Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation 1739308, dalla sovvenzione NSF CAREER 1944130 e dal numero di sovvenzione FA9550-18-1-0199 dell'Air Force Office of Science Research. Le sequenze γPNA erano un generoso dono del Dr. Tumul Srivastava di Trucode Gene Repair, Inc. Vorremmo ringraziare il Dr. Erik Winfree e il Dr. Rizal Hariadi per le loro utili conversazioni sul codice MATLAB di DNA Design Toolbox. Ringraziamo anche Joseph Suhan, Mara Sullivan e il Center for Biological Imaging per la loro assistenza nella raccolta dei dati TEM.

1. Progettazione della sequenza γPNA
<ol><li>Scarica la DNA Design Toolbox22 sviluppata dal Winfree Lab al Caltech23 nella cartella contenente script di programmazione per la progettazione di sequenze.</li>
	<li>All'interno di tale cartella di progettazione della sequenza, aprire un linguaggio di programmazione di quarta generazione compatibile con l'estensione di file ".m", quindi aggiungere la cartella "DNAdesign" scaricata in precedenza al percorso utilizzando il coma...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Questo articolo si concentra sull'adattamento e il miglioramento dei protocolli di nanotecnologia degli acidi nucleici esistenti verso miscele di solventi organici. I metodi qui descritti si concentrano sulle modifiche e sulla risoluzione dei problemi all'interno di uno spazio sperimentale definito di solventi organici aprotici polari selezionati. Esiste ancora un potenziale inesplorato per altri protocolli consolidati di nanotecnologia dell'acido nucleico da adattare all'interno di questo spazio. Ciò potrebbe migliorar...

Costruzione di successo di numerose nanostrutturecomplesse1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati realizzati utilizzando naturalmente in opere precedenti sono stati mostrati acidi nucleici presenti come DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12. Tuttavia, gli acidi nucleici presenti in natura subiscono cambiamenti conformazionali elicoidali duplex o hanno ridotto le condizioni termiche nelle miscele di solventiorganici 13,14.
In precedenza, il nostro laboratorio ha segnalato un metodo per la costruzione di nanofibre a 3 eliche utilizzando imitazioni dell'acido nucleico sintetico modificato in posizione gamma chiamate acidi nucleici gamma-peptidici (γPNA)15 (Figura 1A). La necessità di tale sviluppo e le potenziali applicazioni dell'acido nucleico sintetico imitano la PNA è stata discussanel campo 16,17. Abbiamo dimostrato, attraverso un adattamento della strategia di piastrella mono-filamento (SST) presentata per le nanostrutture di DNA18,19,20, che 9 oligomeri γPNA sequenzialmente distinti possono essere progettati per formare nanofibre a 3 eliche in miscele di solventi organici aprotici polari selezionati come DMSO e DMF. Gli oligomeri γPNA sono stati ordinati commercialmente con modifiche del glicole (R)-dietilenico (mini-PEG) in tre posizioni γ (1, 4 e 8 posizioni di base) lungo ogni oligomero a 12 basi sulla base di metodi pubblicati da Sahu et al. 21 Queste modifiche gamma causano la pre-organizzazione elicoidica associata alla maggiore affinità di legame e stabilità termica di γPNA rispetto alla PNA non modificata.
Questo articolo è un adattamento del nostro lavoro riportato in cui studiamo gli effetti della soluzione solvente e della sostituzione con il DNA sulla formazione di nanostrutture a base di γPNA15. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire descrizioni dettagliate del progetto e protocolli dettagliati per metodi adattati ai solventi che sono stati sviluppati per l'auto-assemblaggio e la caratterizzazione della nanofibra γPNA. Così, introduciamo prima la strategia modulare SST, una piattaforma generale per la progettazione di nanostrutture utilizzando l'acido nucleico sintetico che imita la PNA.
Il passo elicoiale per i duplex PNA è stato segnalato per essere di 18 basi per turno rispetto ai duplex del DNA, che subiscono un turno ogni 10,5 basi(Figura 1B). Pertanto, la lunghezza del dominio degli SST γPNA dimostrati è stata impostata su 6 basi per ospitare un terzo di un giro completo o 120 ° di rotazione per consentire l'interazione tra tre eliche triangolamente.e. Inoltre, a differenza dei precedenti motivi SST, ogni SST contiene solo 2 domini, creando efficacemente una struttura a nastro 1-dimensionale che avvolge per formare un fascio a tre eliche (Figura 1C). Ogni oligomero γPNA a 12 basi viene modificato in gamma nelle posizioni 1, 4 e 8 per garantire una distribuzione uniforme dei gruppi mini-PEG attraverso il motivo SST complessivo. Inoltre, all'interno del motivo, ci sono due tipi di oligomeri: fili "contigui" che esistono su una singola elica e fili "crossover" che si estendono sull'elica (Figura 1D). Inoltre, gli oligomeri P8 e P6 sono etichettati rispettivamente con Cy3 fluorescente (stella verde) e biotina (ovalegiallo), (Figura 1D),per consentire il rilevamento della formazione della struttura utilizzando la microscopia a fluorescenza. Complessivamente, il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche attraverso la complementarità programmata di ogni singolo dominio al dominio corrispondente su un oligomero vicino (Figura 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Le attuali strategie nella nanotecnologia del DNA e dell'RNA consentono l'auto-assemblaggio di una varietà di nanostrutture di acido nucleico in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati. In questo articolo, descriviamo protocolli dettagliati che consentono la costruzione di architetture in nanofibra in miscele di solventi organici attraverso l'auto-assemblaggio di piastrelle di acido nucleico peptidico (γPNA) univocamente adattabili, a singolo filamento e modificate gamma. Ogni piastrella a singolo filamento (SST) è un oligomero γPNA a 12 basi composto da due domini modulari concatenati di 6 basi ciascuno. Ogni dominio può legarsi a un dominio reciprocamente gratuito presente sui filamenti vicini utilizzando la complementarità programmata per formare nanofibre che possono crescere fino a micron in lunghezza. Il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche. In contrasto con le analoge nanostrutture del DNA, che formano strutture monodisperse di diametro, questi sistemi γPNA formano nanofibre che si raggruppano lungo le loro larghezze durante l'auto-assemblaggio in miscele di solventi organici. I protocolli di auto-assemblaggio qui descritti includono quindi anche un tensioattiva convenzionale, sodio dodecil solfato (SDS), per ridurre gli effetti di raggruppamento.

I protocolli discussi nelle sezioni precedenti descrivono la progettazione di un motivo SST adattato dalle nanofibre di DNA per la robusta generazione di strutture di nanofibre auto-assemblate utilizzando oligomeri γPNA multipli e distinti. Questa sezione descrive l'interpretazione dei dati ottenuti dalla ricreazione riuscita dei protocolli descritti.
Seguendo il protocollo descritto nella sezione 5 per l'imaging TIRF di campioni di oligomeri γPNA ricotti in DMSO al 75%: H2O (v/v)...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Questo articolo fornisce protocolli per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture da oligomeri di acido nucleico peptidico modificati gamma in miscele di solventi organici.

Auto-assemblaggio di acidi nucleici peptidici modificati gamma in nanostrutture complesse in miscele di solventi organici

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Questo nuovo protocollo descrive l'uso di più sequenze distinte dell'acido nucleico sintetico che imitano la gamma PNA per formare nanostrutture in specifiche miscele di solventi organici. I test qui descritti mostrano la necessità di adattare i protocolli di nanotecnologia dell'acido nucleico esistenti ai solventi organici dove sono stati pubblicati pochi o nessun protocollo. I professionisti nuovi a questa tecnica potrebbero avere difficoltà ad adattare i protocolli esistenti sviluppati per ambienti ricchi di acquosi in ambienti organici ricchi di solventi a causa della propensione del nanomateriale PNA ad aggregarsi.Inizia preparando le scorte di PNA gamma. Dopo aver ottenuto trefoli gamma PNA purificati di grado HPLC da un produttore commerciale, rimescolare ogni filamento in acqua deionizzata a 300 concentrazioni micromolare. Conservare i PNA gamma a meno 20 gradi Celsius per un massimo di diversi mesi.Quando si è pronti per eseguire l'auto-assemblaggio, preparare campioni di batch ricotto in 75%DMSO, 75%DMF e 40%1, 4-diossano. In primo luogo, preparare 20 sottostock micromolari di ogni oligomero aliquotando 0,67 microlitri dallo stock principale e aggiungendo acqua deionizzata per un volume finale di 10 microlitri. Aggiungere un microlitro di ogni oligomero dai 20 sottostock micromolari a un tubo PCR da 200 microlitri, che arriverà a un volume totale di nove microlitri per nove oligomeri.Aggiungere 30 microlitri di DMSO anidro o DMF con un microlitro aggiuntivo di acqua deionizzata per un volume finale di 40 microlitri. Per preparare il lotto 40%1, 4-diossano, aggiungere 16 microlitri da 1, 4-diossano e portare il volume a 40 microlitri con acqua deionizzata. Ricottura dei campioni per 22,5 ore in un raffreddamento a ciclo termico da 90 a 20 gradi Celsius.Tipicamente, le temperature di fusione ottenute per due sottoinsiemi di oligomero e tre oligomeri gamma PNA si trovano nell'intervallo da 40 a 70 gradi Celsius per diverse condizioni del solvente. Programmare il ciclore termico secondo le indicazioni manoscritte. Una volta completata la ricottura, i campioni possono essere conservati a quattro gradi Celsius per 12-24 ore prima della caratterizzazione.Creare una camera di umidità da una scatola vuota di punte di pipetta riempiendo la scatola con circa cinque millilitri di acqua. Preparare una diluizione di 20 volte il collodio del 2% disponibile in commercio in acetato di amile con solvente acetato di isoamile per creare la soluzione di nitrocellulosa. Utilizzare una pinzetta per immergere un coverslip nella soluzione di nitrocellulosa e consentirgli di asciugare all'aria, quindi fare una camera di flusso da uno scivolo del microscopio, due strisce di nastro a doppia lato e il coverslip rivestito di nitrocellulosa.Preparare la soluzione di biotina BSA pesando un milligrammo di biotina BSA e scioglierla in un millilitro di PBS. Pipettare 15 microlitri della biotina BSA nel canale di flusso con un angolo e incubarlo per due o quattro minuti a temperatura ambiente nella camera umidificata. Soffiare 15 microlitri del tampone di lavaggio, che consiste in un milligrammo di BSA in un millilitro di PBS, nel canale per lavare via la biotina in eccesso BSA, quindi passivare la superficie incubando il canale di flusso per due o quattro minuti nella camera umidificata.Misurare 0,5 milligrammi di streptavidina e un milligrammo di BSA, quindi sciogliere entrambi in un millilitro di PBS. Pipettare 15 microlitri della soluzione di streptavidina nel canale di flusso e posizionarlo nella camera umidificata per due o quattro minuti e lavare il canale scorrono 15 microlitri di tampone di lavaggio. Successivamente, scorrono 15 microlitri del lotto ricotto degli oligomeri gamma PNA nella camera umidificata, quindi lavano le nanostrutture non unite fluendo 15 microlitri di un Trolox millimolare nella stessa composizione solvente delle nanostrutture.Trasferire il canale di flusso al porta scorrevole e imagerlo con un microscopio a fluorescenza dotato di imaging TIRF, un obiettivo di immersione dell'olio 60X e una lente d'ingrandimento 1.5X. Scansiona il canale di flusso con ingrandimento 60 o 90X durante il monitoraggio del canale Cy3. Preparare scorte di SDS 20 e 6% secondo le indicazioni manoscritte, quindi ricotturare gli oligomeri gamma PNA aggiungendo un microlitro di ogni oligomero micromolare 20 a un tubo PCR da 200 microliter.Aggiungere 30 microlitri di DMSO anidro e un microlitro del 6% o del 20% SDS ai tubi PCR per un volume finale di 40 microlitri, che si tradurrà in una concentrazione finale di SDS rispettivamente di 5,25 o 17,5 millimolare. Ricottura dei PNA gamma nel termociclo come descritto in precedenza. Caratterizzare le nanostrutture gamma PNA in presenza di SDS utilizzando il protocollo TIRF o TEM.L'imaging TIRF di oligomeri gamma PNA ricotto nel 75%DMSO ha mostrato architetture ben organizzate mentre la ricottura nel 75%DMF ha portato a nanostrutture a forma di spicule o ad ago. La condizione del 40%1, 4-diossano ha prodotto una decorazione sparsa di nanostrutture filamentose. Inoltre, i campioni di nanotubi gamma PNA formati nel 75%DMSO hanno dimostrato l'aggregazione di nanofibre ad alto ingrandimento o risoluzioni nanoscopiche durante l'imaging TEM.L'analisi quantitativa della larghezza delle nanostrutture ha mostrato una larghezza mediana di 16,3 nanometri con valori massimi oltre gli 80 nanometri. Gli oligomeri di DNA isosequenziali che hanno sostituito i PNA gamma contigui formavano strutture filamentose dritte mentre la sostituzione dei PNA gamma crossover si traducono in strutture stellate. Le nanostrutture che sono state sostituite con oligomeri di DNA contigui avevano larghezze medie di circa 19 nanometri.Ad alte concentrazioni di SDS, le nanofibre gamma PNA adottano anche morfologie altamente in rete rispetto alle sue concentrazioni critiche di micelle se viste con l'imaging TIRF. L'imaging TEM indica che l'assemblaggio di PNA gamma in SDS da 5,25 millimolari ha le riduzioni più sostanziali nell'aggregazione strutturale. Quando si tenta questo protocollo, è importante ricordare di mantenere le composizioni del solvente come menzionato a causa della propensione delle nanostrutture ad aggregarsi.Questi metodi incoraggiano i praticanti a perseguire altre strade inesplorate di diverse composizioni di solventi, tensioattivi e altre nanostrutture di DNA PNA.

Research

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Ricerca

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