Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Stipendium der National Science Foundation 1739308, das NSF CAREER-Stipendium 1944130 und das Air Force Office of Science Research Grant-Nummer FA9550-18-1-0199 unterstützt. "PNA-Sequenzen waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Tumul Srivastava von Trucode Gene Repair, Inc. Wir danken Dr. Erik Winfree und Dr. Rizal Hariadi für ihre hilfreichen Gespräche zum DNA Design Toolbox MATLAB Code. Wir danken auch Joseph Suhan, Mara Sullivan und dem Center for Biological Imaging für ihre Unterstützung bei der Erfassung von TEM-Daten.

1. PNA-Sequenzdesign
<ol><li>Laden Sie die DNA Design Toolbox22 herunter, die vom Winfree Lab bei Caltech23 entwickelt wurde, in den Ordner mit Programmierskripten zum Entwerfen von Sequenzen.</li>
	<li>Öffnen Sie in diesem Sequenzentwurfsordner eine Programmiersprache der vierten Generation, die mit der Dateierweiterung ".m" kompatibel ist, und fügen Sie dann den zuvor heruntergeladenen Ordner "DNAdesign" mit dem folgenden Befehl zum Pfad hinzu: >> Pfad Hinzufügen ...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Anpassung und Verbesserung bestehender Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittelgemische. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf Modifikationen und Fehlerbehebung innerhalb eines definierten experimentellen Raumes ausgewählter polarer aprotischer organischer Lösungsmittel. Es gibt noch unerforschtes Potenzial für andere etablierte Nukleinsäure-Nanotechnologie-Protokolle, die in diesem Raum angepasst werden. Dies könnte potenzielle An...

Erfolgreicher Aufbau zahlreicher komplexer Nanostrukturen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien, die mit natürlich vorkommenden Nukleinsäuren wie DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 und RNA11,12 hergestellt wurden, wurde in früheren Arbeiten gezeigt. Natürlich vorkommende Nukleinsäuren unterliegen jedoch duplexen Spiralkonformationsveränderungen oder haben in organischen Lösungsmittelmischungen13,14die thermischen Stabilitäten verringert.
Zuvor hat unser Labor eine Methode zur Konstruktion von 3-Helix-Nanofasern unter Verwendung von Gamma-Position modifizierte synthetische Nukleinsäure-Mimikikos, sogenannte Gamma-Peptid-Nukleinsäuren, gemeldet ( PNA)15 (Abbildung 1A). Die Notwendigkeit einer solchen Entwicklung und potentiellen Anwendungen der synthetischen Nukleinsäure imitiert PNA wurde im Feld16,17diskutiert. Wir haben durch eine Anpassung der für DNA-Nanostrukturen18,19,20vorgestellten Strategie für einsträngige Fliesen (SST) gezeigt, dass 9 sequenziell unterschiedliche PNA-Oligomere so konzipiert werden können, dass sie 3-Helix-Nanofasern in ausgewählten polaren aprotischen organischen Lösungsmittelmischungen wie DMSO und DMF bilden. Die "PNA-Oligomere" wurden mit Modifikationen von (R)-Diethylenglykol (Mini-PEG) an drei γ-Positionen (1, 4 und 8 Basispositionen) entlang jedes 12-Basis-Oligomers auf der Grundlage von Methoden, die von Sahu et al.veröffentlicht wurden, kommerziell bestellt. 21 Diese Gamma-Modifikationen verursachen die spiralförmige Vororganisation, die mit der höheren Bindungsaffinität und thermischen Stabilität von PNA im Verhältnis zu unverändertem PNA verbunden ist.
Dieser Artikel ist eine Adaption unserer berichteten Arbeit, in der wir die Auswirkungen von Lösungsmittellösung und Substitution mit DNA auf die Bildung von "PNA-basierten Nanostrukturen" untersuchen15. Ziel dieses Artikels ist es, detaillierte Beschreibungen des Designs sowie detaillierte Protokolle für lösungsmittelangepasste Methoden zu liefern, die für die Selbstmontage und Charakterisierung von "PNA-Nanofaser" entwickelt wurden. So stellen wir zunächst die modulare SST-Strategie vor, eine allgemeine Plattform für Nanostrukturdesign mit der synthetischen Nukleinsäure-Mimik PNA.
Die Spiraltonhöhe für PNA-Duplexe wurde als 18 Basen pro Zug im Vergleich zu DNA-Duplexen berichtet, die eine Drehung pro 10,5 Basen durchlaufen(Abbildung 1B). Daher wurde die Domänenlänge der gezeigten "PNA SSTs" auf 6 Basen festgelegt, um ein Drittel einer vollen Drehung oder 120° Drehung aufzunehmen, um eine Interaktion zwischen drei dreieckig angeordneten Helices zu ermöglichen. Im Gegensatz zu früheren SST-Motiven enthält jeder SST nur 2 Domänen, wodurch eine eindimensionale, bandartige Struktur entsteht, die zu einem Drei-Helix-Bundle umschließt (Abbildung 1C). Jedes 12-Basis-PNA-Oligomer wird an den 1,4 und 8 Positionen gammamodifiziert, um eine gleichmäßige Verteilung der Mini-PEG-Gruppen über das gesamte SST-Motiv zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es innerhalb des Motivs zwei Arten von Oligomeren: "zusammenhängende" Stränge, die auf einer einzigen Spirale existieren, und helix-spannende "Crossover"-Stränge (Abbildung 1D). Darüber hinaus sind die Oligomere P8 und P6 mit fluoreszierendem Cy3 (grüner Stern) bzw. Biotin (gelb oval) gekennzeichnet,um den Nachweis der Strukturbildung mittels Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. Insgesamt besteht das SST-Motiv aus insgesamt 9 Oligomeren, um die Bildung von 3-Helix-Nanofasern durch programmierte Komplementarität jeder einzelnen Domäne zur entsprechenden Domäne auf einem benachbarten Oligomer zu ermöglichen (Abbildung 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Aktuelle Strategien in der DNA- und RNA-Nanotechnologie ermöglichen die Selbstmontage einer Vielzahl von Nukleinsäure-Nanostrukturen in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Protokolle, die den Aufbau von Nanofaserarchitekturen in organischen Lösungsmittelmischungen durch die Selbstmontage von eindeutig adressierbaren, einsträngigen, gammamodifizierten Peptidnukleinsäurefliesen ermöglichen. Jede einsträngige Fliese (SST) ist ein 12-Basis-PNA-Oligomer, der aus zwei verketteten modularen Domänen mit jeweils 6 Basen besteht. Jede Domäne kann sich an eine sich gegenseitig ergänzende Domäne binden, die auf benachbarten Strängen vorhanden ist, indem programmierte Komplementarität verwendet wird, um Nanofasern zu bilden, die bis zu Mikron en länge nausen können. Das SST-Motiv besteht aus insgesamt 9 Oligomeren, um die Bildung von 3-Helix-Nanofasern zu ermöglichen. Im Gegensatz zu analogen DNA-Nanostrukturen, die durchmessermonodisperse Strukturen bilden, bilden diese PNA-Systeme Nanofasern, die sich bei der Selbstmontage in organischen Lösungsmittelmischungen entlang ihrer Breite bündeln. Die hier beschriebenen Selbstmontageprotokolle enthalten daher auch ein herkömmliches Tensid, Natriumdodecylsulfat (SDS), um Bündelungseffekte zu reduzieren.

Die in den obigen Abschnitten besprochenen Protokolle beschreiben die Konstruktion eines angepassten SST-Motivs aus DNA-Nanofasern für die robuste Erzeugung selbstmontierter Nanofaserstrukturen unter Verwendung mehrerer, ausgeprägter PNA-Oligomere. In diesem Abschnitt wird die Interpretation der Daten beschrieben, die aus der erfolgreichen Wiedererstellung der beschriebenen Protokolle gewonnen wurden.
Nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Protokoll für die TIRF-Bildgebung von Proben von PNA...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Dieser Artikel enthält Protokolle für die Konstruktion und Selbstmontage von Nanostrukturen aus gammamodifizierten Peptidnukleinsäure-Oligomeren in organischen Lösungsmittelmischungen.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Dieses neuartige Protokoll beschreibt die Verwendung mehrerer unterschiedlicher Sequenzen der synthetischen Nukleinsäure, die Gamma PNA imitiert, um Nanostrukturen in spezifischen organischen Lösungsmittelmischungen zu bilden. Die hier beschriebenen Assays zeigen die Notwendigkeit, bestehende Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittel anzupassen, bei denen wenig bis gar keine Protokolle veröffentlicht wurden. Praktiker, die mit dieser Technik neue, könnten aufgrund der Neigung des Nanomaterials PNA, sich zu aggregieren, Schwierigkeiten haben, vorhandene Protokolle, die für wässrige Umgebungen entwickelt wurden, in organische lösungsmittelreiche Umgebungen anzupassen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Gamma PNA-Bestände. Nach Erhalt von HPLC-gereinigten Gamma-PNA-Strängen von einem kommerziellen Hersteller, setzen Sie jeden Strang in entionisiertem Wasser auf 300 mikromolare Konzentrationen aus. Bewahren Sie die Gamma-PNAs bei minus 20 Grad Celsius für bis zu mehrere Monate auf.Wenn Sie bereit sind, selbst zu montieren, bereiten Sie Aneal-Chargenproben in 75%DMSO, 75%DMF und 40%1, 4-Dioxan vor. Bereiten Sie zunächst 20 mikromolare Substocks jedes Oligomers vor, indem Sie 0,67 Mikroliter aus dem Hauptbestand aliquotieren und entionisiertes Wasser für ein Endvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Fügen Sie einen Mikroliter von jedem Oligomer aus den 20 mikromolaren Substocks zu einem 200 Mikroliter PCR-Rohr hinzu, das für neun Oligomere ein Gesamtvolumen von neun Mikrolitern erreicht.Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO oder DMF mit einem zusätzlichen Mikroliter entionisiertem Wasser für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu. Zur Zubereitung der 40%1, 4-Dioxan-Charge 16 Mikroliter 1, 4-Dioxan hinzufügen und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 40 Mikroliter bringen. Anneal die Proben für 22,5 Stunden in einem thermischen Cycler Kühlung von 90 bis 20 Grad Celsius.Typischerweise liegen die Schmelztemperaturen für zwei Oligomer- und drei Oligomer-Gamma-PNA-Teilmengen im Bereich von 40 bis 70 Grad Celsius für unterschiedliche Lösungsmittelbedingungen. Programmieren Sie den thermischen Cycler nach Manuskriptanweisungen. Nach abschlussdem Glühen können proben12 bis 24 Stunden vor der Charakterisierung bei vier Grad Celsius gelagert werden.Machen Sie eine Feuchtigkeitskammer aus einer leeren Pipettenspitzen-Box, indem Sie die Box mit etwa fünf Milliliter Wasser füllen. Bereiten Sie eine 20-fache Verdünnung von handelsüblichen 2%kollodium in Amylacetat mit Isoamylacetat-Lösungsmittel vor, um die Nitrocelluloselösung zu erzeugen. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Deckelschlupf in die Nitrozelluloselösung einzutauchen und ihn lufttrocknen zu lassen, und dann eine Durchflusskammer aus einem Mikroskopschlitten, zwei doppelseitigen Bandstreifen und dem nitrozellulosebeschichteten Deckelrutsch zu machen.Bereiten Sie die Biotin-BSA-Lösung vor, indem Sie ein Milligramm Biotin BSA wiegen und in einem Milliliter PBS auflösen. 15 Mikroliter des Biotins BSA schräg in den Strömungskanal pfeifen und bei Raumtemperatur in der Befeuchtungskammer zwei bis vier Minuten inkubieren. 15 Mikroliter des Waschpuffers, der aus einem Milligramm BSA in einem Milliliter PBS besteht, in den Kanal blasen, um überschüssiges Biotin BSA wegzuwaschen, und dann die Oberfläche passivieren, indem sie den Durchflusskanal für zwei bis vier Minuten in der befeuchteten Kammer inkubieren.Messen Sie 0,5 Milligramm Streptavidin und ein Milligramm BSA, dann lösen Sie beide in einem Milliliter PBS. 15 Mikroliter der Streptavidin-Lösung in den Strömungskanal geben und zwei bis vier Minuten in die befeuchtete Kammer legen und den Kanal durch fließendes 15 Mikroliter Waschpuffer waschen. Als nächstes fließen 15 Mikroliter der geglühten Charge von Gamma-PNA-Oligomeren in die befeuchtete Kammer und waschen dann die ungebundenen Nanostrukturen, indem sie 15 Mikroliter eines Millimolaren Trolox in der gleichen Lösungsmittelzusammensetzung wie die Nanostrukturen fließen.Übertragen Sie den Durchflusskanal auf den Diahalter und bebildern Sie ihn mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit TIRF-Bildgebung, einem 60-fachen Öl-Tauchobjektiv und einer 1,5-fachen Lupe ausgestattet ist. Scannen Sie den Durchflusskanal mit einer 60- oder 90-fachen Vergrößerung, während Sie den Cy3-Kanal überwachen. Bereiten Sie 20 und 6% SDS-Bestände nach Manuskriptanweisungen vor, dann die Gamma-PNA-Oligomere annealieren, indem Sie einem 200 Mikroliter-PCR-Röhrchen einen Mikroliter von jedem 20 Mikromolaren-Oligomer hinzufügen.Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO und einen Mikroliter 6% oder 20%SDS zu den PCR-Röhren für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu, was zu einer endgültigen SDS-Konzentration von 5,25 bzw. 17,5 Millimolar führt. Anneal die Gamma-PNAs im Thermocycler wie zuvor beschrieben. Charakterisieren Sie Gamma-PNA-Nanostrukturen in Gegenwart von SDS mit dem TIRF- oder TEM-Protokoll.Die TIRF-Bildgebung von Gamma-PNA-Oligomeren, die in 75% DMSO geglüht wurden, zeigte gut organisierte Architekturen, während das Glühen in 75%DMF zu spikulierenförmigen oder nadelartigen Nanostrukturen führte. Der Zustand von 40%1, 4-Dioxan erzeugte eine spärliche Dekoration von fadenförmigen Nanostrukturen. Darüber hinaus zeigten die Proben von Gamma-PNA-Nanoröhren, die in 75%DMSO gebildet wurden, die Bündelung von Nanofasern bei hoher Vergrößerung oder nanoskopischen Auflösungen während der TEM-Bildgebung.Die quantitative Analyse der Breite der Nanostrukturen ergab eine mittlere Breite von 16,3 Nanometern mit Höchstwerten jenseits von 80 Nanometern. Isosequenzielle DNA-Oligomere, die zusammenhängende Gamma-PNAs ersetzten, bildeten gerade fadenförmige Strukturen, während der Ersatz von Crossover-Gamma-PNAs zu stellaten Strukturen führt. Die Nanostrukturen, die durch zusammenhängende DNA-Oligomere ersetzt wurden, hatten eine mittlere Breite von etwa 19 Nanometern.Bei hohen SDS-Konzentrationen nehmen Gamma-PNA-Nanofasern auch hoch vernetzte Morphologien im Vergleich zu ihren kritischen Micelle-Konzentrationen an, wenn sie mit TIRF-Bildgebung betrachtet werden. DIE TEM-Bildgebung zeigt an, dass die Gamma-PNA-Baugruppe in 5,25 Millimolar-SDS die größten Reduktionen bei der strukturellen Bündelung aufwies. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Lösungsmittelzusammensetzungen, wie erwähnt, zu erhalten, da die Nanostrukturen zu einer Aggregation führen.Diese Methoden ermutigen Praktiker, andere unerforschte Wege verschiedener Lösungsmittelzusammensetzungen, Tenside und anderer PNA-DNA-Nanostrukturen zu verfolgen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

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Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

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Kontinuierlich-gerührt anaeroben Faulbehälter zu Bio-Abfälle in Biogas umwandeln: System-Setup und Grundlagen der Bedienung

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