Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

이 작품은 국립 과학 재단 보조금 1739308, NSF 경력 보조금 1944130 및 공군 과학 연구 보조금 번호 FA9550-18-1-0199에 의해 부분적으로 지원되었습니다. γPNA 서열은 트루코드 유전자 수리, Inc.의 투물 스리바스타바 박사로부터 받은 관대한 선물이었습니다. 우리는 DNA 디자인 툴박스 MATLAB 코드에 대한 그들의 유용한 대화에 대한 에릭 윈프리 박사와 리잘 하리아디 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 조셉 수한, 마라 설리반 과 생물학적 이미징 센터가 TEM 데이터 수집에 도움을 준 것에 감사드립니다.

1. γPNA 서열 설계
<ol><li>Caltech23의 Winfree Lab에서 개발한 DNA 디자인 툴박스22를 시퀀스 설계를 위한 프로그래밍 스크립트가 포함된 폴더에 다운로드합니다.</li>
	<li>해당 시퀀스 디자인 폴더 내에서 파일 확장 ".m"과 호환되는 4세대 프로그래밍 언어를 열고 다음 명령을 사용하여 이전에 다운로드한 "DNAdesign" 폴더를 경로에 추가합니다. >> 애드패스 DNADESIGN</li>
	<li...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

이 문서는 기존 핵산 나노 기술 프로토콜을 유기 용매 혼합물에 적응하고 개선하는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 방법은 선택극성 아프로틱 유기 용매의 정의된 실험 공간 내에서 수정 및 문제 해결에 중점을 둡니다. 다른 확립 된 핵산 나노 기술 프로토콜이 공간 내에서 적응 할 수있는 아직 미개척 잠재력이 있다. 이는 일반적으로 유사한 유기용매(25,2...

수많은 복잡한나노구조1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12의 수성 또는 실질적으로 수화된 세포의 성공적인 시공은 DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 및 RNA11,12와 같은 자연발생적인 핵산을 사용하여 이루어진 수성 또는 실질적으로 수화된 매체로 나타났다. 그러나, 자연적으로 발생하는 핵산은 이중 백액 형성 변화를 겪거나 유기 용매혼합물(13,14)에서열성 능력을 감소시키는 것이다.
이전에는 감마-펩타이드 핵산(γPNA)15(도 1A)라고불리는 감마 위치 변형 합성 핵산 모방을 이용한 3-나선 나노섬유의 시공을 향한 방법을 보고하였다. 이러한 개발 및 합성 핵산 모방 PNA의 잠재적 인 응용에 대한 필요성은 필드 내에서 논의되었다16,17. DNA나노구조(18,19,20)에제시된 단일 가닥 타일(SST) 전략의 적응을 통해, 9개의 순차적으로 구별되는 γPNA 올리고머는 DMSO 및 DMF와 같은 일부 극성 아프로틱 유기 용매 혼합물에서 3-나선 나노섬유를 형성하도록 설계될 수 있음을 보여주었다. γPNA 올리고머는 사후 등에서공표한 방법에 기초하여 각각의 12베이스 올리고머를 따라 3개의 γ 위치(1, 4 및 8 기저 위치)에서 (R)-diethylene 글리콜(mini-PEG)을 수정하여 상업적으로 주문하였다. 21 이러한 감마 변형은 수정되지 않은 PNA에 비해 γPNA의 더 높은 결합 친화성 및 열 안정성과 관련된 헬리칼 사전 조직을 유발합니다.
본 기사는 우리가 γPNA 기반 나노 구조의 형성에 DNA와 용매 용액 및 대체의 효과를 조사하는 우리의보고 된 작업의적응이다 (15. 이 문서의 목적은 설계에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 γPNA 나노 섬유의 자체 조립 및 특성화를 위해 개발 된 용매 적응 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 따라서, 먼저 합성 핵산을 이용한 나노구조 설계를 위한 일반적인 플랫폼인 모듈식 SST 전략을 소개한다.
PNA 이중제의 헬리칼 피치는 10.5베이스(도1B)당1회전을 겪는 DNA 듀플렉스에 비해 턴당 18개의 베이스로 보고되었다. 따라서, 시연된 γPNA SST의 도메인 길이는 3개의 삼각형 배열 헬리액 사이의 상호 작용을 가능하게 하기 위해 전체 회전의 1/3 또는 120° 회전의 1/3을 수용하기 위해 6개의 베이스로 설정되었다. 또한, 이전 SST 모티브와 달리 각 SST에는 2개의 도메인만 포함되어 있어 3개의 나선 번들(그림1C)을형성하기 위해 랩하는 1차원 리본 모양구조를 효과적으로 만듭니다. 각 12기 γPNA 올리고머는 1, 4 및 8 위치에서 감마 변형되어 전체 SST 모티프에 걸쳐 미니 PEG 그룹의 균일간격 분포를 보장합니다. 또한, 모티프 내에서, 올리고머의 두 가지 유형이 있다: 단일 나선과 나선 에 걸쳐 "크로스 오버"가닥에 존재하는 "연속"가닥(그림 1D). 또한, 올리고머 P8 및 P6는 형광 현미경을 이용한 구조 형성의 검출을 가능하게 하기 위해각각 형광 Cy3(녹색 별) 및 비오틴(yellow oval)으로 표시되어 있다. SST 모티프는 9개의 총 올리고머로 이루어져 각 개별 도메인의 프로그래밍된 보완성을 통해 인접한 올리고머(그림1E)에해당하는 도메인에 대한 3-나선 나노섬유의 형성을 가능하게 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

DNA 및 RNA 나노 기술의 현재 전략은 수성 또는 실질적으로 수화 된 매체에서 다양한 핵산 나노 구조의 자체 조립을 가능하게한다. 본 기사에서는 유일무이한 주소 지정, 단일 가닥, 감마 변형 펩타이드 핵산(γPNA) 타일의 자체 조립을 통해 유기 용매 혼합물에서 나노섬유 아키텍처를 시공할 수 있는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 각 단일 가닥 타일(SST)은 각각 6개의 베이스의 2개의 결합된 모듈형 도메인으로 구성된 12기 γPNA 올리고머이다. 각 도메인은 프로그래밍된 보완성을 사용하여 인접한 가닥에 존재하는 상호 무료 도메인에 결합하여 길이의 미크론으로 성장할 수 있는 나노 섬유를 형성할 수 있습니다. SST 모티프는 3-나선 나노 섬유의 형성을 가능하게하기 위해 9 총 올리고머로 만들어집니다. 직경 단분산 구조를 형성하는 유사한 DNA 나노 구조와 는 달리, 이러한 γPNA 시스템은 유기 용매 혼합물에서 자체 조립 중에 폭을 따라 번들되는 나노 섬유를 형성합니다. 따라서 여기에 설명된 자가 조립 프로토콜에는 번들 효과를 줄이기 위해 기존의 계면활성제인 도데실 설페이트 나트륨(SDS)도 포함됩니다.

위의 섹션에서 논의된 프로토콜은 다중, 뚜렷한 γPNA 올리고머를 사용하여 자체 조립 된 나노 섬유 구조의 견고한 생성을 위한 DNA 나노 섬유에서 적응된 SST 모티프의 디자인을 설명합니다. 이 섹션에서는 설명된 프로토콜의 성공적인 재현에서 얻은 데이터의 해석을 설명합니다.
75% DMSO에서 아닐래온 γPNA 올리고머의 TIRF 영상에 대한 제5항에 기재된 프로토콜에 따라:H2O...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

이 새로운 프로토콜은 특정 유기 용매 혼합물에서 나노 구조를 형성하기 위해 합성 핵산 모방 감마 PNA의 여러 고유 서열의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 분석법은 프로토콜이 거의 또는 전혀 없는 유기 용매를 향해 기존의 핵산 나노 기술 프로토콜을 적응할 필요성을 보여줍니다. 이 기술에 새로운 실무자는 나노 물질 PNA의 성향으로 인해 수성이 풍부한 환경을 위해 개발 된 기존 프로토콜을 응집하기 어려울 수 있습니다.감마 PNA 주식을 준비하여 시작합니다. 상업 제조업체로부터 HPLC 등급 정제 감마 PNA 가닥을 얻은 후, 300 마이크로 몰라 농도로 탈이온 된 물에 각 가닥을 다시 중단합니다. 감마 PN을 섭씨 영하 20도까지 최대 몇 개월 동안 보관하십시오.자체 조립을 수행할 준비가 되면 75%DMSO, 75%DMF 및 40%1, 4-다이옥산으로 막음 배치 샘플을 준비합니다. 먼저, 메인 스톡에서 0.67 마이크로리터를 알리싱하고 10마이크로리터의 최종 부피에 대한 탈이온화된 물을 추가하여 각 올리고머의 20개의 마이크로몰라 서브스톡을 준비한다. 20 마이크로 몰러 서브 스톡에서 각 올리고머의 마이크로 리터 를 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 추가하면 9 개의 올리고머에 대한 총 9 마이크로 리터가 제공됩니다.40 마이크로리터의 최종 부피에 대한 deionized 물의 추가 1 마이크로 리터와 무수 DMSO 또는 DMF의 30 마이크로 리터를 추가합니다. 40%1, 4-디옥산 배치를 준비하려면 1, 4-디옥산16 마이크로리터를 추가하고 탈이온화된 물로 40 마이크로리터에 부피를 가져옵니다. 90에서 20 °C까지 냉각 열 사이클러에서 22.5 시간 동안 샘플을 음안합니다.일반적으로, 2개의 올리고머와 3개의 올리고머 감마 PNA 서브세트에 대해 얻어진 용융 온도는 다른 용매 조건에 대해 섭씨 40~70도범위에 속한다. 원고 의 지시에 따라 열 사이클러를 프로그래밍합니다. 어닐링이 완료되면 특성화 전에 12~24시간 동안 샘플을 섭씨 4도에 저장할 수 있습니다.빈 파이펫 팁 박스에서 약 5밀리리터의 물로 상자를 채우십시오. 니트로셀룰로오스 용매를 생성하기 위해 이소아밀 아세테이트 용매와 아밀 아세테이트에서 20배의 상용화 가능한 2%콜로디온을 준비한다. 핀셋을 사용하여 니트로셀룰로오스 용액에 커버슬립을 담근 다음 공기 건조를 허용한 다음 현미경 슬라이드, 양면 테이프 스트립 2개, 니트로셀룰로오스 코팅 커버슬립에서 유동 챔버를 만듭니다.비오틴 BSA 의 1 밀리그램을 계량하고 PBS의 1 밀리리터로 용해하여 비오틴 BSA 솔루션을 준비하십시오. 피펫 15 비오틴 BSA의 마이크로리터는 비스듬히 유량 채널로 들어가 가습 챔버의 실온에서 2~4분 동안 배양한다. PBS의 1 밀리리터에서 BSA 1밀리그램으로 구성된 세척 버퍼의 15 마이크로리터를 채널로 날려 여분의 비오틴 BSA를 씻어내고, 가습 챔버에서 2~4분 동안 유동 채널을 배양하여 표면을 통과시한다.측정 0.5 스트렙타비딘의 밀리 그램과 BSA의 1 밀리그램, 다음 PBS의 1 밀리 리터에 모두 용해. 스테프타비딘 용액의 피펫 15 마이크로리터는 유동 채널에 넣고 가습 챔버에 2~4분 동안 배치하고 15마이크로리터의 세척 버퍼를 흐르고 채널을 세척한다. 다음으로, 가습 챔버에서 감마 PNA 올리고머의 아닐배치의 15마이크로리터를 응모한 다음, 나노구조와 동일한 용매 조성물에서 1밀리알러 트룰록의 15마이크로리터를 흐르고, 비바운드 나노구조를 세척한다.TIRF 이미징, 60X 오일 침지 목표 및 1.5배 확대기가 장착된 형광 현미경으로 플로우 채널을 슬라이드 홀더로 전송하여 이미지를 이미지화합니다. Cy3 채널을 모니터링하는 동안 60배율 또는 90X 배율로 유동 채널을 스캔합니다. 원고 방향에 따라 20 및 6 %의 SDS 주식을 준비한 다음 20 마이크로 리터 PCR 튜브에 각 20 마이크로 몰리어 올리고머의 마이크로 리터 1 개를 추가하여 감마 PNA 올리고머를 음멸합니다.30개의 무수DMSO와 6% 또는 20%의 마이크로리터를 PCR 튜브에 추가하여 40마이크로리터의 최종 부피를 차지하며, 이로 인해 최종 SDS 농도가 각각 5.25 또는 17.5밀리미터가 생성됩니다. 이전에 설명한 대로 열순환기의 감마 PNA를 음닐. TIRF 또는 TEM 프로토콜을 사용하여 SDS가 있는 감마 PNA 나노 구조를 특성화한다.75%DMSO에서 아닐링된 감마 PNA 올리고머의 TIRF 이미징은 잘 조직된 아키텍처를 보였으며 75%DMF의 아닐링은 경피 모양 또는 바늘 모양의 나노 구조로 이어졌습니다. 40%1, 4-디옥산 상태는 필라멘트 나노 구조의 희소한 장식을 생산했다. 더욱이, 75%DMSO로 형성된 감마 PNA 나노튜브의 샘플은 TEM 이미징 동안 높은 배율 또는 나노스코프 해상도에서 나노섬유의 번들링을 시연하였다.나노 구조의 폭의 정량적 분석은 80 나노미터를 초과하는 최대 값을 가진 16.3 나노미터의 중앙값을 나타냈다. 인접한 감마 PNA를 대체한 이소결과 DNA 올리고머는 직선 필라멘트 구조를 형성한 반면 크로스오버 감마 PNA를 교체하면 스텔레이트 구조가 발생합니다. 인접한 DNA 올리고머로 대체된 나노 구조는 약 19 나노미터의 중앙폭을 가졌다.높은 SDS 농도에서 감마 PNA 나노 섬유는 TIRF 이미징으로 볼 때 중요한 미셀 농도에 비해 고도로 네트워크된 형태를 채택합니다. TEM 이미징은 5.25 밀리머 SDS의 감마 PNA 조립이 구조적 번들에서 가장 실질적인 감소를 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때, 나노 구조의 경향 때문에 거재되는 용매 조성물을 유지하는 것이 중요하다.이러한 방법은 실무자가 다른 용매 조성물, 계면 활성제 및 기타 PNA DNA 나노 구조의 다른 미개척 길을 추구하도록 장려합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

연구

생체공학

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

높은 명령으로 Nanosheets에 Peptoid 폴리머 및 자기 조립의 고체 상 합성 Submonomer

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

시스템 설치 및 기본 작업 : Biogas로 유기 폐기물을 변환하는 혐기성 소화조를 지속 - 흔들

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

자기 조립, 분해 Thermoresponsive Hydrogels 반응 압출, 마이크로, 통해 여러 길이 가늠 자에를 조작 하 고 전기

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...