Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência 1739308, bolsa NSF CAREER 1944130 e pelo Escritório da Força Aérea de Pesquisa científica número FA9550-18-1-0199. As sequências γPNA foram um presente generoso do Dr. Tumul Srivastava da Trucode Gene Repair, Inc. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Erik Winfree e ao Dr. Rizal Hariadi por suas conversas úteis sobre o código MATLAB da Caixa de Ferramentas de DESIGN de DNA. Gostaríamos também de agradecer a Joseph Suhan, Mara Sullivan e ao Centro de Imagem Biológica por sua assistência na coleta de dados TEM.

1. design de sequência γPNA
<ol><li>Baixe a caixa de ferramentas de design de DNA22 desenvolvida pelo Winfree Lab na Caltech23 na pasta contendo scripts de programação para projetar sequências.</li>
	<li>Dentro dessa pasta de design de sequência, abra uma linguagem de programação de quarta geração compatível com a extensão de arquivo ".m", e adicione a pasta "DNAdesign" previamente baixada ao caminho usando o seguinte comando: >> addpath DNAdesign</li>
	<li...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Este artigo se concentra na adaptação e melhoria dos protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes para misturas orgânicas de solventes. Os métodos descritos aqui se concentram em modificações e solução de problemas dentro de um espaço experimental definido de solventes orgânicos apóticos polares selecionados. Ainda há potencial inexplorado para que outros protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico estabelecidos sejam adaptados dentro deste espaço. Isso poderia melhorar aplicações potenci...

Construção bem sucedida de numerosas nanoestruturas complexas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 em mídia aquosa ou substancialmente hidratada feita utilizando ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12 foi mostrado em trabalhos anteriores. No entanto, os ácidos nucleicos de ocorrência natural sofrem alterações conformais helical duplex ou têm estabilizações térmicas reduzidas nas misturas de solventes orgânicos13,14.
Anteriormente, nosso laboratório relatou um método para a construção de nanofibras de 3 hélices usando mímicas de ácido nucleico sintético modificadas de posição gama chamadas ácidos nucleíricos gama-peptídeos (γPNA)15 (Figura 1A). A necessidade de tal desenvolvimento e aplicações potenciais do ácido nucleico sintético imita pna tem sido discutida no campo16,17. Temos mostrado, através de uma adaptação da estratégia de azulejos mono-encalhados (SST) apresentada para nanoestruturas de DNA18,19,20, que 9 oligômeros γPNA sequencialmente distintos podem ser projetados para formar nanofibras de 3 hélices em misturas de solventes orgânicos aprotic polares selecionados, como DMSO e DMF. Os oligômeros γPNA foram ordenados comercialmente com modificações de (R)-dietileno glicol (mini-PEG) em três posições de γ (1, 4 e 8 posições-base) ao longo de cada oligômero de 12 bases com base em métodos publicados por Sahu et al. 21 Essas modificações gama causam a pré-organização helicoidal associada à maior afinidade de ligação e estabilidade térmica de γPNA em relação ao PNA não modificado.
Este artigo é uma adaptação do nosso trabalho relatado no qual investigamos os efeitos da solução solvente e substituição com DNA na formação de nanoestruturas baseadas em γPNA15. O objetivo deste artigo é fornecer descrições detalhadas do projeto, bem como protocolos detalhados para métodos adaptados a solventes que foram desenvolvidos para a auto-montagem e caracterização da nanofibra γPNA. Assim, introduzimos pela primeira vez a estratégia modular SST, uma plataforma geral para o design de nanoestrutura usando o ácido nucleico sintético imitar PNA.
O tom helicoidal para duplexes PNA foi relatado como sendo de 18 bases por turno em comparação com duplexes de DNA, que passam por uma curva por 10,5 bases(Figura 1B). Portanto, o comprimento de domínio dos SSTs γPNA demonstrados foi definido em 6 bases para acomodar um terço de uma curva completa ou 120° de rotação para permitir a interação entre três helices triangularmente dispostas. Além disso, ao contrário dos motivos SST anteriores, cada SST contém apenas 2 domínios, criando efetivamente uma estrutura de fita 1-dimensional que envolve para formar um feixe de três hélices(Figura 1C). Cada oligômero γPNA de 12 bases é modificado gama nas posições 1, 4 e 8 para garantir uma distribuição uniformemente espaçada de grupos mini-PEG em todo o motivo SST global. Além disso, dentro do motivo, existem dois tipos de oligômeros: fios "contíguos" que existem em uma única hélice e fios "crossover" de hélice(Figura 1D). Além disso, os oligômeros P8 e P6 são rotulados com Cy3 fluorescente (estrela verde) e biotina (oval amarelo),respectivamente (Figura 1D),para permitir a detecção da formação da estrutura usando microscopia de fluorescência. Ao todo, o motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices através da complementaridade programada de cada domínio individual ao domínio correspondente em um oligômero vizinho(Figura 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

As estratégias atuais em nanotecnologia de DNA e RNA permitem a auto-montagem de uma variedade de nanoestruturas de ácido nucleico em mídia aquosa ou substancialmente hidratada. Neste artigo, descrevemos protocolos detalhados que permitem a construção de arquiteturas de nanofibra em misturas de solventes orgânicos através da auto-montagem de telhas de nucleículos de peptídeos exclusivamente endereçadas, de fio único e gama modificadas (γPNA). Cada telha de fio único (SST) é um oligômero γPNA de 12 bases composto por dois domínios modulares concatenados de 6 bases cada. Cada domínio pode se ligar a um domínio mutuamente gratuito presente em vertentes vizinhas usando complementaridade programada para formar nanofibras que podem crescer até mícrons de comprimento. O motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices. Em contraste com nanoestruturas análogas de DNA, que formam estruturas monodispersas de diâmetro, esses sistemas γPNA formam nanofibras que se agrupam ao longo de suas larguras durante a auto-montagem em misturas orgânicas de solventes. Os protocolos de automontagem descritos aqui, portanto, também incluem um surfactante convencional, Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS), para reduzir os efeitos de agrupamento.

Os protocolos discutidos nas seções acima descrevem o desenho de um motivo SST adaptado de nanofibras de DNA para a geração robusta de estruturas de nanofibras auto-montadas usando múltiplos oligômeros γPNA. Esta seção descreve a interpretação dos dados obtidos a partir da recriação bem sucedida dos protocolos descritos.
Seguindo o protocolo descrito na seção 5 para imagem TIRF de amostras de oligômeros γPNA annealed em 75% DMSO: H2O (v/v) mais facilmente fornece ev...

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Este novo protocolo descreve o uso de múltiplas sequências distintas do ácido nucleico sintético imitar gamma PNA para formar nanoestruturas em misturas específicas de solventes orgânicos. Os ensaios aqui descritos mostram a necessidade de adaptar protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes em relação a solventes orgânicos onde pouco ou nenhum protocolo foi publicado. Os praticantes novos nesta técnica podem ter dificuldade em adaptar protocolos existentes desenvolvidos para ambientes ricos em ambientes orgânicos ricos em solventes devido à propensão do PNA nanomaterial a agregar.Comece preparando as ações gama PNA. Após a obtenção de fios de gama PNA purificados de grau HPLC de um fabricante comercial, resuspenda cada fio em água deionizada para 300 concentrações de micromolar. Armazene as PNAs gama a menos 20 graus Celsius por até vários meses.Quando estiver pronto para realizar o automontagem, prepare amostras de lote anneal em 75% DMSO, 75% DMF e 40%1, 4-dioxano. Primeiro, prepare 20 substocks micromolar de cada oligômero, aliquoting 0,67 microliters do estoque principal e adicionando água deionizada para um volume final de 10 microliters. Adicione um microliter de cada oligômero dos 20 subabas micromolares a um tubo PCR de 200 microliteres, que chegará a um volume total de nove microlitadores para nove oligômeros.Adicione 30 microliters de DMSO anidro ou DMF com um microliter adicional de água deionizada para um volume final de 40 microliters. Para preparar o lote 40%1, 4-dioxano, adicione 16 microliters de 1, 4-dioxano e leve o volume para 40 microliters com água deionizada. Ressuem as amostras por 22,5 horas em um cicloviário térmico esfriando de 90 a 20 graus Celsius.Tipicamente, as temperaturas de fusão obtidas para dois subconjuntos oligômeros e três subconjuntos oligômeros gama PNA estão na faixa de 40 a 70 graus Celsius para diferentes condições de solvente. Programe o cicloviário térmico de acordo com as instruções do manuscrito. Uma vez concluída a ressarização, as amostras podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas antes da caracterização.Faça uma câmara de umidade a partir de uma caixa vazia de pontas de pipeta enchendo a caixa com aproximadamente cinco mililitros de água. Prepare uma diluição 20 vezes disponível comercialmente em acetato de amilo com solvente de acetato de isoamíl para criar a solução de nitrocelulose. Use pinças para mergulhar uma mancha na solução de nitrocelulose e permitir que ela seque ao ar, em seguida, faça uma câmara de fluxo de um slide de microscópio, duas tiras de fita de dois lados e a tampa revestida de nitrocelulose.Prepare a solução biotina BSA pesando um miligrama de biotina BSA e dissolvendo-a em um mililitro de PBS. Pipeta 15 microliters da biotina BSA no canal de fluxo em um ângulo e incuba-lo por dois a quatro minutos à temperatura ambiente na câmara umidificada. Sopre 15 microlitadores do tampão de lavagem, que consiste em um miligrama de BSA em um mililitro de PBS, no canal para lavar o excesso de biotina BSA, em seguida, passivar a superfície incubando o canal de fluxo por dois a quatro minutos na câmara umidificada.Meça 0,5 miligramas de streptavidina e um miligrama de BSA, depois dissolva ambos em um mililitro de PBS. Pipeta 15 microliters da solução streptavidin no canal de fluxo e colocá-lo na câmara umidificada por dois a quatro minutos e lavar o canal fluindo 15 microliters de tampão de lavagem. Em seguida, flua 15 microlitadores do lote de oligômeros gama PNA na câmara umidificada, em seguida, lave as nanoestruturas desvinculadas fluindo 15 microlitadores de um Trolox mililitro na mesma composição de solventes que as nanoestruturas.Transfira o canal de fluxo para o suporte de slides e imagem-o com um microscópio de fluorescência equipado com imagem TIRF, um objetivo de imersão de óleo de 60X e uma lupa de 1,5X. Escaneie o canal de fluxo em ampliação de 60 ou 90X enquanto monitora o canal Cy3. Prepare 20 e 6% estoques de SDS de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, anneal os oligômeros gama PNA adicionando um microliter de cada 20 oligômeros micromolar a um tubo PCR de 200 microliter.Adicione 30 microliters de DMSO anidro e um microliter de 6%ou 20% SDS aos tubos PCR para um volume final de 40 microlitadores, o que resultará em uma concentração final de SDS de 5,25 ou 17,5 mililitros, respectivamente. Anneal o gamma PNAs no termociclador como descrito anteriormente. Caracterizar nanoestruturas gama PNA na presença de SDS utilizando o protocolo TIRF ou TEM.As imagens TIRF de oligômeros gama PNA encolhidos em 75%DMSO mostraram arquiteturas bem organizadas enquanto a ressarição em 75% DMF resultou em nanoestruturas em forma de espícula ou agulha. A condição de 40%1, 4-dioxano produziu uma decoração esparsa de nanoestruturas filamentosas. Além disso, as amostras de nanotubos gama PNA formados em 75% DMSO demonstraram agrupamento de nanofibras em altas ampliações ou resoluções nanoscópicas durante a imagem TEM.A análise quantitativa da largura das nanoestruturas mostrou uma largura mediana de 16,3 nanômetros com valores máximos além de 80 nanômetros. Os oligômeros de DNA isosequenciais que substituíram os PNAs gama contíguos formaram estruturas retas filamentosas, enquanto a substituição das PNAs de gama transversal resultam em estruturas estelares. As nanoestruturas que foram substituídas por oligômeros de DNA contíguos tinham larguras medianas de cerca de 19 nanômetros.Em altas concentrações de SDS, as nanofibras gama PNA também adotam morfologias altamente em rede em comparação com suas concentrações críticas de micela quando vistas com imagens TIRF. A imagem TEM indica que o conjunto gama PNA em SDS de 5,25 milimililar tem as reduções mais substanciais no agrupamento estrutural. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar de manter as composições solventes como mencionado devido à propensão das nanoestruturas a agregar.Esses métodos encorajam os praticantes a buscar outras avenidas inexploradas de diferentes composições de solventes, surfactantes e outras nanoestruturas de DNA PNA.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Continuamente agitada digestor anaeróbico para converter resíduos orgânicos em biogás: Configuração do Sistema e Operação Básica

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Um Supramolecular hidrogel injetável e carregado com a droga para a injeção local por cateter no coração de porco

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...