décrites ici se concentrent sur les modifications et le dépannage dans un espace expérimental défini de certains solvants organiques aprotiques polaires. Il existe encore un potentiel inexploré pour l’adaptation d’autres protocoles établis de nanotechnologie de l’acide nucléique dans cet espace. Ceci pourrait améliorer...

Construction réussie de nombreuses nanostructurescomplexes 1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12 dans des supports aqueux ou substantiellement hydratés fabriqués à partir de produits naturellement des acides nucléiques tels que l’ADN1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10 et l’ARN11,12 aété montré dans des œuvres antérieures. Cependant, les acides nucléiques naturels subissent des changements conformationnels héliciques duplex ou ont réduit les stabilités thermiques dans les mélanges organiques desolvants 13,14.
Auparavant, notre laboratoire a signalé une méthode de construction de nanofibres à 3 hélices à l’aide d’acides nucléiques synthétiques modifiés à position gamma imitant les acides nucléiques gamma-peptides (γPNA)15 (Figure 1A). La nécessité d’un tel développement et les applications potentielles de l’acide nucléique synthétique imitent pna a été discuté dans ledomaine 16,17. Nous avons montré, grâce à une adaptation de la stratégie de tuile mono-échouée (SST) présentée pour les nanostructuresd’ADN 18,19,20, que 9 oligomers γPNA séquentiellement distincts peuvent être conçus pour former des nanofibres à 3 hélices dans certains mélanges de solvants organiques aprotiques polaires tels que le DMSO et le DMF. Les oligomers γPNA ont été commandés commercialement avec des modifications de (R)-déthylène glycol (mini-PEG) à trois positions de γ (1, 4 et 8 positions de base) le long de chaque oligomer de 12 base basé sur des méthodes publiées par Sahu et coll. 21 Ces modifications gamma provoquent la pré-organisation hélitique associée à l’affinité de liaison plus élevée et à la stabilité thermique de γPNA par rapport à l’ANP non modifié.
Cet article est une adaptation de nos travaux rapportés dans lesquels nous étudions les effets de la solution solvant et de la substitution par l’ADN sur la formation de nanostructures à base de γPNA15. L’objectif de cet article est de fournir des descriptions détaillées de la conception ainsi que des protocoles détaillés pour les méthodes adaptées aux solvants qui ont été développées pour l’auto-assemblage et la caractérisation de la nanofibre γPNA. Ainsi, nous introduisons d’abord la stratégie modulaire SST, une plate-forme générale pour la conception de nanostructures utilisant l’acide nucléique synthétique imiter PNA.
On a signalé que le terrain héliique pour les duplex PNA était de 18 bases par tour par rapport aux duplex d’ADN, qui subissent un tour par 10,5 bases (figure 1B). Par conséquent, la longueur de domaine des SSTs γPNA démontrés a été fixée à 6 bases pour accueillir un tiers d’un tour complet ou 120° de rotation pour permettre l’interaction entre trois hélices triangulaires. En outre, contrairement aux motifs SST précédents, chaque SST contient seulement 2 domaines, créant efficacement une structure en forme de ruban unidimensionnel qui s’enveloppe pour former un faisceau de trois hélices (Figure 1C). Chaque oligomer γPNA de 12 bas est modifié gamma aux positions 1, 4 et 8 afin d’assurer une répartition uniformément espacée des mini-groupes PEG à travers le motif global du SST. De plus, dans le motif, il existe deux types d’oligomers : les brins « contigus » qui existent sur une seule hélice et des brins de « croisement » à hélice(figure 1D). De plus, les oligomeurs P8 et P6 sont étiquetés avec du Cy3 fluorescent (étoile verte) et de la biotine (ovale jaune), respectivement(figure 1D),afin de permettre la détection de la formation de la structure à l’aide de microscopie par fluorescence. Au total, le motif SST est composé de 9 oligomers totaux pour permettre la formation de nanofibres à 3 hélices grâce à la complémentarité programmée de chaque domaine individuel au domaine correspondant sur un oligomer voisin (Figure 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Les stratégies actuelles en nanotechnologie de l’ADN et de l’ARN permettent l’auto-assemblage d’une variété de nanostructures d’acide nucléique dans des médias aqueux ou considérablement hydratés. Dans cet article, nous décrivons des protocoles détaillés qui permettent la construction d’architectures nanofibres dans des mélanges de solvants organiques par l’auto-assemblage de tuiles nucléiques peptides (γPNA) particulièrement adressables, mono-échouées et gamma modifiées. Chaque tuile à brin unique (SST) est un oligomer γPNA de 12 bases composé de deux domaines modulaires concatenated de 6 bases chacune. Chaque domaine peut se lier à un domaine mutuellement complémentaire présent sur les brins voisins en utilisant la complémentarité programmée pour former des nanofibres qui peuvent atteindre des microns de longueur. Le motif SST est composé de 9 oligomers totaux pour permettre la formation de nanofibres à 3 hélices. Contrairement aux nanostructures analogues de l’ADN, qui forment des structures diamètre-monodisperse, ces systèmes γPNA forment des nanofibres qui se regroupent le long de leur largeur lors de l’auto-assemblage dans des mélanges de solvants organiques. Les protocoles d’auto-assemblage décrits ici incluent donc également un surfactant conventionnel, le sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pour réduire les effets de regroupement.

Les protocoles discutés dans les sections ci-dessus décrivent la conception d’un motif SST adapté à partir de nanofibres d’ADN pour la génération robuste de structures nanofibres auto-assemblées utilisant plusieurs oligomers γPNA distincts. Cette section décrit l’interprétation des données obtenues à partir de la reconstitution réussie des protocoles décrits.
Suivant le protocole décrit à la section 5 pour l’imagerie TIRF d’échantillons d’oligomers γPNA annelés d...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Cet article fournit des protocoles pour la conception et l’auto-assemblage de nanostructures à partir d’oligomers d’acide nucléique peptidique gamma modifiés dans les mélanges de solvants organiques.

Auto-assemblage d’acides nucléiques peptides gamma modifiés en nanostructures complexes dans des mélanges de solvants organiques

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Ce nouveau protocole décrit l’utilisation de multiples séquences distinctes de l’acide nucléique synthétique imitent le gamma PNA pour former des nanostructures dans des mélanges spécifiques de solvants organiques. Les analyses décrites ici montrent la nécessité d’adapter les protocoles existants de nanotechnologie de l’acide nucléique aux solvants organiques où peu ou pas de protocoles ont été publiés. Les praticiens nouveaux à cette technique pourraient avoir du mal à adapter les protocoles existants développés pour les environnements riches en aqueux en environnements organiques riches en solvants en raison de la propension de l’ANP nanomatériau à s’agréger.Commencez par préparer les stocks gamma de pna. Après avoir obtenu des brins de PNA gamma purifiés de qualité HPLC auprès d’un fabricant commercial, resuspendez chaque brin dans de l’eau déionisée à 300 concentrations de micromolaires. Conservez les PNA gamma à moins 20 degrés Celsius jusqu’à plusieurs mois.Lorsqu’il est prêt à effectuer l’auto-assemblage, préparer des échantillons de lots anneaux dans 75%DMSO, 75%DMF, et 40%1, 4-dioxane. Tout d’abord, préparez 20 sous-stocks micromolaires de chaque oligomer en incitant 0,67 microlitres du stock principal et en ajoutant de l’eau déionisée pour un volume final de 10 microlitres. Ajoutez un microlitre de chaque oligomer des 20 sous-stocks micromolaires à un tube PCR de 200 microlitres, qui se chiffrera à un volume total de neuf microlitres pour neuf oligomers.Ajouter 30 microlitres de DMSO anhydre ou de DMF avec un microlitre supplémentaire d’eau déionisée pour un volume final de 40 microlitres. Pour préparer le lot de 40%1, 4-dioxane, ajouter 16 microlitres de 1, 4-dioxane et porter le volume à 40 microlitres avec de l’eau déionisée. Anneal les échantillons pendant 22,5 heures dans un cycleeur thermique de refroidissement de 90 à 20 degrés Celsius.En règle générale, les températures de fonte obtenues pour deux sous-ensembles oligomer et trois sous-ensembles gamma oligomer PNA se situent entre 40 et 70 degrés Celsius pour différentes conditions de solvant. Programmez le cycleur thermique selon les directives manuscrites. Une fois l’annealage terminé, les échantillons peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures avant la caractérisation.Faites une chambre d’humidité à partir d’une boîte vide de bouts de pipette en remplissant la boîte avec approximativement cinq millilitres d’eau. Préparez une dilution 20 fois de 2% collodion disponible dans le commerce en acétate d’amyle avec solvant d’acétate d’isoamyle pour créer la solution de nitrocellulose. Utilisez des pinces à épiler pour tremper un coverslip dans la solution de nitrocellulose et lui permettre de sécher à l’air libre, puis faire une chambre d’écoulement à partir d’une diapositive microscope, deux bandes de ruban à double face, et le coverslip enduit de nitrocellulose.Préparez la solution BSA de biotine en pesant un milligramme de biotine BSA et en la dissolvant en un millilitre de PBS. Pipette 15 microlitres de la biotine BSA dans le canal d’écoulement à un angle et l’incuber pendant deux à quatre minutes à température ambiante dans la chambre humidifiée. Soufflez 15 microlitres du tampon de lavage, qui se compose d’un milligramme de BSA dans un millilitre de PBS, dans le canal pour laver l’excès de biotine BSA, puis passer la surface en incubant le canal d’écoulement pendant deux à quatre minutes dans la chambre humidifiée.Mesurer 0,5 milligramme de streptavidine et un milligramme de BSA, puis dissoudre les deux dans un millilitre de PBS. Pipette 15 microlitres de la solution streptavidine dans le canal d’écoulement et le placer dans la chambre humidifiée pendant deux à quatre minutes et laver le canal en écoulant 15 microlitres de tampon de lavage. Ensuite, coulez 15 microlitres du lot annelé d’oligomers gamma PNA dans la chambre humidifiée, puis lavez les nanostructures non liées en écoulant 15 microlitres d’un millimolaire Trolox dans la même composition de solvant que les nanostructures.Transférez le canal d’écoulement vers le support de diapositives et imagez-le avec un microscope à fluorescence équipé de l’imagerie TIRF, d’un objectif d’immersion d’huile de 60X et d’une loupe de 1,5 X. Scannez le canal d’écoulement à un grossissement de 60 ou 90X tout en surveillant le canal Cy3. Préparez des stocks de 20 et 6% de SDS selon les instructions manuscrites, puis anneal les oligomers gamma PNA en ajoutant un microlitre de chaque oligomer de 20 micromolaires à un tube PCR de 200 microlitres.Ajoutez 30 microlitres de DMSO anhydre et un microlitre de 6%ou 20%SDS aux tubes PCR pour un volume final de 40 microlitres, ce qui se traduira par une concentration finale de SDS de 5,25 ou 17,5 millimolaires respectivement. Anneal les PNA gamma dans le thermocycleur comme précédemment décrit. Caractériser les nanostructures gamma PNA en présence de SDS à l’aide du protocole TIRF ou TEM.La formation image de TIRF des oligomers gamma de PNA annealed dans 75%DMSO a montré des architectures bien organisées tandis que l’annealing dans 75%DMF a eu comme conséquence les nanostructures spicule-formées ou aiguille-comme. L’état de 40%1, 4-dioxane a produit une décoration clairsemée des nanostructures filamenteuses. En outre, les échantillons de nanotubes gamma PNA formés dans 75%DMSO ont démontré le regroupement des nanofibres à grossissement élevé ou des résolutions nanoscopiques pendant l’imagerie TEM.L’analyse quantitative de la largeur des nanostructures a montré une largeur médiane de 16,3 nanomètres avec des valeurs maximales au-delà de 80 nanomètres. Les oligomers isosequential d’ADN qui ont remplacé les PNA gamma contigus ont formé les structures filamenteuses droites tandis que le remplacement des PNA gamma de croisement a comme conséquence des structures stellaires. Les nanostructures qui ont été remplacées par des oligomers d’ADN contigus avaient des largeurs médianes d’environ 19 nanomètres.À des concentrations élevées de SDS, les nanofibres gamma PNA adoptent également des morphologies fortement en réseau par rapport à ses concentrations critiques de micelle lorsqu’on les regarde avec l’imagerie TIRF. L’imagerie TEM indique que l’assemblage gamma de PNA en SDS de 5,25 millimolaires a les réductions les plus substantielles du regroupement structurel. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de se rappeler de maintenir les compositions de solvants mentionnées en raison de la propension des nanostructures à s’agréger.Ces méthodes encouragent les praticiens à rechercher d’autres avenues inexplorées de différentes compositions de solvants, surfactants et autres nanostructures d’ADN PNA.

Research

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Recherche

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