Name: self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда 1739308, грантом NSF CAREER 1944130 и грантом Управления научных исследований ВВС FA9550-18-1-0199. Последовательности ПНА были щедрым подарком от доктора Тумула Шриваставы из Trucode Gene Repair, Inc. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Эрика Уинфри и д-ра Ризала Хариади за их полезные беседы по коду инструментария DNA Design MATLAB. Мы также хотели бы поблагодарить Джозефа Сухана, Мару Салливан и Центр биологической визуализации за помощь в сборе данных TEM.

1. Конструкция последовательности ЗПНА
<ol><li>Загрузите dna Design Toolbox22, разработанный лабораторией Уинфри в Caltech23, в папку, содержащую сценарии программирования для проектирования последовательностей.</li>
	<li>В этой папке дизайна последовательности откройте язык п?...

<ol>
	<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-crossover+molecules.">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li><li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals.">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li><li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron.">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra.">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li><li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., H&#246;gberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes.">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes.">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space.">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li><li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mix-and-match+nanobiosensor+design:+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures.">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).</li><li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA.">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li><li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies.">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li><li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization.">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).</li><li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents.">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).</li><li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures.">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li><li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions.">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li><li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids.">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930 (2017).</li><li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes.">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li><li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+DNA+tube+circumferences.">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles.">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li><li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized,+(R)-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility.">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li><li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design.">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li><li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents.">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li><li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents.">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li><li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis:+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences.">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247 (2007).</li></ol>

Эта статья посвящена адаптации и улучшению существующих протоколов нанотехнологий нуклеиновой кислоты к органическим растворителям. Описанные здесь методы сосредоточены на модификациях и устранении неполадок в определенном экспериментальном пространстве отдельных полярных аэрот...

Успешное строительство многочисленных сложныхнаноструктур 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 в аквеозных или существенно увлажненых средствах массовой информации, сделанных с использованием Естественные нуклеиновые кислоты,такие как ДНК 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 и РНК11,12 были показаны в предыдущих работах. Однако естественные нуклеиновые кислоты претерпевает дуплексные аформатические изменения или снижают тепловые стабилности ворганических растворителях 13,14.
Ранее наша лаборатория сообщила о методе строительства 3-спиральных нановофилов с использованием гамма-позиции модифицированных синтетических нуклеиновой кислоты, имитирующих гамма-пептидные нуклеиновые кислоты(ЗПНА) 15 (рисунок 1A). Необходимость такого развития и потенциального применения синтетической нуклеиновой кислоты имитировать ПНА была обсужденав поле 16,17. Мы показали, через адаптацию одной нити плитки (SST) стратегии, представленнойдля ДНК наноструктур 18,19,20, что 9 последовательно различных олигомеры ПНА могут быть разработаны для формирования 3-спирали нановонфиль в некоторых полярных априотических органических растворителей смесей, таких как DMSO и DMF. Олигомеры КПНА были коммерчески заказаны с модификациями (R)-дитиленгликоль (мини-ПЕГ) на трех γ позициях (1, 4 и 8 базовых позиций) вдоль каждого 12-базового олигомера на основе методов, опубликованных Саху и др. 21 Эти гамма-модификации вызывают гелиную доорганизации, которая связана с более высокой связывающей сродством и тепловой устойчивостью ЗПНА по отношению к неизмененной ПНА.
Эта статья является адаптацией нашей работы, в которой мы исследуем влияние растворителя раствора и замены с ДНК на формирование наноструктур на основеПНА 15. Целью данной статьи является предоставление подробных описаний конструкции, а также подробные протоколы для растворителя адаптированных методов, которые были разработаны для самосвалки и характеристики нановофиберы . Таким образом, мы впервые представляем модульную стратегию SST, общую платформу для проектирования наноструктур с использованием синтетической нуклеиновой кислоты, имитирующих PNA.
Helical шаг для PNA дуплексов, как сообщается, 18 баз в свою очередь, по сравнению с дуплексами ДНК, которые проходят один поворот на 10,5 баз (Рисунок 1B). Таким образом, длина домена продемонстрированные SSTs ЗПНА была установлена на 6 основаниях для размещения одной трети полного поворота или 120 "вращения, чтобы обеспечить взаимодействие между тремя треугольно массивными геликами. Кроме того, в отличие от предыдущих мотивов SST, каждый SST содержит всего 2 домена, эффективно создавая 1-мерную ленту, как структура, которая обертывания, чтобы сформировать три спирали расслоение (Рисунок 1C). Каждый 12-базовый олигомер PNA изменяется на 1, 4 и 8 позициях, чтобы обеспечить равномерное распределение мини-PEG групп по всему мотиву SST. Кроме того, в мотиве, Есть два типа олигомеров: "смежные" нити, которые существуют на одной спирали и спирали охватывающих "кроссовер" нити (Рисунок 1D). Кроме того, олигомеры P8 и P6 помечены флуоресцентными Cy3 (зеленая звезда) и биотином (желтыйовал), соответственно (рисунок 1D), чтобы обеспечить обнаружение формирования структуры с помощью флуоресцентной микроскопии. В общей сложности, SST мотив состоит из 9 всего олигомеров, чтобы образование 3-спирали нановонфиберы через запрограммированную взаимодополняемость каждого отдельного домена к соответствующему домену на соседнем олигомере (Рисунок 1E).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#947;PNA strands/oligomers</td>
			<td>Trucode Gene Repair Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Varian Cary 300</td>
			<td>Section 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Starna</td>
			<td>29-Q-10</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>C1000 touch</td>
			<td>Section 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-304</td>
			<td>Section 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMF</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-DX1727-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX1457-6</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous 1,4-Dioxane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615121000</td>
			<td>Section 4.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75800-994</td>
			<td>Section 3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-399</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-126</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Collodion in Amyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200001-180</td>
			<td>Section 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Section 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Section 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>189730</td>
			<td>Section 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>Section 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Internal Reflection Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Ti2-E</td>
			<td>Section 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Joel</td>
			<td>JEM 1011</td>
			<td>Section 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N5AC-PO</td>
			<td>Section 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Section 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1701-F</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1829</td>
			<td>Section 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligomers/strands</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Section 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-860</td>
			<td>Section 8.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids into complex nanostructures in organic solvent mixtures

Современные стратегии в области нанотехнологий ДНК и РНК позволяют самостоятельно саблировать различные наноструктуры нуклеиновой кислоты в аквеозных или существенно увлажненых средствах массовой информации. В этой статье мы описываем подробные протоколы, которые позволяют строительство архитектуры нановофиберы в органических растворителей смесей через самостоятельной сборки однозначно адресной, одной нити, гамма-модифицированной пептидной нуклеиновой кислоты (КПНА) плитки. Каждая однотяговая плитка (SST) является 12-базовым олигомером, состоящим из двух конкатенатных модульных доменов по 6 оснований каждая. Каждый домен может связываться с взаимно бесплатным доменом, присутствующим на соседних нитей, используя запрограммированную взаимодополняемость для формирования нанов, которые могут вырасти до микрон в длину. Мотив SST состоит из 9 полных олигомеров, позволяющих сформировать 3-спиральные нановофиберы. В отличие от аналогичных наноструктур ДНК, которые образуют структуры диаметра-монодисперса, эти системы ЗПНА образуют нановофиберы, которые склеивать по ширине во время самосвала в органических растворителях. Протоколы самосъемки, описанные здесь, включают также обычный сурфактант, Сульфат додекила натрия (SDS), чтобы уменьшить эффекты комплектации.

Протоколы, обсуждаемые в вышеуказанных разделах, описывают дизайн адаптированного мотива SST из нановофибер ДНК для надежного поколения самосборных структур нановофибер с использованием нескольких, отчетливых олигомеров. В этом разделе описывается толкование данных, полученных в рез...

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures at JoVE.com

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

В данной статье приводятся протоколы проектирования и самосверки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептидной нуклеиновой кислоты в органических растворителях.

Самосвечение гамма-модифицированных пептидных нуклеиновых кислот в сложные наноструктуры в органических растворителях

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Этот новый протокол описывает использование нескольких различных последовательностей синтетической нуклеиновой кислоты имитировать гамма PNA для формирования наноструктур в конкретных органических смесей растворителя. Описанные здесь анализы свидетельствуют о необходимости адаптации существующих протоколов нуклеиновой кислоты к органическим растворителям, в которых практически не было опубликовано протоколов. Практикующим, новым для этого метода, может быть трудно адаптировать существующие протоколы, разработанные для богатых aqueous сред в органических богатых растворителями средах из-за склонности наноматериалов PNA к агрегировать.Начните с подготовки гамма PNA запасов. После получения HPLC класса очищенных гамма PNA нитей от коммерческого производителя, повторно каждую прядь в деионизированной воде до 300 микромоляных концентраций. Храните гамма-ПНА при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.Когда готовы к самостоятельной сборке, подготовить аннеальные образцы партии в 75%DMSO, 75%DMF, и 40%1, 4-диоксан. Во-первых, подготовить 20 микромоляных подстоков каждого олигомера путем алицитирования 0,67 микролитров из основного запаса и добавления деионизированной воды для конечного объема в 10 микролитров. Добавьте один микролитр каждого олигомера из 20 микромоляных подстоков в 200 микролитров ПЦР-трубки, которые будут иметь общий объем в девять микролитров для девяти олигомеров.Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO или DMF с дополнительным одним микролитером деионизированной воды для конечного объема 40 микролитров. Для приготовления 40%1, 4-диоксана партии, добавить 16 микролитров 1, 4-диоксан и довести объем до 40 микролитров с деионизированной водой. Аннеал образцы в течение 22,5 часов в тепловой циклер охлаждения от 90 до 20 градусов по Цельсию.Как правило, температуры плавления, полученные для двух олигомеров и трех олигомерных гамма-подмножего PNA, находятся в диапазоне от 40 до 70 градусов по Цельсию при различных условиях растворителя. Запрограммировать тепловой циклер в соответствии с рукописными указаниями. После того, как annealing завершена, образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов до характеристики.Сделайте камеру влажности из пустой коробки советы пипетки, заполнив коробку с примерно пятью миллилитров воды. Подготовка 20-кратное разбавление коммерчески доступных 2%collodion в ацетате амила с растворителем изоамил ацетата для создания раствора нитроцеллюлозы. Используйте пинцет, чтобы окунуть крышку в раствор нитроцеллюлозы и позволить ему высохнуть в воздухе, а затем сделать камеру потока из микроскопа слайд, две двусторонние ленточных полос, и нитроцеллюлозы покрытием крышки.Подготовьте раствор биотина BSA, взвесив один миллиграмм биотина BSA и растворив его в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров биотина BSA в канал потока под углом и инкубировать его в течение двух-четырех минут при комнатной температуре во влажной камере. Удар 15 микролитров буфера мытья, который состоит из одного миллиграмма BSA в один миллилитр PBS, в канал, чтобы смыть избыток биотина BSA, а затем пассивировать поверхность путем инкубации канала потока в течение двух-четырех минут во влажной камере.Измерьте 0,5 миллиграмма стрептавидина и один миллиграмм BSA, затем растворите оба в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров раствора стрептавидина в канал потока и поместите его в увлажненной камере в течение двух-четырех минут и мыть канал, вытекающих 15 микролитров мыть буфера. Далее, поток 15 микролитров аннулированной партии гамма PNA олигомеров во влажной камере, а затем мыть несырь наноструктур, вытекающих 15 микролитров одного миллимолярный Trolox в том же составе растворителя, как наноструктуры.Перенесите канал потока на держатель слайда и извещаете его с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного изображением TIRF, целью погружения в масло 60X и 1,5-х magnifier. Сканирование канала потока на 60 или 90X увеличение при мониторинге канала Cy3. Подготовьте 20 и 6%SDS запасов в соответствии с рукописными указаниями, а затем аннеал гамма PNA олигомеры, добавив один микролитр из каждых 20 микромолейных олигомеров в 200 микролитров ПЦР трубки.Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO и один микролитр 6%или 20% SDS в трубки ПЦР для конечного объема 40 микролитров, что приведет к окончательной концентрации SDS 5,25 или 17,5 миллимолейра соответственно. Аннеал гамма-ПНА в термоциклере, как описано ранее. Характеризуйте гамма-наноструктуры PNA в присутствии SDS с помощью протокола TIRF или TEM.TIRF изображения гамма PNA олигомеры annealed в 75%DMSO показали хорошо организованные архитектуры в то время как annealing в 75%DMF привело к пряной формы или иглы, как наноструктуры. Состояние 40%1, 4-диоксана произвело редкое украшение нитей наноструктур. Кроме того, образцы гамма-нанотрубок PNA, образованные в 75% DMSO, продемонстрировали комплектацию нановофибер при высоком увеличении или наноскопических разрешениях во время визуализации TEM.Количественный анализ ширины наноструктур показал медианную ширину 16,3 нанометров с максимальными значениями за 80 нанометров. Isosequential ДНК олигомеры, которые заменили смежных гамма-ПНА формируется прямой нити структур в то время как замена кроссовер гамма-ПНА привести к stellate структур. Наноструктуры, которые были заменены смежными олигомерами ДНК, имели среднюю ширину около 19 нанометров.При высоких концентрациях SDS, гамма PNA нановобры также принять высоко сетевой морфологии по сравнению с его критических концентраций micelle при просмотре с TIRF изображений. TEM изображения показывают, что гамма PNA сборки в 5,25 миллимоляров SDS имеет наиболее существенное сокращение структурных комплектации. При попытке этого протокола, важно помнить, чтобы сохранить состав растворителя, как уже упоминалось из-за склонности наноструктур к агрегировать.Эти методы побуждают практикующих преследовать другие неизведанные пути различных растворителей, сурфактантов и других наноструктур ДНК PNA.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Режиссер Сотовая самосборки для изготовления Cell-Производные Кольца тканей для биомеханического анализа и тканевая инженерия

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Твердофазные Submonomer Синтез Peptoid полимеров и их самосборки в Высоко-упорядоченные нанолистов

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

On-чип изотахофореза для разделения ионов и очистки нуклеиновых кислот

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Continuously-stirred Anaerobic Digester to Convert Organic Wastes into Biogas: System Setup and Basic Operation

Непрерывно перемешивают Анаэробные Digester Преобразование органических отходов в биогаз: настройки системы и основные операции

Anaerobic digestion (AD) is a bioprocess that is commonly used to convert complex organic wastes into a useful biogas with methane as the energy carrier ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Инъекций и медикаментов загружены Супрамолекулярная Гидрогель для местного катетера для инъекций в сердце свиньи

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Влажные химии и пептидный иммобилизации на политетрафторэтилена для улучшенного клеточной адгезии

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Изготовлении разложению Thermoresponsive гидрогелей на различных масштабах длины через реактивной экструзии, микрофлюидика, самостоятельной сборки и Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...