Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע 1739308, מענק קריירה NSF 1944130 ועל ידי משרד חיל האוויר של מחקר מדעי מענק מספר FA9550-18-1-0199. רצפי γPNA היו מתנה נדיבה מד"ר טאמול Srivastava של תיקון גנים Trucode, Inc. ברצוננו להודות לד"ר אריק ווינפרי ודר"ר ריזאל הריאדי על השיחות המועילות שלהם על קוד MATLAB של ארגז הכלים לעיצוב דנ"א. ברצוננו להודות גם לג'וזף סוהאן, מארה סאליבן והמרכז להדמיה ביולוגית על עזרתם באיסוף נתוני TEM.

1. עיצוב רצף γPNA
<ol><li>הורד את ארגז הכלים לעיצוב DNA22 שפותח על ידי מעבדת Winfree ב Caltech23 לתוך התיקייה המכילה סקריפטים תכנות לעיצוב רצפים.</li>
	<li>בתוך תיקיית עיצוב רצף זו, פתח שפת תיכנות מהדור הרביעי התואמת לסיומת הקובץ ".m" ולאחר מכן הוסף את התיקיה "DNAdesign" שהורדת בעבר לנתיב בא...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

מאמר זה מתמקד בהתאמת ושיפור פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי תערובות ממס אורגניות. השיטות המתוארות כאן מתמקדות בשינויים ובפתרון בעיות בתוך מרחב ניסיוני מוגדר של ממיסים אורגניים אפרוטיים קוטביים נבחרים. יש עדיין פוטנציאל שלא נחקר עבור פרוטוקולים אחרים הוקמה חומצת גרעי...

בנייה מוצלחת של ננו-מבניםמורכבים רבים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 במדיה מיקווית או hydrated באופן משמעותי עשה באמצעות חומצות גרעין טבעיות כגון DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ו- RNA 11,12 הוצגו בעבודות קודמות. עם זאת, חומצות גרעין המתרחשות באופן טבעי עוברות שינויים קונפורמיים דו-סטריים או צמצמו את היוצקותהתרמיות בתערובות ממס אורגני 13,14.
בעבר, המעבדה שלנו דיווחה על שיטה לבניית ננו-פייברים עם 3 סלילים באמצעות חיקויי חומצות גרעין סינתטיות שעברו מיקום גמא הנקראים חומצות גרעין גמא-פפטיד (γPNA)15 (איור 1A). הצורך בפיתוח כזה ויישומים פוטנציאליים של חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA נדונה בתוךהשדה 16,17. הראינו, באמצעות הסתגלות של אריח חד גדילי (SST) אסטרטגיה שהוצגו עבור nanostructures DNA18,19,20, כי 9 אוליגומרים γPNA ברור ברצף יכול להיות מתוכנן ליצור nanofibers סליל 3 בתערובות ממס אורגני קוטבי נבחר כגון DMSO ו- DMF. אוליגומרים γPNA הוזמנו מסחרית עם שינויים של (R)-diethylene גליקול (מיני PEG) בשלוש עמדות γ (1, 4 ו 8 עמדות בסיס) לאורך כל אוליגומר 12 בסיס מבוסס על שיטות שפורסמו על ידי Sahu et al. 21 שינויים אלה גמא לגרום טרום ארגון helical המשויך זיקה מחייבת גבוהה יותר ויציבות תרמית של γPNA יחסית PNA ללא שינוי.
מאמר זה הוא התאמה של העבודה המדווחת שלנו שבו אנו חוקרים את ההשפעות של פתרון ממס והחלפה עם DNA על היווצרות של nanostructures מבוססי γPNA15. מטרת מאמר זה היא לספק תיאורים מפורטים של העיצוב, כמו גם פרוטוקולים מפורטים עבור שיטות מותאמות ממס שפותחו עבור הרכבה עצמית ואפיון של nanofiber γPNA. לכן, אנו מציגים לראשונה את אסטרטגיית SST מודולרית, פלטפורמה כללית עבור עיצוב nanostructure באמצעות חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA.
המגרש הסללי לדופלקסים של PNA דווח על 18 בסיסים לכל סיבוב בהשוואה לדופלקסים של דנ"א, שעוברים סיבוב אחד לכל 10.5 בסיסים (איור 1B). לכן, אורך התחום של SSTs γPNA הפגינו נקבע על 6 בסיסים כדי להכיל שליש סיבוב מלא או 120° של סיבוב כדי לאפשר אינטראקציה בין שלושה helices מערך משולש. כמו כן, שלא כמו מוטיבים קודמים של SST, כל SST מכיל רק 2 תחומים, ויוצר ביעילות מבנה חד-ממדי דמוי רצועת הכלים העוטף ליצירת צרור שלוש סלילים (איור 1C). כל אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים משתנה ב-1, 4 ו-8 המיקומים כדי להבטיח חלוקה במים אחידים של קבוצות מיני-PEG במוטיב SST הכולל. בנוסף, בתוך המוטיב ישנם שני סוגים של אוליגומרים: גדילים "רציפים" הקיימים על סליל יחיד וגדילי "קרוסאובר" פורשים סליל (איור 1D). בנוסף, אוליגומרים P8 ו- P6 מסומנים עם Cy3 פלואורסצנטי (כוכב ירוק) וביוטין(אליפסה צהובה),בהתאמה ( איור 1D ), כדי לאפשר זיהוי של היווצרות מבנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסך הכל, מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סלילים באמצעות השלמה מתוכנתת של כל תחום בודד לתחום המתאים על אוליגומר שכן (איור 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

האסטרטגיות הנוכחיות ב- DNA וננוטכנולוגיה של RNA מאפשרות הרכבה עצמית של מגוון ננו-מבנים של חומצות גרעין במדיה מימית או hydrated באופן משמעותי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים בניית ארכיטקטורות ננופייבר בתערובות ממס אורגניות באמצעות הרכבה עצמית של אריחי חומצת פפטיד (γPNA) הניתנים לטיפול ייחודי, חד-תקעים, שעברו שינוי גמא. כל אריח חד-תקע (SST) הוא אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים המורכב משני תחומים מודולריים שרשור של 6 בסיסים כל אחד. כל תחום יכול להיקשר לתחום משלים הדדית נוכח על גדילים שכנים באמצעות השלמה מתוכנתת כדי ליצור nanofibers שיכול לגדול מיקרונים באורך. מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סליל. בניגוד לננו-מבנים אנלוגיים של דנ"א, אשר יוצרים מבנים קוטר-מונודיספרז, מערכות γPNA אלה יוצרות ננו-פייברים המארזים לאורך רוחבם במהלך הרכבה עצמית בתערובות ממס אורגניות. פרוטוקולי הרכבה עצמית המתוארים כאן ולכן כוללים גם פעילי שטח קונבנציונליים, נתרן דודצ'יל סולפט (SDS), כדי להפחית את השפעות הצרור.

הפרוטוקולים שנדונו בסעיפים לעיל מתארים את העיצוב של מוטיב SST מותאם של ננו-פייברים DNA עבור הדור החזק של מבני nanofibers בהרכבה עצמית באמצעות אוליגומרים γPNA מרובים, ברורים. סעיף זה מתאר את הפרשנות של נתונים המתקבלים מהבילוי המוצלח של הפרוטוקולים המתוארים.
בעקבות הפרוטוקול המתואר ב...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

מאמר זה מספק פרוטוקולים עבור תכנון והרכבה עצמית של nanostructures מ אוליגומרים חומצת פפטיד שונה גמא תערובות ממיסים אורגניים.

הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

פרוטוקול חדשני זה מתאר את השימוש ברצפים נפרדים מרובים של חומצת הגרעין הסינתטית מחקה את גמא PNA כדי ליצור ננו-מבנים בתערובות ממס אורגניות ספציפיות. הראיה המתוארת כאן מראה את הצורך להתאים פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי ממיסים אורגניים שבהם פורסמו פרוטוקולים מועטים עד ללא פרוטוקולים. מתרגלים חדשים בטכניקה זו עשויים למצוא את זה קשה להתאים פרוטוקולים קיימים שפותחו עבור סביבות עשירות במים לסביבות עשירות בממס אורגני בגלל הנטייה של PNA ננו לצבור.התחל בהכנת מניות גמא PNA. לאחר קבלת גדילי גמא PNA מטוהרים בדירוג HPLC מיצרן מסחרי, יש להשתמש מחדש בכל גדיל במים שעברו דה-יונו ל-300 ריכוזי מיקרומולרים. לאחסן את PNAs גמא במינוס 20 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים.כאשר אתה מוכן לבצע הרכבה עצמית, הכן דגימות אצווה Anneal ב- 75%DMSO, 75%DMF ו- 40%1, 4-דיוקסן. ראשית, להכין 20 substocks micromolar של כל אוליגומר על ידי aliquoting 0.67 microliters מן המניה העיקרית והוספת מים deionized עבור נפח סופי של 10 microliters. הוסף מיקרוליטר אחד של כל אוליגומר מ 20 substocks micromolar לצינור PCR 200 מיקרוליטר, אשר יגיע לנפח כולל של תשעה microliters עבור תשעה אוליגומרים.הוסף 30 מיקרוליטרים של DMSO או DMF נטולי מים עם מיקרוליטר אחד נוסף של מים deionized עבור נפח סופי של 40 microliters. כדי להכין את 40%1, אצווה 4-דיוקסן, להוסיף 16 microliters של 1, 4-דיוקסן ולהביא את הנפח ל 40 microliters עם מים deionized. Anneal הדגימות במשך 22.5 שעות בקירור רוכב אופניים תרמי מ 90 עד 20 מעלות צלזיוס.בדרך כלל, טמפרטורות נמסות המתקבלות עבור שני אוליגומר ושלוש תת-קבוצות גמא PNA אוליגומריות נמצאות בטווח של 40 עד 70 מעלות צלזיוס עבור תנאי ממס שונים. תכנת את העגל התרמי לפי הוראות כתב היד. לאחר חישול הושלם, דגימות ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 24 שעות לפני האפיון.הפוך תא לחות מתיבת טיפים פיפטה ריקה על ידי מילוי התיבה עם כחמישה מיליליטר של מים. הכינו דילול פי 20 של קנודיה מסחרית זמינה של 2% באטיל אצטט עם ממס אצטט איסואמיל כדי ליצור את פתרון הניטרוסלוז. השתמש פינצטה לטבול כיסוי לתוך פתרון nitrocellulose ולאפשר לו להתייבש באוויר, ולאחר מכן להפוך תא זרימה מתוך מגלשת מיקרוסקופ, שתי רצועות סרט דו צדדי, ואת כיסוי מצופה nitrocellulose.הכן את פתרון BSA ביוטין על ידי שקילה מיליגרם אחד של ביוטין BSA והמסתו במיליליטר אחד של PBS. פיפטה 15 מיקרוליטרים של הביוטין BSA לתוך ערוץ הזרימה בזווית ולהדגיר אותו במשך שתיים עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. מכה 15 microliters של חיץ לשטוף, אשר מורכב מיליגרם אחד של BSA במיליליטר אחד של PBS, לתוך התעלה לשטוף את עודף ביוטין BSA, ולאחר מכן להעביר את פני השטח על ידי דגירה ערוץ הזרימה במשך שתיים עד ארבע דקות בתא לח.למדוד 0.5 מיליגרם של סטרפטבידין ומיליגרם אחד של BSA, ואז להמיס את שניהם במיליליטר אחד של PBS. פיפטה 15 microliters של פתרון סטרפטבידין לתוך ערוץ הזרימה ולשים אותו בתא לח במשך שתיים עד ארבע דקות ולשטוף את התעלה על ידי זורם 15 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, זרימה 15 microliters של אצווה annealed של אוליגומרים גמא PNA בתא לח, ולאחר מכן לשטוף את nanostructures מאוגד על ידי זורם 15 microliters של טרולוקס מילימולר אחד באותו הרכב ממס כמו nanostructures.העבר את ערוץ הזרימה למחזיק השקופית ודמיין אותו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בהדמיית TIRF, יעד טבילת שמן פי 60 וזכוכית מגדלת פי 1.5. סרוק את ערוץ הזרימה בהגדלה של פי 60 או 90 בעת ניטור ערוץ Cy3. הכן 20 ו 6% מניות SDS על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן anneal אוליגומרים גמא PNA על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של כל 20 אוליגומר מיקרומולרי לצינור PCR 200 מיקרוליטר.הוסף 30 מיקרוליטרים של DMSO נטול מים ומיקרוליטר אחד של 6%או 20% SDS לצינורות PCR לנפח סופי של 40 מיקרוליטרים, מה שיגרם לריכוז SDS סופי של 5.25 או 17.5 מילימולר בהתאמה. אנאל PNAs גמא בתרמוציקלר כפי שתואר קודם לכן. לאפיין ננו גמא PNA בנוכחות SDS באמצעות פרוטוקול TIRF או TEM.הדמיית TIRF של אוליגומרים גמא PNA annealmers annealed ב 75% DMSO הראו ארכיטקטורות מאורגנות היטב תוך חישול ב 75% DMF הביא ננו-מבנים בצורת spicule או מחט. מצב 40%1, 4-דיוקסאן הפיק קישוט דליל של ננו-מבנים סיסמנטיים. יתר על כן, הדגימות של צינורות גמא PNA שנוצרו ב 75% DMSO הפגינו מאגד של nanofibers ברזולוציות הגדלה גבוהה או ננוסקופיות במהלך הדמיית TEM.ניתוח כמותי של רוחב הננו-מבנים הראה רוחב חציוני של 16.3 ננומטר עם ערכים מרביים מעבר ל-80 ננומטר. אוליגומרים דנ"א Isosequential שהחליפו PNAs גמא רציפים יצרו מבנים ישרים filamentous ואילו החלפת PNAs גמא מוצלב לגרום מבנים stellate. הננו-מבנים שהוחלפו באוליגומרים של דנ"א רציפים היו ברוחב חציוני של כ-19 ננומטר.בריכוזי SDS גבוהים, ננופייברים PNA גמא גם לאמץ morphologies מרושתים מאוד בהשוואה ריכוזי micelle הקריטי שלה כאשר צפו עם הדמיה TIRF. הדמיית TEM מצביעה על כך שהרכבת גמא PNA ב-SDS 5.25 מילימולרית כוללת את ההפחתות המשמעותיות ביותר במאגמים מבניים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור לשמור על קומפוזיציות ממס כאמור בגלל הנטייה של nanostructures לצבור.שיטות אלה מעודדות מתרגלים להמשיך בדרכים אחרות שלא נחקרו של קומפוזיציות ממס שונות, פעילי שטח, וננו-מבנים אחרים של דנ"א PNA.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

ברציפות, עוררה digester אנאירובי המרת פסולת אורגנית אל תוך ביוגז: התקנת מערכת הפעלה בסיסית

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

מולקולריים Hydrogel זריקות וטעוני תרופות להזרקה מקומית צנתר לתוך לב החזיר

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

בדיית Thermoresponsive Hydrogels מתכלה-פיסיקליות מרובים באמצעות שחול תגובתי, מיקרופלואידיקה, הרכבה עצמית, Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...